Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bruke Chick Embryo Brain som en modell for in vivo og ex vivo analyser av human glioblastomcelleadferd

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65199

Summary

Chick embryoer brukes til å studere human glioblastom (GBM) hjernesvulster i ovo og i ex vivo hjerne skive co-kulturer. GBM-celleoppførsel kan registreres ved time-lapse-mikroskopi i ex vivo-kokulturer, og begge preparatene kan analyseres ved det eksperimentelle endepunktet ved detaljert 3D-konfokalanalyse.

Abstract

Kyllingembryoet har vært et ideelt modellsystem for studier av virveldyrutvikling, spesielt for eksperimentelle manipulasjoner. Bruk av kyllingembryoet har blitt utvidet for å studere dannelsen av humant glioblastom (GBM) hjernesvulster in vivo og invasiviteten av tumorceller i omkringliggende hjernevev. GBM-svulster kan dannes ved injeksjon av en suspensjon av fluorescerende merkede celler i E5 midbrain (optisk tektum) ventrikkel i ovo.

Avhengig av GBM-cellene, dannes kompakte svulster tilfeldig i ventrikkelen og i hjerneveggen, og grupper av celler invaderer hjerneveggvevet. Tykke vevssnitt (350 μm) av fast E15-tekta med svulster kan immunfarges for å avsløre at invaderende celler ofte migrerer langs blodkar når de analyseres ved 3D-rekonstruksjon av konfokale z-stack-bilder. Levende E15 midthjerne- og forhjerneskiver (250-350 μm) kan dyrkes på membraninnsatser, hvor fluorescerende merkede GBM-celler kan innføres på ikke-tilfeldige steder for å gi ex vivo-samkulturer for å analysere celleinvasjon, som også kan forekomme langs blodkar, over en periode på ca. 1 uke. Disse ex vivo-kokulturene kan overvåkes ved bredfelt- eller konfokal fluorescens time-lapse-mikroskopi for å observere levende celleadferd.

Samdyrkede skiver kan da fikses, immunfarges og analyseres ved konfokalmikroskopi for å avgjøre om invasjonen skjedde langs blodkar eller aksoner. I tillegg kan samkultursystemet brukes til å undersøke potensielle celle-celle-interaksjoner ved å plassere aggregater av forskjellige celletyper og farger på forskjellige nøyaktige steder og observere cellebevegelser. Medikamentelle behandlinger kan utføres på ex vivo kulturer, mens disse behandlingene ikke er kompatible med in ovo systemet. Disse to komplementære tilnærmingene tillater detaljerte og presise analyser av menneskelig GBM-celleadferd og tumordannelse i et svært manipulerbart virveldyrhjernemiljø.

Introduction

In vitro-studier av kreftcelleatferd brukes ofte til å dissekere potensielle mekanismer som opererer under den mer komplekse oppførselen som observeres under tumordannelse og celleinvasjon i in vivo xenograft-modeller. For eksempel, med glioblastom (GBM), har in vitro-studier avdekket mekanismer for hvordan L1CAM potensielt opererer under tumordannelse og hjerneinvasjon i en ny kyllingembryo xenograft hjernesvulst modell 1,2,3,4,5. Selv om in vitro- og in vivo-eksperimenter utfyller hverandre på nyttige måter, etterlater de et betydelig gap i hvordan resultatene kan korreleres. For eksempel er mekanistiske analyser av GBM-cellemotilitet på en tallerken en svært kunstig situasjon, og in vivo xenograft-modeller kan bare avsløre statiske tidspunkt- eller endepunktsanalyser av tumordannelse og celleatferd. In vivo-studier med enten gnagere eller kyllingembryoer egner seg ikke lett til å overvåke celleadferd mens cellene invaderer hjernevev i disse xenograftmodellene. Likevel har chick embryo xenograft-modellen vist at adhesjonsproteinet L1CAM spiller en stimulerende rolle i den invasive evnen til humane T98G GBM-celler 2,5.

En passende løsning på dette problemet kan oppnås ved å bygge bro mellom både in vivo og in vitro-metoder ved hjelp av en organotypisk hjerneskivekulturmodell, referert til som en ex vivo-modell. I denne ex vivo-modellen kan levende hjernevev opprettholdes i en tykkelse på flere hundre mikron i opptil noen uker, noe som gjør det mulig å implantere kreftceller, observere deres oppførsel i faktisk vev over tid, og deretter utføre en mer detaljert markøranalyse ved eksperimentets sluttpunkt.

En populær organisk skivekulturmetode har vært å dyrke en flere hundre mikron tykk hjerneskive på toppen av en gjennomsiktig eller gjennomsiktig porøs membran, slik at vevet blir utsatt for luft, men likevel tillater næringsmedier å opprettholde vevet fra under membranen (se Stoppini et al.6). Ulike varianter av denne metoden har blitt brukt til forskjellige studier, inkludert bruk av forskjellige medier eller forskjellige membraninnsatser. Ulike membraninnsatser inkluderer en 30 mm diameter, porøs (0,4 μm) membraninnsats i en 35 mm kulturskål 6 og cellekulturinnsatser (0,4 μm) for 6-brønnsplater7. Ulike medier inkluderer 50 % MEM/HEPES + 25 % varmeinaktivert hesteserum + 25 % Hanks balansert saltløsning (HBSS)8, 50 % redusert serummedium + 25 % hesteserum + 25 % HBSS9, samt andre. Hvis en gjennomsiktig eller gjennomsiktig membran brukes sammen med fluorescerende merkede GBM-celler, kan slike kulturer avbildes nedenfra ved hjelp av et omvendt bredfelt eller konfokalfluorescensmikroskop 10,11,12,13,14,15.

Mens mange in vivo ortotopiske hjernesvulst xenograft og ex vivo organotypiske hjerneskivekulturmodeller har blitt etablert ved bruk av gnagere, som nevnt ovenfor, har kyllingembryoet (Gallus gallus) blitt underutnyttet til disse formålene. Imidlertid har kyllingembryoet vist seg å være i stand til å bli brukt som en in vivo ortotopisk xenograftmodell for studier av både human og rotte glioma invasjon 1,2,5. Xenografted celler i kyllingembryohjerner har vist invasjonsmønstre som ligner de som er observert i gnagermodeller, noe som ytterligere støtter bruken av kyllingembryoer som en in vivo-modell for GBM-tumorcelleanalyse. Chick embryoer er også billige, kan lettere vedlikeholdes enn gnagere (dvs. i eggeskallene i en laboratorieinkubator), og er mye lettere å jobbe med, noe som gjør dem til et attraktivt alternativ for kortsiktige in vivo GBM-studier. En nylig artikkel har beskrevet bruken av kyllingembryohjerneskivekulturer for dannelse og vekst av aksoner under normal hjerneutvikling der skivene var levedyktige i minst 7 dager16. Imidlertid mangler bruken av slike kyllingembryohjerneskivekulturer for ex vivo-analyse av GBM-celleadferd i et vevsmiljø. I denne artikkelen beskrives både transplantasjon av humane GBM-celler og GBM-stamceller (GSC) i den tidlige kyllingembryohjernen in vivo, samt innføring av GBM-celler på levende kyllingembryohjerneskivekulturer ex vivo. Noen representative eksempler på de resulterende svulster og celleinvasjonsmønstre oppnådd fra disse preparatene er også gitt.

Protocol

Ingen klarering eller godkjenning var nødvendig ved University of Delaware for å utføre dette arbeidet.

1. GBM-celleinjeksjon i chick optisk tektum

  1. Fremstilling av GSC og GBM celler til injeksjon
    1. Kultur GSCs i GSC media (tabell 1). Dyrkning etablerte GBM-cellelinjer i GBM-medier (tabell 1).
    2. Skyll cellene på plater med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) og legg 1 ml trypsinoppløsning i en 10 cm tallerken. La i en cellekulturinkubator i 2-3 minutter til cellene begynner å løsne.
    3. Deaktiver trypsinet ved å tilsette 10 ml egnet serumholdig kulturmedium i 10 cm-fatet og løsne cellene ved å pipettere opp og ned. Plasser cellesuspensjonen i et 15 ml konisk sentrifugerør.
    4. Pellet cellene ved sentrifugering ved 800 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Aspirer mediet fra cellepelleten ved hjelp av en fin engangsglasspipette festet til en sidearmskolbe og vakuumpumpe. Resuspender cellene i passende vekstmedier til en konsentrasjon på 10.000 celler per mikroliter og legg i et mikrofugerør eller et lite skruetopprør på is.
    6. Bland cellene med en liten mengde sterilt 1% Fast Green FCF-fargestoff (bruk et forhold på 5 μL fargestoff / 100 μL cellesuspensjon).
  2. Injeksjon av GBM-celler i E5 optisk tektum i ovo. Se tilleggsfigur 1.
    1. Inkuber de befruktede kyllingeggene i en fuktet egginkubator, med den spisse enden vendt nedover, ved 37,5 ° C ( den første dagen av inkubasjon er embryonal dag 0 [E0]). På den 6. dagen av inkubasjon (E5), steriliser eggeskallet ved sprøyting med 70% etanol.
    2. Bruk en egglyser, spor langs omkretsen av luftrommet over embryoet med en blyant og dekk det skisserte området med gjennomsiktig tape.
    3. Bruk buet saks, kutt forsiktig rundt det sporede området, vær forsiktig så du ikke kutter i embryonale membraner eller blodkar, og kast toppen av eggeskallet.
    4. Plasser noen dråper saltvann eller cellekulturmedier på luftromsmembranen for å fukte den slik at den lett løsner. Bruk fine tang, stikk forsiktig luftromsmembranen over toppen av embryoet, fjern den og finn kyllingembryoets hode.
    5. Bruk fine tang for å ta tak i den gjennomsiktige amnionmembranen som umiddelbart omgir embryoet for å plassere hodet slik at optisk tektum kan injiseres med celler. Bruk den fine tangen med én hånd til å holde på amnionen for å holde hodet på plass under injeksjonsprosessen. Vær forsiktig så du ikke skader de ekstraembryonale blodkarene i chorioallantoic membranen på eggeplommen.
      MERK: Prosedyren ovenfor krever litt øvelse for å effektivt kunne ta tak i den klare amnionmembranen som omgir embryoet, siden det er usynlig til det gripes og trekkes. Øv deg på å bruke fin tang for å ta tak i det klare amnionet som umiddelbart omgir embryoet.
    6. Hold hodet stødig ved å gripe amnionmembranen med fine tang. Bruk en glassmikropipette og en pneumatisk picopumpe til å injisere ca. 50 000 celler i 5 μL egnede cellekulturmedier i optisk tektum (5 μL er ca. 1/2 av en fylt mikropipette).
      MERK: Se Cretu et al.1 for et bilde av et E5-embryo som har blitt injisert med GBM-celler blandet med fargestoff.
    7. Legg noen dråper 50 mg / ml ampicillin på toppen av embryoet.
    8. Dekk hullet i toppen av eggene med klar tape og la det stå i fukteren til E15 for disseksjon.

2. Disseksjon av hjerneområder fra E15-embryoer

MERK: Disseksjonen av E15-hjerner her for fiksering ligner den som er beskrevet i trinn 8.2 for levende hjerneskiver, men disseksjonen her trenger ikke å gjøres under aseptiske forhold.

  1. Klipp bort båndet rundt toppen av skallet, slik at du får tilgang til embryoet.
  2. Halshugg embryoet i nakken og legg hodet i en 10 cm tallerken med steril kalsium- og magnesiumfri Tyrodes (CMF Tyrodes) løsning. Se tilleggsfigur 2.
  3. Bruk fin tang, fjern huden som dekker hjernen for å avsløre den underliggende dura materen. Fjern de formende hodeskallebenene på venstre og høyre side av hjernen. De dannende hodeskallebeinene dekker ennå ikke størstedelen av hjernen.
  4. Bruk forsiktig fine spisse tang for å rive gjennom hjernehinnene som ligger over midten av hjernen og skrell den til hver side for å avdekke hjernen.
  5. Bruk buede tang til å øse hjernen nedenfra og trekk den forsiktig ut av hulrommet.
  6. Dissekere hjernen i dens deler: forebrain, tecta, cerebellum.
  7. Fjern den overliggende pia materen fra tecta med fine tang. Legg merke til at pia skiller seg lett fra tecta, men ikke fra forhjernen eller lillehjernen. Fjern pia fra forhjernen ved å berøre den eller rulle den på et lite stykke filterpapir.
  8. Plasser de dissekerte hjernegruppene i en liten tallerken.
  9. Plasser hjernegruppene for fiksering i en 24-brønns platebrønn og fest i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumkakodylatbuffer. La stå i minst 24 timer ved 4 °C.
  10. Etter fiksering, skyll vevet i 3x PBS over minst 1 time før du legger det inn i agar.

3. Embedding og skiver høstede hjernegrupper

  1. Forvarm en løsning på 3,5% agar og 8% sukrose i PBS til smeltet og hold den ved smeltetemperatur.
  2. Bruk buede tang som en scoop, ta forsiktig opp enten optisk tektum eller forhjerneområdet i kyllingembryohjernen, og blott litt på filterpapir for å fjerne ekstra væske for å sikre vedheft av agar til den ytre hjerneoverflaten.
  3. Bruk en steril overføringspipette til å fylle formen med agaroppløsning.
    MERK: En enkel form kan lages ved å danne aluminiumsfolie rundt en passende størrelse objekt, for eksempel små rektangulære metallvibrerende vevskuttblokker.
  4. Plasser hjerneområdet i agar, og la agar størkne helt.
  5. Fjern aluminiumsfolien fra rundt den innebygde hjernen og trim overflødig agar rundt sidene ved hjelp av et barberblad eller skalpell.
  6. Legg en dråpe cyanoakrylat lim på rustfritt stål firkantet av skivebrettet, legg agaroseblokken med hjernen på limet, og la limet binde i 1 min. Plasser brettet i den vibrerende vevskutteren chuck, stram og fyll brettet med nok PBS til å dekke toppen av agarblokken.
  7. Skjær hjerneskivene på en vibrerende vevskutter med en tykkelse på 350 μm ved hjelp av et barberblad av stål.
  8. Når hjerneskiver kuttes og flyter fritt inn i skivebrettet, bruk en slikkepott til å øse opp og fjerne skivene fra brettet. Skyv partiet forsiktig av slikkepotten og inn i en merket 10 cm petriskål med PBS slik at seksjonene flyter fritt.
    MERK: Agaren som omgir hjerneskiven kan løsne hvis hjernen ikke er tilstrekkelig blottet med filterpapir for å fjerne overflødig væske før innebygging. Hvis dette skjer, kan hjernevevet forsiktig fjernes fra størknet agar og re-embedded etter riktig blotting av overflødig væske.

4. Immunostaining hjerneskiver med tumorceller

  1. Ved hjelp av et stereomikroskop utstyrt med epifluorescens, skjerm individuelle skiver i 10 cm-fatet en etter en for tilstedeværelse eller fravær av tumorceller.
  2. Forbered en tilstrekkelig mengde fosfatbufret saltvann med 0,1% Triton X-100 og 5% normalt geiteserum (PBSTG) (se tabell 1) for immunfarging og skyll skivene som skal immunfarges.
  3. Halvfyllingsbrønner i en 24-brønns plate som skal brukes til farging av hjerneseksjoner med PBS.
  4. Trim av hjørnene av agar rundt hjerneskivene med kanten av en spatel eller en skalpell, og legg dem forsiktig inn i brønnene som inneholder PBS.
  5. Aspirer PBS og erstatt med 350 μL primær antistofffargingsløsning i PBSTG (f.eks. 2 μg / ml UJ127 i PBSTG).
  6. Inkuber i 24 timer i et kaldt rom med forsiktig omrøring, slik at skiven sees å bevege seg fritt i brønnen.
  7. Etter 24 timer, fjern den primære antistoffoppløsningen og skyll 3 x 1 time med PBSTG i et kaldt rom med omrøring.
  8. Når du er ferdig med skyllingen, inkuber i 350 μL / brønn av sekundær antistofffargeløsning i PBSTG (f.eks. 1/200 fortynning av biotin-GAM i PBSTG). Inkuber i 20 timer i et kaldt rom med omrøring.
    MERK: Hvis du avstår fra det tertiære trinnet og inkuberer med det fluorokromholdige sekundære antistoffet på dette trinnet, må du dekke til å beskytte mot lys under inkubering nå og deretter hoppe til trinn 4.11.
  9. Fjern den sekundære antistoffoppløsningen og skyll 3 x 1 time i PBSTG i et kaldt rom med omrøring.
  10. Fjern PBSTG og inkuber i tertiær løsning (f.eks. 1:250 fortynning av Alexa Fluor 647 streptavidin i PBSTG). Hvis ønskelig, farg kjernene på dette trinnet ved å tilsette 0,1 μg / ml bisbenzimid til blandingen. Inkuber i 20 timer i et kaldt rom med omrøring.
  11. Fjern den tertiære løsningen og skyll 3 x 1 time i PBSTG i et kaldt rom med omrøring.
  12. La stå i PBS til du er klar til å montere på mikroskoplysbilder.

5. Montering av skiver på lysbilder i mikroskop

  1. Forbered så mange mikroskoplysbilder som det er seksjoner å montere.
  2. For hvert lysbilde, plasser en 50 mm lengde stripe av 10 mil (254 μm) tykk vinyl elektrisk tape på et stykke parafilm.
  3. Bruk en 1 cm x 1 cm firkantet hullstans, slå et hull gjennom midten av det elektriske båndet og parafilmen.
  4. Trekk båndet av parafilmen og legg den på toppen av mikroskoplysbildet, slik at det er plass til merkingstape på lysbildet.
  5. Bruk en mikropipette til å plassere en eller to dråper anti-fade monteringsmedier i det firkantede hullet i midten av det elektriske båndet.
  6. Bruk en buet slikkepott til å løfte den ønskede vibrerende vevskutterseksjonen fra PBSTG og transportere bort fuktighet grundig med en ren laboratorieserviett eller et stykke filterpapir.
  7. Berør kanten av skiven til monteringsdråpen og bruk en annen slikkepott for å skyve seksjonen forsiktig inn i monteringsmediet.
  8. Dekk seksjonen med noen flere dråper monteringsmiddel og legg forsiktig en 24 mm x 30 mm (# 1.5 tykkelse) deksel på toppen av seksjonen og monteringsmiddelet.
  9. Forsegl kantene på dekselet med neglelakk for å holde det på plass.

6. Konfokalmikroskopi av faste hjerneskiver

  1. Bruk bredfeltfluorescens for å finne fluorescerende svulster i den monterte hjerneskiven ved hjelp av riktig objektivlinse og filtersett (er).
    MERK: Noen svulster kan være ganske store og er lett synlige med 4x-objektivet, mens enkeltceller kan kreve 10x-objektivet.
  2. Bytt til konfokalmikroskopi ved hjelp av en passende objektivlinse, laser (er), pinhole størrelse og detektorinnstillinger. For å følge denne protokollen, bruk et 20x-objektiv (numerisk blenderåpning [N.A.] = 0,75) for rutinemessig avbildning og et 60x oljemål (N.A. = 1.40) for høyoppløselig avbildning.
  3. Sett øvre og nedre grenser for z-aksen og trinnstørrelsen (for den spesifikke situasjonen i henhold til konfokalmikroskopets instruksjoner) for å anskaffe optiske seksjoner. Skaff deg en z-stabel med optiske seksjoner.
  4. Bruk konfokalmikroskopprogramvaren til å lage en 3D-volumgjengivelse av svulsten, i henhold til produsentens instruksjoner.

7. Sfærisk forberedelse

  1. Opprette poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (poly-HEMA) plater
    1. Lag en oppløsning av 10 μg / ml poly-HEMA i 95% etanol, og belegg 35 mm petriskåler (eller cellekulturretter) med 1 ml av denne løsningen.
    2. La oppvasken stå på en vippe uten lokk over natten ved romtemperatur for å utvikle et belegg av oppvaskoverflaten.
      MERK: Løsningsmidlet vil fordampe og etterlate et gjennomsiktig belegg på fatet, noe som kan virke ujevnt, men dette vil ikke påvirke evnen til å lage cellesfæroider.
    3. Etter tørking, steriliser de åpne tallerkenene under UV-lys i et biosikkerhetsskap i 1 time. Sett på lokkene etter sterilisering. De belagte rettene er nå klare til bruk.
  2. Fluorescerende DiD-farging for time-lapse-mikroskopi
    MERK: Denne delen er for farging av enkeltceller med DiD-fluorescerende fargestoff som skal brukes til å lage sfæroider, noe som optimaliserer visualisering av cellemotilitet for levende time-lapse-avbildning.
    1. Suspendere cellene i et serumfritt kulturmedium.
    2. Tilsett 5 μL DiD-stam/ml cellesuspensjon og bland forsiktig med pipettering. Inkuber i 20 minutter ved 37 °C.
    3. Sentrifuger den merkede cellesuspensjonen ved 800 × g ved 5 °C i 5 minutter.
    4. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i varme medier for å skylle.
    5. Gjenta denne sentrifugeringen og skyll trinnet to ganger til.
      MERK: Hvis ønskelig, hopp til trinn 7.3.6 for å lage sfæroider umiddelbart etter denne prosessen.
  3. Å lage celle sfæroider
    1. Varm opp 0,25 % trypsin/etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløsning til 37 °C.
    2. Dyrkning GSC i GSC media17 (tabell 1) og U-118 maligne gloima (MG) celler i U-118 kulturmedium (se tabell 1). Bruk en konfluent 10 cm tallerken til fremstilling av en 35 mm tallerken med sfæroider. Legg til bFGF (10 ng / ml endelig konsentrasjon) og TGF-α (20 ng / ml endelig konsentrasjon) vekstfaktorer til GSC først og deretter hver 3. dag.
      MERK: Cellene som ble brukt i den nåværende studien var grønn GSC15-2 / K72, grønn GSC16-4 / K72, rød U-118 / L1LE / mCherry2x og rød U-118/1879 / mCherry2x. En plate med sfæroider bør være tilstrekkelig for to 6-brønnsplater av hjerneskiver på membraninnsatser.
    3. Skyll cellene på platene med steril PBS og legg 1 ml trypsinoppløsning på en 10 cm tallerken. Plasser i cellekulturinkubatoren i 2-3 minutter til cellene begynner å løsne.
    4. Deaktiver trypsinet ved å tilsette 10 ml egnet serumholdig kulturmedium i 10 cm-fatet og løsne cellene ved å pipettere opp og ned. Plasser cellesuspensjonen i et 15 ml konisk sentrifugerør.
    5. Pellet cellene ved sentrifugering ved 800 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Aspirer mediet fra cellepelleten og resuspender cellene i 10 ml medier.
    7. Plasser 2 ml cellesuspensjon på hver 35 mm poly-HEMA-belagte tallerken og tilsett 2 ml mer passende medier for å oppnå 4 ml totalt medieinnhold per tallerken. Hvis du bruker GSC, legg til vekstfaktorer.
    8. Inkubere cellene i en celleinkubator til aggregatene når en størrelse på 100-200 μm, som kan være 1-2 dager, avhengig av tettheten av cellene som ble belagt.

8. Levende kyllingembryo hjerne disseksjon og vibrerende vev slicer skiver

  1. Forberedelse til disseksjon
    1. Klargjør en 6-brønns polyestermembraninnsatsplate med 1 ml hjerneskivekulturmedium (se tabell 1) under membraninnsatsen.
    2. Steriliser arbeidsområdet og verktøyene med 70% etanol.
    3. Plasser 6-brønns innsatsplaten på is mens disseksjonen pågår.
    4. Klargjør 100 ml vibrerende vevskuttemedier (tabell 1) og legg på is.
    5. Plasser et hetteglass med 4 % agarose med lav smelte i PBS i et vannbad til det smelter til en væske (ca. 50 °C).
    6. Fyll opp det vibrerende vevskuttkaret med is.
  2. Aseptisk E14/15 kyllingembryo hjernedisseksjon
    1. Bruk et eggelys, spor langs omkretsen av luftlommen over E14- eller E15-embryoet med en blyant og dekk det skisserte området med gjennomsiktig tape.
    2. Bruk buet eller fin saks, kutt forsiktig rundt det sporede området, vær forsiktig så du ikke kutter inn i embryomembranen eller blodkarene, og kast det øverste stykket av skallet.
    3. Bruk buede tang, fjern luftromsmembranen over toppen av embryoet og finn kyllingembryoets hode.
    4. Decapitate embryoet og legg hodet i en 10 cm tallerken med kald steril CMF-løsning. Se tilleggsfigur 2.
    5. Bruk steril fin tang, fjern huden som dekker hjernen for å avsløre den underliggende dura materen. Fjern de formende hodeskallebenene på venstre og høyre side av hjernen. De dannende hodeskallebeinene dekker ennå ikke størstedelen av hjernen.
    6. Bruk forsiktig fine spisse tang (# 5 eller # 55) for å rive gjennom hjernehinnene som ligger over sentrum av hjernen og skrelle den til hver side for å avdekke hjernen.
    7. Bruk fine buede tang, øs hjernen opp fra bunnen foran og trekk den forsiktig ut av hulrommet.
    8. Dissekere hjernen i sine tre hoveddeler: forebrain, midbrain (optisk tecta), cerebellum. Rådfør deg med et atlas over kyllingutvikling, om nødvendig.
    9. Fjern den overliggende pia materen fra tecta med fine tang.
      MERK: Pia skiller seg lett fra tekta, men ikke fra forhjernen eller lillehjernen. Pia kan fjernes fra forhjernen ved å berøre den eller rulle den på sterilt gasbind.
    10. Legg de dissekerte hjernegruppene i en liten steril tallerken på is.
  3. Innebygging og kutting av hjernen
    1. Bruk buede tang som en scoop, ta forsiktig opp enten optisk tektum eller forhjerneområdet og blott litt på sterilt gasbind for å fjerne ekstra væske for å sikre vedheft av agarose til ytre hjerneoverflate.
    2. Bruk en steril overføringspipette til å fylle formen med lavsmeltet agarose. Forbered en enkel form ved å danne aluminiumsfolie rundt en gjenstand av passende størrelse. Den lille rektangulære metallvibrerende vevskutteblokken brukes rutinemessig som objekt. Se tilleggsfigur 3.
    3. Plasser hjerneområdet raskt i agarose og la det stivne (ca. 4-5 min) på is.
      MERK: Hjernen kan synke til bunnen av formen før agarose stivner. Hvis dette skjer, vent 1 min for å la agar begynne å stivne, og plasser deretter hjerneområdet i agarose. Prøv å suspendere hjerneområdet direkte i midten av agarose.
    4. Fjern aluminiumsfolien fra rundt den innebygde hjernen i størknet agarose og trim overflødig agarose rundt sidene ved hjelp av et sterilt barberblad eller skalpell.
    5. Legg en dråpe cyanoakrylat lim på rustfritt stål firkant av skiver tallerken / skuffen, plasser agaroseblokken med hjernen, og la limet binde i 1 min. Plasser tallerkenen/brettet i den vibrerende vevskutteren chuck, stram og fyll brettet med skivemedier for å dekke toppen av agaroseblokken.
    6. Skjær seksjonene på en vibrerende vevskutter ved 250-350 μm ved hjelp av en safirkniv, som har blitt rapportert å resultere i mindre levende vevskader enn et stålblad.
    7. Når hjerneskiver kuttes og flyter fritt inn i skivebrettet, bruk en steril slikkepott til å øse opp og fjerne skiven fra brettet. Skyv forsiktig delen av slikkepotten og på en membraninnsats ved hjelp av en annen steril slikkepott.
      MERK: Normalt kan to eller tre hjerneskiver plasseres på hver membraninnsats, om ønskelig. Agarose som omgir hjernen skive kan bli løsrevet hvis hjernen ikke er tilstrekkelig blottet med sterilt gasbind for å fjerne overflødig væske. Hvis dette fortsatt skjer etter tilstrekkelig blotting før embedding, ta forsiktig opp skiven uten den omkringliggende agarose og skyv den på membraninnsatsen.
    8. Plasser 6-brønnsplaten av hjerneskiver på membraninnsatser i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
    9. Dagen etter plettering, bruk en steril Pasteur-pipette for å aspirere mediet fra under innsatsen (det er hull i sidene av innsatsene slik at en pipette får tilgang til mediet nedenfor). Tilsett 1 ml ferske skivemedier til hver brønn under membraninnsatsen. Fortsett å bytte media annenhver dag etterpå.
    10. Vent noen dager til hjerneskivene fester seg godt til membraninnsatsene og ser ut til å flate noe ut. Dette er et tegn på at skivene er levedyktige og klare for innføring av GBM-celler.

9. GBM-celleinnføring på hjerneskiver

  1. Sfæroid metode
    1. Etter at cellesfæroidene har nådd 150-200 μm i størrelse, bruk en 20 μL mikropipette satt til 5 μL for å fjerne en til flere sfæroider fra kulturskålen. Se tilleggsfigur 3.
    2. Fjern mediet forsiktig med sfæroider på ønsket hjerneskive.
      MERK: Cellesfæroidene skal være synlige i pipettespissen. Bruk av en klar pipettespiss vil gjøre dem lettere å se i spissen. Hvis sfæroid faller av hjernen skive når væsken slippes ut, bør en etanol-sterilisert øyenvippe limt til en tynn tre applikator pinne brukes til å forsiktig dytte sfæroid tilbake på hjernen skive.
    3. La sfæroidene dyrke på hjerneskivene i 2-5 dager.
      MERK: Begrensningen her ser ut til å være den endelige nedbrytningen av blodkar og hjerneceller i skiven. Degraderte blodkar vil vises som diskontinuerlige baller i skiven når de farges for laminin.
  2. Biopsi stansemetode
    1. La hjerneskivene feste seg ved å se ut til å flate ut på membraninnsatsen (kan ta 2-5 dager i kultur).
    2. Tine cellematrisen på is.
    3. I cellekulturens biosikkerhetsskap, koble en steril 1 mm diameter biopsistans til et vakuum aspiratorrør.
    4. Berør forsiktig hjerneskiven med biopsi-stansen for å lage et 1 mm hull i midten av hjerneskiven.
      MERK: Vevet i biopsistansen vil bli aspirert inn i stansen av vakuumet.
    5. Forbered en cellematrisesuspensjon ved å trypsinisere en 60% -70% sammenflytende 10 cm tallerken med celler og resuspendere i 10 ml media; Bland deretter 1 ml av den suspensjonen med 100 μL matriks.
    6. Bruk en 20 μL mikropipette til å plassere 1 μL av cellematriseblandingen i hvert hull i hjerneskivene.
    7. Etter at celleblandingsplasseringen er ferdig, plasser parabolen med hjerneskiver med innebygde celler tilbake i inkubatoren, og la matrisen størkne og cellene potensielt invadere det omkringliggende hjernestykket.

10. Widefield fluorescens time-lapse mikroskopi

  1. Plasser avtagbart tape rundt kanten av 6-brønnsplaten for å forhindre fordampning av mediet, og la et lite gap på den ene siden for gassutveksling.
  2. Plasser platene i et tilpasset kulturkammer på et justerbart automatisert stadium på et omvendt epifluorescensmikroskop.
    MERK: Kammeret ble holdt ved atmosfæriske forhold på 5 % CO2 og 95 % luft ved hjelp av en gassinjeksjonsregulator, og temperaturen ble opprettholdt ved 37 °C med en varmlufttemperaturregulator og en temperaturkontrollert sceneinnsats. Se Fotos et al.18 for detaljer om systemet som brukes her.
  3. Ved hjelp av egnet programvare for mikroskopkontroll, lag en time-lapse-oppkjøpsplan som samler fluorescerende bilder av interesseområdene en gang hvert 10. minutt i 20 timer.
    MERK: Hvis en grønn fluorescerende etikett brukes i celler (f.eks. grønt fluorescerende protein [GFP]), bruk deretter den minste mengden blått eksitasjonslys som kreves for å visualisere cellene for å forhindre fototoksisitet. Røde (f.eks. mCherry) og langt røde (f.eks. DiD) etiketter ser ikke ut til å ha dette potensielle problemet på grunn av lengre bølgelengdeeksitasjon.

11. Immunfarging av hjerneskiver etter time-lapse-mikroskopi

MERK: Denne immunfargingsprotokollen er optimalisert for farging av blodkar med laminin og kjerner med bisbenzimid. Bruk passende antistoffer for ønsket molekyl (er) av interesse.

  1. Aspirer mediet fra under membraninnsatsen ved hjelp av en Pasteur-pipette, og plasser 1 ml 2% PFA i 0,1 M natriumkakodylatbuffer under innsatsen og 1 ml på toppen av innsatsen for å dekke hjerneskiven. La skivene feste seg over natten ved 4 °C.
  2. Fjern fikseringsmiddelet fra under membraninnsatsen og eventuelt fikseringsmiddel som er igjen på hjerneskiven (fiksativ har en tendens til å lekke gjennom membraninnsatsen i brønnen under).
  3. Fjern innsatsen med skiver fra 35 mm brønnen og legg dem i en større plastfat.
  4. Prep en 24-brønns plate ved å legge til 350 μL PBS i så mange brønner som det er hjerneskiver (en skive / brønn ved immunfarging).
    1. Bruk en tynn slikkepott til å fjerne agarosen forsiktig fra rundt hjerneskiven uten å løsne hjerneskiven fra membraninnsatsen. Pass på at agarose løsner fra ytterkanten av hjernen skjære lett. Hvis ikke, la agarose festet til hjerneskiven.
    2. Bruk en skarp skalpell, skjær gjennom membranen rundt hjerneskiven til skiven med den underliggende membranen er fri for resten av innsatsen. Plukk opp membranen med det vedlagte hjernestykket, bruk fine tang for å ta tak i membranen, og legg den i en brønn på 24-brønnsplaten i PBS.
  5. Skyll skivene 3x med PBS over 1 time i kjølerommet med konstant forsiktig omrøring eller gynging, slik at skiven beveger seg i brønnen.
  6. Mens du skyller, klargjør den primære antistoffløsningen.
    1. Fortynn anti-laminin til 2 μg/ml i PBSTG (se tabell 1).
  7. Fjern PBS fra brønnene og inkuber over natten i primær antistoffløsning i et kaldt rom med mild omrøring.
  8. Etter minst 20 timers inkubasjon, aspirer den primære antistoffoppløsningen og skyll seksjonene 3x i 1 time i PBSTG.
  9. Mens du skyller, klargjør den sekundære antistoffløsningen.
    1. Fortynn fluorescerende GAM med den spesifikke fluorokromen som trengs for en 1:200 fortynning i PBSTG sammen med en 0,1 μg / ml konsentrasjon av bisbenzimid.
    2. Fjern PBSTG og inkuber over natten i et kaldt rom med omrøring i den fluorescerende sekundære antistoffløsningen.
    3. Fjern det sekundære antistoffet og skyll 2x over 1 time i PBSTG og 1x over 1 time i PBS.
    4. La stå i PBS til du er klar til å montere på mikroskoplysbilder (seksjon 5) og visning.

Representative Results

Presentert her er flere figurer for å vise noen representative resultater som ble oppnådd ved å utføre in vivo-injeksjoner i optisk tektum (figur 1 og figur 2), dyrke levende hjerneskiver og vurdere deres levedyktighet (figur 3), skape ex vivo hjerneskivekulturer og implantere fluorescerende merkede celler ved hjelp av biopsistansemetoden (figur 4), generere cellesfæroider ved å dyrke celler på poly-HEMA (figur 5 ), skape ex vivo hjerneskive-kokulturer med cellesfæroider og registrere den invasive celleatferden ved hjelp av 4D-konfokal timelapsemikroskopi (figur 6), og analysere invasiv celleatferd fra sfæroider i forhold til blodkar i faste hjerneskivepreparater (figur 7 og figur 8). Disse resultatene er på ingen måte uttømmende, men gir gode eksempler på hva man kan få ved å bruke kyllingembryohjernen som xenograftmodell for human GBM-forskning.

Figur 1 viser noen representative resultater av svulster som ble dannet i optisk tektum in vivo etter injeksjon av GSC som uttrykker GFP. GSC fester seg til ventrikkeloverflaten og danner invasive svulster i hjerneveggen. GSC-er bor tydelig i nærheten av blodkar og ser ut til å migrere langs dem. Filmer av roterende 3D-volumgjengivelser av faste og immunfargede skiver av in vivo GSC-svulster er gitt i tilleggsvideo S1, tilleggsvideo S2, tilleggsvideo S3 og tilleggsvideo S4. I dette eksperimentet ble fire farger brukt til å identifisere fem funksjoner (grønne GSC, hvite kjerner, hvite blodkar, blå integrin alfa-6 og enten rød Sox2 eller rød nestin).

Figur 2 viser noen representative resultater av svulster som ble dannet i optisk tektum in vivo etter injeksjon av GSC som uttrykker GFP blandet med U-118/L1LE celler2 som uttrykker mCherry på grunn av retroviral vektortransduksjon. Disse forsøkene viste at da disse svulstene ble dannet fra en blandet cellesuspensjon, skjedde sortering slik at GSC bodde enten i periferien eller sentrum, mens U-118-celler utgjorde enten en indre kjerne eller en ytre cortex, avhengig av den spesifikke GSC-linjen.

Figur 3 viser levedyktighetsresultater av ex vivo hjerneskivekulturer. Etter 1 uke i kultur avslørte fiksering og immunfarging for laminin mange intakte blodkar og ekspresjon av Sox2, som begge ble brukt her for å demonstrere levedyktigheten til hjerneskiven. Dette viste at kyllingembryohjerneskiver kunne dyrkes på membraninnlegg i ca. 2 uker og forbli levedyktige med normalt utseende blodkar og transkripsjonsfaktoruttrykk.

Figur 4 viser resultatene av å introdusere "plugger" av røde U-118/L1LE/mCherry-celler (blandet med matrise) i ex vivo hjerneskiver etter å ha laget hulrom i skivene ved hjelp av biopsi-stansemetoden. U-118-celler invaderte tydelig hjernevevet, noen ganger omfattende, og ofte langs blodkar. Imidlertid var celleinvasjonen ikke ensartet rundt omkretsen av de introduserte cellene. Blodkar virket noen ganger også skadet eller fraværende i visse skiver, antagelig på grunn av det ekstra traumet av stansemetoden eller lengden på tiden i kultur. Dette viste at biopsi punch / cell plug-metoden kunne brukes til å introdusere GBM-celler til bestemte steder i en dyrket ex vivo hjerneskive, hvoretter cellene invaderer hjerneskiven.

Figur 5 viser levende sfæroider i kultur og flere eksempler på bredfeltfluorescens av levende GBM-cellesfæroider introdusert på ex vivo hjerneskiver for time-lapse-eksperimenter. Filmer av celleinvasjon fra sfæroidene inn i hjerneskiven er gitt i tilleggsvideo S5 og tilleggsvideo S6 . Dette viste at cellesfæroider er en annen vellykket metode for å introdusere GBM-celler eller GSC på bestemte steder av et ex vivo hjernestykke, og invasiv celleadferd kan overvåkes ved bredfeltfluorescensmikroskopi, selv om oppløsningen av individuelle celler kan være dårlig.

Figur 6 viser statiske bilder av konfokale time-lapse-eksperimenter av levende GSC16-4/GFP og U-118/L1LE/mCherrycelleinvasjon i hjerneskiver. Konfokale z-stack-bilder ble tatt hvert 10. minutt over en 20-timers periode i et flerpunkts time-lapse-eksperiment. Filmer av celleinvasjon fra sfæroidene til hjerneskiver tatt som konfokale z-stakker over tid presenteres i tilleggsvideo S7, tilleggsvideo S8, tilleggsvideo S9, tilleggsvideo S10 og tilleggsvideo S11. Dette eksperimentet viste at konfokal time-lapse-avbildning var overlegen widefield fluorescens for sporing av individuell celleinvasiv oppførsel. U-118/L1LE-cellene var merkbart mer invasive enn GSC-ene under disse forholdene. Dette er til og med tydelig i de statiske bildene, med GSC-ene plassert mer sentralt og U-118-cellene mer spredt.

Figur 7 viser flere eksempler på ex vivo hjerneskive/sfæroidpreparater, der to forskjellige separat merkede sfæroider (U-118/L1LE/mCherry spheroids og GSC16-4/GFP spheroids) ble plassert på hjerneskiver, dyrket i flere dager, og deretter fikset, immunfarget for laminin og avbildet ved optisk snitting på et konfokalmikroskop. Dette avslørte at begge celletyper invaderte hjernestykket og reiste langs blodårene. Når de forskjellige typer sfæroider var nær nok til å kontakte hverandre, syntes det å være liten, om noen, invasjon av en celletype i sfæroid av den andre celletypen, og sfæroidene forble segregerte.

Figur 8 viser flere eksempler på ex vivo hjerneskive / sfæroidpreparater hvor "blandet celletype" sfæroider generert i kultur ved hjelp av to forskjellige merkede celletyper (U-118 / L1LE / mCherry blandet med GSC16-4 / GFP) ble plassert på hjerneskiver, dyrket i flere dager, og deretter fikset, immunfarget for laminin og avbildet ved optisk seksjonering på et konfokalmikroskop. Dette viste at de røde U-118 / L1LE / mCherry-cellene migrerte ut av sfæroidene og spredte seg mye tydeligere enn de grønne GSC16-4 / GFP-cellene, som hadde en tendens til å forbli i klumper nær sentrum av sfæroidene. I tillegg ble U-118/L1LE/mCherry-celler også farget med DiD slik at de to separate etikettene (mCherry og DiD) kunne sammenlignes direkte i de faste ex vivo-preparatene . DiD-etiketten kunne fortsatt oppdages, selv i enkeltceller som hadde invadert hjerneskiven; Dette var imidlertid som intracellulær puncta.

Figure 1
Figur 1: Svulster ved E15 som følge av injeksjon av GSC i E5 optisk tektum in vivo. GSC-er er grønne på grunn av GFP-uttrykk. GSC15-2-celler vises i panelene A, C og E, og GSC16-4-celler vises i panelene B, D og F. (A) Lavforstørrelsesvisning av optisk tektum med en svulst nær ventrikkelen (V). Sox2-farging er vist i rødt, som flekker de fleste kjernene til OT-celler. (B) Lignende bilde som A, men med GSC16-4-celler som også er farget for nestin i rødt, som kan vises gult eller hvitt i bildet på grunn av fargeblanding og bildeeksponering. OT-kjerner virker hvite på grunn av motfarging med bisbenzimid. (VG Nett) Ulike perspektiver på volumgjengivelser generert fra z-stakker ved hjelp av et 60x oljefordypningsmål. Cellekjerner vises hvite på grunn av bisbenzimidfarging, og noen vises røde i panel C og E på grunn av immunfarging for Sox2. Rødfarging i panel D og F er fra farging for nestin. Merk at på grunn av "Alpha Blending" for volumgjengivelser i konfokalmikroskopprogramvaren, blandes ikke farger som de ville bruke en maksimal intensitetsprojeksjon, og den mest utbredte fargen dominerer og skjuler den mindre intense fargen. Blodkar er farget hvitt på grunn av immunfarging for laminin. GSC-markørintegrin alfa-6-farging vises i blått og vises som punktert på GSC-overflater. Mikronskalaer vises langs kantene på volumgjengivelsene. Videoer av rotasjoner av volumgjengivelser i panelene C-F presenteres i tilleggsvideo S1, tilleggsvideo S2, tilleggsvideo S3 og tilleggsvideo S4. Skalastenger = 500 μm (A,B). Forkortelser: GSCs = glioblastom stamceller; OT = optisk tektum; GFP = grønt fluorescerende protein; BV = blodkar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Svulster ved E15 som følge av en blanding av GSC og U-118 GBM celler injisert i E5 optisk tektum. GSC er grønne på grunn av GFP-uttrykk og U-118/L1LE-celler er røde på grunn av mCherry-uttrykk. GSC15-2 er vist i panelene A-D, og GSC16-4 er vist i panelene E og F. (A) Konfokalt enkelt z-plan med lav forstørrelse av en blandet celletumor (pil) nær ventrikkelen. Kjerner er motfarget hvite med bisbenzimid. (B) Høyere forstørrelse (10x objektiv) av tumor vist i A med invasjon av røde U-118-celler i OT nær ventrikkeloverflaten. (C) Et litt annet plan med optisk snitt enn det i A som viser svulsten (pilen) innebygd dypere inn i OT-veggen. (D) Maksimal projeksjon (20x objektiv) av flere z-plan av svulsten i C som viser detaljer om de sorterte cellene i svulsten. (E) Enkelt z-planbilde (20x objektiv) av en blandet tumor med GSC16-4-celler, som viser at sortering i svulsten skjedde i et motsatt mønster fra GSC15-2-celler, med de grønne GSC-ene som skaper en tynn og jevn cortex som omgir de røde U-118-cellene. Tumorens festeområde til OT-veggen er ikke vist i dette z-planet. Legg merke til området av svulsten der det er en diskontinuitet i GSC-cortex med U-118 / L1LE-celler som buler gjennom (pil). Immunfarging for L1CAM er vist i blått. (F) Samme bilde som i E, men viser bare de grønne GSC-ene og blå L1CAM-farging. Skalastenger = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Forkortelser: GSCs = glioblastom stamceller; OT = optisk tektum; GFP = grønt fluorescerende protein; V = ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Levedyktighet av ex vivo optiske tektumskiver etter 1 uke i kultur. E14 optiske tektumskiver ble dyrket på membraninnlegg i 1 uke og deretter fiksert og immunfarget. Vist i A og B er konfokale bilder (10x objektiv) av en hjerneskive farget for kjerner med bisbenzimid (A) og immunfarget for laminin (B), som tydelig viser normale, intakte blodkar optisk seksjonert i forskjellige konfigurasjoner i kraft av lamininfargingen. (C) Et konfokalt bilde som ligner det som vises i panel A og B hvor kjerner og laminininfarging begge er synlige. (D) Et konfokalt bilde med høyere forstørrelse (60x oljeobjektiv) som viser detaljer om farging av kjernekraft og laminin. (E) Maksimalt projeksjonsbilde av konfokal z-stack (20x objektiv) av hjerneskive farget for Sox2-transkripsjonsfaktor i røde og totale kjerner med bisbenzimid i hvitt. Merk at flertallet av kjernene har Sox2-farging, som vist in vivo (se figur 1). Skalastenger = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Forkortelse: P = pial overflate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: U-118/mCherry-celler plassert i en ex vivo hjerneskive via biopsi-stansemetoden. Hulrom ble opprettet i hjerneskiver ved hjelp av en 1 mm biopsistans, og deretter ble røde U-118/L1LE/mCherry-celler blandet med matriks implantert som en "plugg". Etter flere dager ble hjerneskivene fikset, immunfarget for laminin og montert på lysbilder for konfokalmikroskopanalyse. Panel A og C viser lavforstørrelse, konfokale, enkle z-planbilder (4x objektiv) av den resulterende "svulsten" og omkringliggende celler som invaderte hjerneskiven. (B) En volumgjengivelse av en z-stabel fra preparatet i panel A ved en høyere forstørrelse (20x objektiv), som viser omfattende invasjon av U-118-celler (pil). (D) Bildet viser en lignende volumgjengivelse av den nedre delen av de omfattende invaderende cellene vist i panel C. Lamininfarging er vist i grønt, men ingen klare blodkar er synlige. (E) Bildet viser en del av en celleplugg og gruppe celler som har invadert hjernestykket, sammen med lamininfarging for blodkar i blått. (F) En høyere forstørrelse av de invaderende cellene vist i panel E, og celler kan tydelig sees justert langs blodkar (piler). Alle paneler viser hvit kjernefysisk motfarging med bisbenzimid. Skalastenger = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). Skala for panel B og D er langs volumgjengivelsesaksene. Forkortelse: OT = optisk tektum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Levende celle sfæroider i kultur og widefield fluorescensbilder av levende GBM-celler i ex vivo hjerneskiver. Vist i panelene A og B er fasekontrastbilder (ved hjelp av et 10x objektiv på et invertert mikroskop) av U-118 / L1LE GBM-celler (A) og GSCs (B) vokser som sfæroider (piler). Vist i bakgrunnen av panel A er ujevnheten i poly-HEMA belegget som kan oppstå på cellekulturfatet. Vist i paneler C-F er bredfeltfluorescensbilder av U-118 / L1LE-cellesfæroider og invaderende celler (piler) under et time-lapse-eksperiment for å overvåke live-oppførselen til invasjon i ex vivo-skivene (ved hjelp av et 20x objektiv på et tilpasset time-lapse-mikroskopsystem18). I panel C og E er cellene farget med det langt røde fluorescerende membranfargestoffet DiD, og i panelene D og F avbildes cellene via deres røde mCherry-uttrykk. Skalastenger = 100 μm. Videoer av widefield fluorescens time-lapse-eksperimenter vist i panelene C og D finnes i henholdsvis tilleggsvideo S5 og supplerende video S6. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSCs = GBM stamceller; S = sfæroid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av levende GSC- og GBM-celler. Vist i alle paneler er endepunktsbilder av fem forskjellige blandede celle sfæroide engraftments på separate hjerneskiver. For panel A-E ble konfokale z-stack-bilder anskaffet ved 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. Preparatene inkluderte hjerneskiver med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiver ble dyrket på membraninnsatser i en 6-brønns plastcellekulturskål ved bruk av en ekstra lang arbeidsavstand (ELWD) 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelser ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvare "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Intervallvideoer av disse konfokalvolumgjengivelsene over tid presenteres i Supplerende video S7, Tilleggsvideo S8, Tilleggsvideo S9, Tilleggsvideo S10 og Tilleggsvideo S11. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSCs = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; NA = numerisk blenderåpning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Konfokale bilder av faste hjerneskiver med invasive GBM-celler fra sfæroider av forskjellige celletyper. Grønne sfæroider var sammensatt av GSC16-4 / GFP-celler og røde sfæroider var sammensatt av U-118 / L1LE / mCherry-celler. Vist i paneler A-F er forskjellige syn på hjerneskiver, hvor flere røde og grønne sfæroider ble dyrket i flere dager før fiksering og immunfarging for laminin (blå). Panelene A-C er av samme OT-skive der A ble tatt med et 4x mål, og panelene B og C er gjengivelser med høyere forstørrelsesvolum (20x objektivt) av celler som invaderte hjernestykket fra to av sfæroidene vist i panel A. Begge celletypene invaderte tydelig vev langs blodårene. Panel D viser en volumgjengivelse (20x objektiv) av en annen hjerneskive hvor to forskjellige sfæroider var plassert tett sammen, og celler fra begge ses migrere langs samme blodkar som ligger mellom dem (pil). Panel E er en volumgjengivelse med høy forstørrelse (60x oljemål) som avslører at de grønne cellene migrerer langs blodkarets ytre overflate, mens den røde cellen migrerer inne i blodkaret (pil). Innfellingen viser en enkelt z-plan optisk seksjon, hvor den røde cellen er tydelig omgitt av blå farging av blodkaret (pil), og den grønne cellen er tydelig utenfor blodkaret. Skala bar i innfelt = 50 μm. Panel F viser en volumgjengivelse (10x objektiv) av et forhjernestykke med to tett apposed forskjellig fargede sfæroider. Svært lite, om noen, celleinvasjon skjedde fra en sfæroid til den andre, og en skarp grense eksisterte mellom dem. Panelene A, B, C og E viser også hvit kjernefysisk motfarging med bisbenzimid. Skala bar = 500 μm (A). Vekter for panelene B-F er langs volumgjengivelsesaksene. Forkortelser: GBM = glioblastom; GSCs = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; OT = optisk tektum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Konfokale bilder av faste hjerneskiver med invasive GBM-celler fra blandede cellesfæroider og sfæroider merket med DiD. Paneler A-D viser volumgjengivelser av hjerneskiver som inneholdt blandede celle sfæroider sammensatt av grønne GSC16-4 / GFP-celler og røde U-118 / L1LE / mCherry-celler. Tallrike røde U-118-celler spredte seg fra sfæroidene og invaderte hjerneskiven i alle retninger, mens de grønne GSC-ene ikke spredte seg og forble på de sentrale stedene til sfæroidene. Panel E og F viser et ex vivo skivepreparat med røde U-118 / L1LE / mCherry sfæroider også merket med langt rødt membranfargestoff DiD (vist som blått). Etter fiksering ble skiven immunfarget for laminin i grønt. DiD-etiketten var synlig i røde blodlegemer som punktfarging (piler) og var synlig selv i celler som hadde spredt seg fra sfæroidene langs blodårene. Nukleær motfarging med bisbenzimid er ikke vist i denne figuren, slik at den andre fargingen er tydeligere. Skalastenger = 100 μm (E,F). Forkortelser: GBM = glioblastom; GSCs = GBM stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Medium/løsning Komposisjon
GSC-medier 1: 1 blanding av DMEM / F12, 1% føtal bovint serum (FBS), 15 mM HEPES buffer, 2 mM L-glutamin, 100 μg / ml penicillin-streptomycin (penn / streptokokker), 2% B27 supplement uten vitamin A, og 2,5 μg / ml heparin.
GBM-medier DMEM (høy glukose), 10% FBS, penn / streptokokker, og 2 mM L-glutamin.
Fiksering buffer 2 % PFA i 0,1 M natriumkakodylatbuffer
Medium for innebygging 3,5 % agar og 8 % sukrose i PBS
PBSTG 0,1% Triton X-100 + 5% normalt geitserum (NGS) i PBS
U-118 MG cellekulturmedium DMEM + 10% FBS + penn / streptokokker + L-glutamin
Brain Slice Kultur Media 50% MEM + 25% HBSS + 25% Hesteserum + B27 + penn/streptokokker + L-glut + 15 mM HEPES-buffer
vibrerende vev slicer skiver media Middels 199 + penn/streptokokker + 15 mM HEPES-buffer

Tabell 1: Sammensetning av medier og buffere brukt i denne protokollen.

Tilleggsfigur 1: Injeksjon i E5 optisk tektum. (A) Etter at et hull er kuttet i eggeskallet over luftrommet, og luftromsmembranen er fuktet med saltvann eller media, fjernes membranen med fine tang. (B) For å injisere celler i optisk tektum, blir amnion klemt og holdt med fine tang for å plassere hodet slik at optisk tektum er tilgjengelig.  Deretter settes mikropipetten inn i optisk tektum og celler injiseres trykk i den. (C) Etter injeksjon av celler tilsettes noen dråper ampicillinoppløsning på toppen av embryoet ved hjelp av en sprøyte og fin nål. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Disseksjon av E15 hjerneregioner. (A) Etter halshogging plasseres E15-embryohodet i en tallerken med steril CMF-løsning. (B) Huden som ligger over hjernen fjernes deretter ved hjelp av fine tang. (C ) De to hodeskallebeinene blir deretter fjernet fra overliggende de to forhjernens (FB) halvkuler. (D) Bindevevet dura fjernes deretter forsiktig fra omkringliggende forhjernen (FB), optisk tektum og cerebellum. (E) Hele hjernen blir deretter fjernet fra hodet ved å forsiktig øse den ut av hjernehulen fra undersiden ved hjelp av buede tang. (F ) Vist er dorsalvisningen av hele den fjernede hjernen med forhjerne (FB), optisk tektum (OT) og lillehjernen (CB). (G ) Den isolerte hjernen blir deretter dissekert i forebrain (FB), optisk tektum (OT) halvkuler og cerebellum (CB) ved hjelp av fin saks. (H) Det delikate bindevevet pia fjernes deretter lett fra de optiske tektumhemisfærene (OT) ved hjelp av fine tang. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Innebygging og kutting av E15 optisk tektum og plassering av cellesfæroider. (A) En optisk tektumhalvkule er nedsenket i lavsmelteagarose ved hjelp av buet tang. (B) Etter at agarosen har herdet på is, trimmes blokken som inneholder optisk tektum og limes til sokkelen i rustfritt stål i skivefatet/brettet. (C) Etter at limet tørker, legges skiveformen/brettet i klumpen på den vibrerende vevskutteren og fylles med kalde skiver.  Skiver blir deretter kuttet med safirkniven fra den nedsenkede vevblokken.  Oppskårne skiver vil flyte inn i fatet/brettet og kan fjernes med en slikkepott.  (D) Avskårne skiver fjernes fra fatet/brettet og legges direkte på membraninnsatser med underliggende skivekulturmedier i en flerbrønnsplate. (E) Etter at cellesfæroider er dyrket på poly-HEMA belagte retter, fjernes en sfæroid fra parabolen i en minimal mengde media ved bruk av en 20 μL mikropipettor. (F) Den isolerte sfæroiden plasseres deretter direkte på hjerneskiven i minimalmediet. (G) Hvis sfæroid faller av hjerneskiven på grunn av strømmen av mediet, kan den dyttes tilbake på hjerneskiven ved hjelp av en øyenvippe limt til en applikatorpinne av tre. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S1: Video av gjengivelse av høyt forstørrelsesvolum av en liten GSC15-2-tumor ved E15. GSC-er er grønne på grunn av GFP-uttrykk. Video tilsvarer figur 1C og viser GSC15-2 celler. Videoen viser rotasjon av en volumgjengivelse generert fra en z-stakk ved hjelp av et 60x oljenedsenkingsmål. Cellekjerner vises hvite på grunn av bisbenzimidfarging, og noen ser røde ut på grunn av immunfarging for Sox2. Merk at på grunn av "Alpha Blending" for volumgjengivelser i konfokalmikroskopprogramvaren, blandes ikke farger som de ville bruke en maksimal intensitetsprojeksjon, og den mest intense fargen dominerer og skjuler den mindre intense fargen. Blodkar er farget hvitt på grunn av immunfarging for laminin. GSC-markørintegrin alfa-6-farging vises i blått og vises punktert på grønne GSC-overflater. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S2: Video av gjengivelse av volum med høyt forstørrelse av liten GSC16-4-tumor ved E15. GSC-er er grønne på grunn av GFP-uttrykk. Video tilsvarer figur 1D og viser GSC16-4 celler. Videoen viser rotasjon av en volumgjengivelse generert fra en z-stakk ved hjelp av et 60x oljenedsenkingsmål. Cellekjerner vises hvite på grunn av bisbenzinimidfarging, og noen GSC virker røde på grunn av immunfarging for nestin. Merk at på grunn av "Alpha Blending" for volumgjengivelser i konfokalmikroskopprogramvaren, blandes ikke farger som de ville bruke en maksimal intensitetsprojeksjon, og den mest intense fargen dominerer og skjuler den mindre intense fargen. Blodkar er farget hvitt på grunn av immunfarging for laminin. GSC-markørintegrin alfa-6-farging vises i blått og vises punktert på grønne GSC-overflater. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S3: Video av gjengivelser med høyt forstørrelsesvolum av liten GSC15-2-tumor ved E15. GSC-er er grønne på grunn av GFP-uttrykk. Video tilsvarer figur 1E og viser GSC15-2 celler. Videoen viser rotasjon av en volumgjengivelse generert fra en z-stakk ved hjelp av et 60x oljenedsenkingsmål. Cellekjerner vises hvite på grunn av bisbenzimidfarging, og noen ser røde ut på grunn av immunfarging for Sox2. Merk at på grunn av "Alpha Blending" for volumgjengivelser i konfokalmikroskopprogramvaren, blandes ikke farger som de ville bruke en maksimal intensitetsprojeksjon, og den mest intense fargen dominerer og skjuler den mindre intense fargen. Blodkar er farget hvitt på grunn av immunfarging for laminin. GSC-markørintegrin alfa-6-farging vises i blått og vises punktert på grønne GSC-overflater. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S4: Video av gjengivelser med høyt forstørrelsesvolum av små GSC16-4-svulster ved E15. GSC-er er grønne på grunn av GFP-uttrykk. Video tilsvarer figur 1F og viser GSC16-4 celler. Videoen viser rotasjon av en volumgjengivelse generert fra en z-stakk ved hjelp av et 60x oljenedsenkingsmål. Cellekjerner ser hvite ut på grunn av bisbenzimidfarging, og noen virker røde på grunn av immunfarging for nestin. Merk at på grunn av "Alpha Blending" for volumgjengivelser i konfokalmikroskopprogramvaren, blandes ikke farger som de ville bruke en maksimal intensitetsprojeksjon, og den mest intense fargen dominerer og skjuler den mindre intense fargen. Blodkar er farget hvitt på grunn av immunfarging for laminin. GSC-markørintegrin alfa-6-farging vises i blått og vises punktert på grønne GSC-overflater. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S5: Video av levende GBM-celler i ex vivo hjerneskive. Video tilsvarer figur 5C og viser bredfeltfluorescensbilder av U-118 / L1LE-cellesfæroider og invaderende celler under et time-lapse-eksperiment for å overvåke live-oppførselen til invasjon i ex vivo-skiven (ved hjelp av et 20x objektiv på et tilpasset time-lapse-mikroskopsystem). U-118/L1LE-cellene ble farget med det langt røde fluorescerende membranfargestoffet DiD. Bilder ble anskaffet med et monokromt kamera. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S6: Video av levende GBM-celler i ex vivo hjerneskive. Video tilsvarer figur 5D og viser bredfeltfluorescensbilder av U-118 / L1LE-cellesfæroider og invaderende celler under et time-lapse-eksperiment for å overvåke live-oppførselen til invasjon i ex vivo-skiven (ved hjelp av et 20x objektiv på et tilpasset time-lapse-mikroskopsystem). Cellene ble avbildet via deres røde mCherry-uttrykk. Bilder ble anskaffet med et monokromt kamera. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S7: Video av volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av aktive GSC-er og GBM-celler. Video tilsvarer figur 6A. Konfokale z-stack-bilder ble tatt med 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. Preparatet var av en hjerneskive med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiven ble dyrket på en membraninnsats i en 6-brønns plastcellekulturskål ved hjelp av en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelsen ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvaren "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Videoen observeres best ved å manuelt dra glidebryteren for videofremdrift i videospilleren frem og tilbake for å observere cellebevegelser i stedet for å la videospilleren fortsette med normal lav hastighet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S8: Video av volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av aktive GSC-er og GBM-celler. Video tilsvarer figur 6B. Konfokale z-stack-bilder ble tatt med 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. Preparatet var av en hjerneskive med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiven ble dyrket på en membraninnsats i en 6-brønns plastcellekulturskål ved hjelp av en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelsen ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvaren "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Videoen observeres best ved å manuelt dra glidebryteren for videofremdrift i videospilleren frem og tilbake for å observere cellebevegelser i stedet for å la videospilleren fortsette med normal lav hastighet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S9: Video av volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av aktive GSC-er og GBM-celler. Video tilsvarer figur 6C. Konfokale z-stack-bilder ble tatt med 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. Preparatet var av en hjerneskive med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiven ble dyrket på en membraninnsats i en 6-brønns plastcellekulturskål ved hjelp av en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelsen ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvaren "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Videoen observeres best ved å manuelt dra glidebryteren for videofremdrift i videospilleren frem og tilbake for å observere cellebevegelser i stedet for å la videospilleren fortsette med normal lav hastighet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S10: Video av volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av aktive GSC-er og GBM-celler. Video tilsvarer figur 6D. Konfokale z-stack-bilder ble tatt med 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. Preparatet var av en hjerneskive med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiven ble dyrket på en membraninnsats i en 6-brønns plastcellekulturskål ved hjelp av en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelsen ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvaren "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Videoen observeres best ved å manuelt dra glidebryteren for videofremdrift i videospilleren frem og tilbake for å observere cellebevegelser i stedet for å la videospilleren fortsette med normal lav hastighet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo S11: Video av volumgjengivelsesbilder av konfokal 4D-tidsforløp av aktive GSC- og GBM-celler. Video tilsvarer figur 6E. Konfokale z-stack-bilder ble tatt med 10 μm trinn hvert 10. minutt over en 20 timers periode. preparatet inkluderte en hjerneskive med implanterte blandede cellesfæroider av røde U-118/L1LE/mCherry-celler og grønne GSC16-4/GFP-celler. Konfokale bilder ble tatt mens hjerneskiven ble dyrket på en membraninnsats i en 6-brønns plastcellekulturskål ved hjelp av en ELWD 20x objektivlinse (0,45 NA), som ga den nødvendige ekstra arbeidsavstanden. Volumgjengivelsen ble generert ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvaren "Alpha Blending", som gir en tilsynelatende 3D-effekt. Mikronskalaer vises langs kantene av volumgjengivelsen. Videoen observeres best ved å manuelt dra glidebryteren for videofremdrift i videospilleren frem og tilbake for å observere cellebevegelser i stedet for å la videospilleren fortsette med normal lav hastighet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen for injeksjon av celler i midthjernen (optisk tektum) ventrikkel inkluderer ikke skade blodkarene i chorioallantoic membranen i egget eller omgir embryoet før og under injeksjon, selv om amnionmembranen umiddelbart rundt embryoet kan trekkes forsiktig og holdes for å plassere hodet når du injiserer cellene i midtveien. Amnion er relativt tøff og kan trekkes med fine tang for å plassere hodet og holde det stødig med den ene hånden, for injeksjon av celler med den andre hånden inn i optisk tektum, som er den store, runde strukturen i midten av hjernen. Generelt varierer levedyktigheten til injiserte embryoer fra 25% til 75%, avhengig av ukjente faktorer, og praktisk talt hvert embryo som overlever inneholder minst en liten svulst i optisk tektum. Kritiske trinn i å generere levedyktige hjerneskiver inkluderer blotting vevet av overflødig væske slik at agarose fester seg til hjernen under skiver og for å holde vev og skiver kaldt til plassert på membraninnsatsen. Siden forskjellige celletyper danner sfæroider forskjellig (i hastighet og størrelse), bør den belagte celletettheten på poly-HEMA-plater og hvor lang tid det tar før høsting av sfæroider optimaliseres for hver celletype.

Arbeidet her har ikke vært gjenstand for en formell longitudinell studie av hjerneskivens levedyktighet. Yang et al. brukte kyllingembryohjerneskivekulturer som ligner på de som brukes her og viste god levedyktighet av skivene i minst 7 dager16. Tidligere arbeid viste at når OT-vev ble holdt i suboptimale medier, oppstod mange pyknotiske kjerner i vevet, noe som ikke forekom i skivene i arbeidet her. I tillegg, når skiver degenererer under suboptimale forhold, fragmenterer blodkarene og vises som rader av laminin-positive kuler (ikke vist). Således, selv om levedyktigheten her ikke er kontrollert ved metoder som elektrofysiologi eller aktivt caspase-3-uttrykk, oppstod ingen av indikatorene for celledød som ble sett under suboptimale kulturforhold her.

OT har vært fokusert på for in vivo hjernesvulsteksperimenter fordi det er den lettest injiserte regionen med den største ventrikkelen. Ved E5, som er den siste dagen embryoet er lite nok til å forbli tilgjengelig på toppen av eggeplommen, må injeksjoner gjøres i en ventrikkel, da alle hjernegrupper ikke er noe mer enn en tynn ventrikkelsone. Likevel resulterer disse injeksjonene vellykket i innebygde svulster med celler som invaderer hjerneparenkymet. Noen ganger er resulterende svulster funnet i forebrain eller cerebellum, men dette er ikke vanlig. Ex vivo skiver av E15 optisk tektum har primært blitt brukt til eksperimenter her, slik at ex vivo co-kultur resultatene kan korreleres med in vivo injeksjon eksperimenter. Imidlertid er forhjerneskiver også egnet og har et større overflateareal og en veldig tynn ventrikkel sammenlignet med optisk tektum, noe som kan gjøre forhjernen mer egnet for ex vivo-kokulturer som ikke blir korrelert med in vivo-injeksjoner.

Det har her blitt vist at in vivo-injeksjoner , etterfulgt av vevsfiksering, vibrerende vevskutterseksjonering og immunfarging for laminin og andre markører, resulterte i høyoppløselige bilder av GBM-celler og GSC i hjernevev i nærheten av blodkar. Evnen til å bestemme sammenhenger mellom tumorceller og blodkar ble sterkt tilrettelagt ved å lage 3D-volumgjengivelser fra z-stabler av konfokale optiske seksjoner ved hjelp av konfokalprogramvaren og produsentens instruksjoner. Time-lapse-avbildning ved bruk av bredfeltfluorescensmikroskopi av GFP-, mCherry- og DiD-merkede celler var mulig; Imidlertid ble migrerende celler som var i nærheten av de svært fluorescerende sfæroidene noen ganger skjult av "gløden" fra sfæroiden. Denne uønskede effekten kan minimeres noe ved å nøye justere eksponeringstidene for innsamling av bredfeltbilder. Time-lapse-avbildning ved bruk av konfokale z-stacks over tid (4D) eliminerte den ufokuserte gløden fra sfæroidene og resulterte i skarpt definerte migrerende celler med mørk bakgrunn. Dette ble ikke beskrevet i protokollen, men ble utført på samme måte som widefield time-lapse-avbildning, som ble utført mens hjerneskiver var på de gjennomsiktige membraninnsatsene i en 6-brønns plastplate. Selv om konfokal time-lapse-avbildning resulterer i markant klarere bilder av individuelle celler og deres oppførsel, er et flerpunkts time-lapse-eksperiment som samler z-stabler på 10 z-plan / punkt, med 10 minutters intervaller over en 20 timers periode, en omfattende bruk av skannehodegalvanometre. Siden dette kan redusere levetiden til galvanometrene betydelig, brukes denne metoden med omhu.

Selv om kyllingembryosystemet er svært egnet for både in vivo-injeksjon og ex vivo samkultureksperimenter som undersøker GBM-celleadferd, er det flere begrensninger for dette modellsystemet. Som med ethvert xenograftsystem, er miljøet der menneskelige celler implanteres, ikke den menneskelige hjerne, men GBM-celleadferd ser ut til å etterligne det i gnagermodeller og hos menneskelige pasienter. Etter å ha utført in vivo injeksjonseksperimenter på E5, får svulster normalt lov til å danne seg i 10 dager, til E15. Dette er tydeligvis ikke nok tid til å studere alle aspekter av tumorigenese og celleinvasjon. Imidlertid har det blitt påvist her at solide svulster dannes i hjerneparenkymet, celler interagerer og omorganiserer seg i svulsten, og betydelig hjerneinvasjon forekommer både langs blodkar og diffust innenfor denne relativt korte tidsperioden. En annen begrensning for in vivo kyllingembryosystemet er at det ikke er egnet for narkotika eller andre behandlinger på grunn av det store eggeplommen og ekstraembryonale sirkulasjonssystemet som opererer under kyllingembryoutvikling. Aktuelle flytende medikamentelle behandlinger vil resultere i en svært variabel og ukjent konsentrasjon i hjernen på grunn av diffusjon bort fra embryoet til den mye større eggeplommemassen. På samme måte vil intravenøs injeksjon av legemidler i det svært delikate ekstraembryonale sirkulasjonssystemet lekke eller diffundere ut av blodkarene og også resultere i ukjente konsentrasjoner i hjernen. Dette er en av hovedgrunnene til at ex vivo skivekulturmetoden ble tatt i bruk - slik at ikke bare celleadferd kunne observeres og spores via time-lapse-mikroskopi, men også slik at behandlinger som har vært vellykkede med å endre GBM-celleadferd i en tallerken4 , kunne testes i et mer relevant hjernevevsmiljø.

Utviklingen av chick embryo ortotopisk hjernesvulst modellsystem er sett på som et betydelig tillegg til systemene og verktøyene som er tilgjengelige for studiet av GBM-tumordannelse og invasiv celleadferd. Befruktede kyllingegg er sannsynligvis lett tilgjengelige i de fleste områder, de er billige sammenlignet med gnagere, det er ingen dyrepleiekostnader, embryoene er svært motstandsdyktige og motstandsdyktige mot infeksjon (dvs. det meste arbeidet gjøres på en benk), embryoene er svært manipulerbare og kan dyrkes i skallløs kultur19, og kyllingembryoer regnes ikke som virveldyr og krever derfor ikke IACUC-godkjenning av NIHs retningslinjer (institusjonelle krav kan variere). Dermed gjør disse mange fordelene kyllingembryosystemet veldig attraktivt hvis man begrenser sine spørsmål og eksperimenter til de som faller innenfor sine begrensninger. Flere GBM-cellestudier har blitt utført av andre som bruker kyllingembryoet, men disse har nesten utelukkende benyttet chorioallantoisk membran (CAM) av embryoet 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 og lem bud 30, og ikke hjernen. Det har også vært en rapport implantere medulloblastom i kyllinghjernen på E231. Utvilsomt bør bruken av kyllingembryoet som et ortotopisk xenograftmodellsystem, som beskrevet her, gi resultater som er mye mer meningsfulle for menneskelig GBM-tumorbiologi enn studier som bruker CAM.

Selv om disse studiene bare har begynt å utnytte chick embryo hjernesvulstmodellsystemet fullt ut for studier av menneskelig GBM-celle- og GSC-oppførsel, er det håpet at andre vil utvide bruken og finne ytterligere potensielle applikasjoner. Man kan forestille seg at dette systemet ikke bare vil avdekke mekanismer som regulerer GBM-tumordannelse og celleadferd, men også vil tillate preklinisk testing av spesifikke legemidler og stoffer på spesifikke pasienters celler. For eksempel, hvis hjerneskivekulturer ble satt opp på forhånd, kunne tumorceller, stykker fra kirurgiske tumorreseksjoner eller pasientavledede GBM-organoider32 plasseres direkte i ex vivo samkultur, og ulike behandlinger kunne vurderes i løpet av få dager. På samme måte kan dissosierte pasientceller injiseres direkte inn i E5 midbrains i ovo for å vurdere deres evne til å danne svulster og invadere hjerneparenkym. Det er derfor å håpe at beskrivelsene av metodene og representative resultater her vil lette og oppmuntre til økt bruk av dette svært underutnyttede systemet for hjernekreftforskning.

Disclosures

Ingen av forfatterne har interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend til DSG fra National Cancer Institute (R03CA227312) og av et sjenerøst tilskudd fra Lisa Dean Moseley Foundation. Levende GBM-prøver ble innhentet med pasientens samtykke gjennom Tissue Procurement Center ved Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansiering til AR ble gitt av National Center for Research Resources og National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Sommerstipendiat til NP, AL, ZW og KS ble levert av University of Delaware Undergraduate Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch Birabira N/A
1 mm biopsy punch pen Robbins Instruments 20335
6 well insert plate (Corning Transwell) Millipore Sigma CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
24 well plate Corning Costar 3526
50 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-9
Agar Fisher BioReagents BP1423-500 for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-545-146
Aluminum foil ReynoldsWrap N/A
Ampicillin Sigma Aldrich A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 Santa Cruz Biotechnology sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 Santa Cruz Biotechnology sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 Santa Cruz Biotechnology sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 Santa Cruz Biotechnology sc-365823
B27 supplement without vitamin A GIBCO 17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258) Sigma-Aldrich B2883 nuclear stain
Cell culture incubator Forma standard humidified CO2 incubator
Centrifuge Beckman Coulter
Confocal microscope Nikon Instruments C2si+ With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses Nikon Instruments Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software Nikon Instruments NIS Elements Version 5.2
Curved foreceps World Precision Intruments 504478
Curved scissors Fine Science Tools
Curved spatula Fisher Scientific 14-375-20
Cyanoacrylate glue Krazy Glue KG-585 12R
D-Glucose Millipore Sigma G8270
DiD far red fluorescent dye Invitrogen V22887 Vybrant DiD
DMEM Sigma Aldrich D5671
DMEM/F12 Sigma Aldrich D8437
DMSO Sigma Aldrich D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493-1L
egg incubator Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm) Scotch N/A
Ethanol 200 proof Decon Laboratories 2701
Fast green FCF dye Avocado Research Chemicals 16520
FBS Gemini Bio-products 900-108
filter paper Fisher Scientific
Gauze Dynarex 3353
Glass Capillaries for microinjection World Precision Instruments TW100-4
Glycerol Fisher BioReagents BP228-1 for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells) Not applicable Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Hausser scientific
Heparin Fisher Scientific BP2524-100
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887
Horse Serum (HI) Gibco 26050-088
Human FGF-2 BioVision 4037-1000
Human TGF-α BioVision 4339-1000
Inverted phase contrast microscope Nikon Instruments TMS for routine viewing of cultured cells
KCl Fisher Scientific BP366
KH2PO4 Fisher Scientific P284
Laboratory film Parafilm
Labquake Shaker LabIndustries T400-110
L-Glut:Pen:Strep Gemini Bio-products 400-110
Low-melt agarose Fisher Scientific BP1360 for embedding live brains
Matrix Corning Matrigel 354234
Medium 199 GIBCO 11150-059
MEM Corning 10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) Fisherbrand 12544A
NaCl Fisher Scientific S271
NaH2PO4 + H2O Fisher Scientific S369
NaHCO3 Fisher Scientific BP328
Normal goat serum Millipore Sigma 526-M
N-propyl gallate Sigma Aldrich P3130 for mounting media
Parafilm Parafilm
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS Sigma Aldrich P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish Becton Dickinson 351008
pneumatic picopump World Precision Intruments PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA) Sigma Aldrich P-3932
razor blade- double edge PACE for cutting fixed brain slices
sapphire knife Delaware Diamond Knives for cutting live brain slices
Scalpel TruMed 1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 11652
Specimen chamber for vibratome custom-made
Stereo Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ1500 Equipped with epifluorescence
straight foreceps World Precision Intruments 500233
straight scissors Fine Science Tools
Sucrose Mallinckrodt 7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) Nikon Instruments TE2000-E With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm Thermo Fisher Scientific 130182 for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm Becton Dickinson 353004 for cell culturing
Transfer pipette American Central Scientific Co. FFP011
Transparent tape Scotch
Triton X-100 Sigma Aldrich T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line ATCC HTB-15 Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump Cole-Parmer EW-07532-40 "Air Cadet"
Vibrating tissue slicer Vibratome 3000 for cutting live and fixed brain slices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).
  2. Yang, M., et al. L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation. Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).
  3. Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).
  4. Anderson, H. J., Galileo, D. S. Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation. Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).
  5. Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982 (2019).
  6. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  7. Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
  8. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  9. Aaberg-Jessen, C., et al. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).
  10. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).
  11. Ren, B., et al. Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture. Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).
  12. Fayzullin, A., et al. Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling. Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).
  13. Jensen, S. S., et al. Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model. PloS One. 11 (7), e0158746 (2016).
  14. Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435 (2018).
  15. Tamura, R., et al. Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion. Molecular Brain. 12 (1), 45 (2019).
  16. Yang, C., et al. Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).
  17. Murrell, W., et al. Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain. PloS One. 8 (8), e71334 (2013).
  18. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  19. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  20. Shoin, K., et al. Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  21. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  22. Balciūniene, N., et al. Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane. Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).
  23. De Magalhães, N., et al. Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research. Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).
  24. Szmidt, M., et al. Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo. Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).
  25. Jaworski, S., et al. Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane. Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).
  26. Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease. International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).
  27. Urbańska, K., et al. The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells. Nanoscale Research Letters. 10, 98 (2015).
  28. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  29. Han, J. M., Jung, H. J. Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells. Molecules. 27 (22), 7968 (2022).
  30. Ruiz-Ontañon, P., et al. Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue. Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).
  31. Cage, T. A., et al. Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).
  32. Darrigues, E., et al. Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720 (2021).

Tags

Nevrovitenskap utgave 195
Bruke Chick Embryo Brain som en modell for <em>in</em> vivo og <em>ex vivo</em> analyser av human glioblastomcelleadferd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin,More

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin, A., Doerr, J., Waterman, Z., Sershen, K., Ray, P., Rodriguez, A., Galileo, D. S. Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior. J. Vis. Exp. (195), e65199, doi:10.3791/65199 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter