Chick embryoer brukes til å studere human glioblastom (GBM) hjernesvulster i ovo og i ex vivo hjerne skive co-kulturer. GBM-celleoppførsel kan registreres ved time-lapse-mikroskopi i ex vivo-kokulturer, og begge preparatene kan analyseres ved det eksperimentelle endepunktet ved detaljert 3D-konfokalanalyse.
Kyllingembryoet har vært et ideelt modellsystem for studier av virveldyrutvikling, spesielt for eksperimentelle manipulasjoner. Bruk av kyllingembryoet har blitt utvidet for å studere dannelsen av humant glioblastom (GBM) hjernesvulster in vivo og invasiviteten av tumorceller i omkringliggende hjernevev. GBM-svulster kan dannes ved injeksjon av en suspensjon av fluorescerende merkede celler i E5 midbrain (optisk tektum) ventrikkel i ovo.
Avhengig av GBM-cellene, dannes kompakte svulster tilfeldig i ventrikkelen og i hjerneveggen, og grupper av celler invaderer hjerneveggvevet. Tykke vevssnitt (350 μm) av fast E15-tekta med svulster kan immunfarges for å avsløre at invaderende celler ofte migrerer langs blodkar når de analyseres ved 3D-rekonstruksjon av konfokale z-stack-bilder. Levende E15 midthjerne- og forhjerneskiver (250-350 μm) kan dyrkes på membraninnsatser, hvor fluorescerende merkede GBM-celler kan innføres på ikke-tilfeldige steder for å gi ex vivo-samkulturer for å analysere celleinvasjon, som også kan forekomme langs blodkar, over en periode på ca. 1 uke. Disse ex vivo-kokulturene kan overvåkes ved bredfelt- eller konfokal fluorescens time-lapse-mikroskopi for å observere levende celleadferd.
Samdyrkede skiver kan da fikses, immunfarges og analyseres ved konfokalmikroskopi for å avgjøre om invasjonen skjedde langs blodkar eller aksoner. I tillegg kan samkultursystemet brukes til å undersøke potensielle celle-celle-interaksjoner ved å plassere aggregater av forskjellige celletyper og farger på forskjellige nøyaktige steder og observere cellebevegelser. Medikamentelle behandlinger kan utføres på ex vivo kulturer, mens disse behandlingene ikke er kompatible med in ovo systemet. Disse to komplementære tilnærmingene tillater detaljerte og presise analyser av menneskelig GBM-celleadferd og tumordannelse i et svært manipulerbart virveldyrhjernemiljø.
In vitro-studier av kreftcelleatferd brukes ofte til å dissekere potensielle mekanismer som opererer under den mer komplekse oppførselen som observeres under tumordannelse og celleinvasjon i in vivo xenograft-modeller. For eksempel, med glioblastom (GBM), har in vitro-studier avdekket mekanismer for hvordan L1CAM potensielt opererer under tumordannelse og hjerneinvasjon i en ny kyllingembryo xenograft hjernesvulst modell 1,2,3,4,5. Selv om in vitro- og in vivo-eksperimenter utfyller hverandre på nyttige måter, etterlater de et betydelig gap i hvordan resultatene kan korreleres. For eksempel er mekanistiske analyser av GBM-cellemotilitet på en tallerken en svært kunstig situasjon, og in vivo xenograft-modeller kan bare avsløre statiske tidspunkt- eller endepunktsanalyser av tumordannelse og celleatferd. In vivo-studier med enten gnagere eller kyllingembryoer egner seg ikke lett til å overvåke celleadferd mens cellene invaderer hjernevev i disse xenograftmodellene. Likevel har chick embryo xenograft-modellen vist at adhesjonsproteinet L1CAM spiller en stimulerende rolle i den invasive evnen til humane T98G GBM-celler 2,5.
En passende løsning på dette problemet kan oppnås ved å bygge bro mellom både in vivo og in vitro-metoder ved hjelp av en organotypisk hjerneskivekulturmodell, referert til som en ex vivo-modell. I denne ex vivo-modellen kan levende hjernevev opprettholdes i en tykkelse på flere hundre mikron i opptil noen uker, noe som gjør det mulig å implantere kreftceller, observere deres oppførsel i faktisk vev over tid, og deretter utføre en mer detaljert markøranalyse ved eksperimentets sluttpunkt.
En populær organisk skivekulturmetode har vært å dyrke en flere hundre mikron tykk hjerneskive på toppen av en gjennomsiktig eller gjennomsiktig porøs membran, slik at vevet blir utsatt for luft, men likevel tillater næringsmedier å opprettholde vevet fra under membranen (se Stoppini et al.6). Ulike varianter av denne metoden har blitt brukt til forskjellige studier, inkludert bruk av forskjellige medier eller forskjellige membraninnsatser. Ulike membraninnsatser inkluderer en 30 mm diameter, porøs (0,4 μm) membraninnsats i en 35 mm kulturskål 6 og cellekulturinnsatser (0,4 μm) for 6-brønnsplater7. Ulike medier inkluderer 50 % MEM/HEPES + 25 % varmeinaktivert hesteserum + 25 % Hanks balansert saltløsning (HBSS)8, 50 % redusert serummedium + 25 % hesteserum + 25 % HBSS9, samt andre. Hvis en gjennomsiktig eller gjennomsiktig membran brukes sammen med fluorescerende merkede GBM-celler, kan slike kulturer avbildes nedenfra ved hjelp av et omvendt bredfelt eller konfokalfluorescensmikroskop 10,11,12,13,14,15.
Mens mange in vivo ortotopiske hjernesvulst xenograft og ex vivo organotypiske hjerneskivekulturmodeller har blitt etablert ved bruk av gnagere, som nevnt ovenfor, har kyllingembryoet (Gallus gallus) blitt underutnyttet til disse formålene. Imidlertid har kyllingembryoet vist seg å være i stand til å bli brukt som en in vivo ortotopisk xenograftmodell for studier av både human og rotte glioma invasjon 1,2,5. Xenografted celler i kyllingembryohjerner har vist invasjonsmønstre som ligner de som er observert i gnagermodeller, noe som ytterligere støtter bruken av kyllingembryoer som en in vivo-modell for GBM-tumorcelleanalyse. Chick embryoer er også billige, kan lettere vedlikeholdes enn gnagere (dvs. i eggeskallene i en laboratorieinkubator), og er mye lettere å jobbe med, noe som gjør dem til et attraktivt alternativ for kortsiktige in vivo GBM-studier. En nylig artikkel har beskrevet bruken av kyllingembryohjerneskivekulturer for dannelse og vekst av aksoner under normal hjerneutvikling der skivene var levedyktige i minst 7 dager16. Imidlertid mangler bruken av slike kyllingembryohjerneskivekulturer for ex vivo-analyse av GBM-celleadferd i et vevsmiljø. I denne artikkelen beskrives både transplantasjon av humane GBM-celler og GBM-stamceller (GSC) i den tidlige kyllingembryohjernen in vivo, samt innføring av GBM-celler på levende kyllingembryohjerneskivekulturer ex vivo. Noen representative eksempler på de resulterende svulster og celleinvasjonsmønstre oppnådd fra disse preparatene er også gitt.
Kritiske trinn i protokollen for injeksjon av celler i midthjernen (optisk tektum) ventrikkel inkluderer ikke skade blodkarene i chorioallantoic membranen i egget eller omgir embryoet før og under injeksjon, selv om amnionmembranen umiddelbart rundt embryoet kan trekkes forsiktig og holdes for å plassere hodet når du injiserer cellene i midtveien. Amnion er relativt tøff og kan trekkes med fine tang for å plassere hodet og holde det stødig med den ene hånden, for injeksjon av celler med den andre hånden inn i optisk tektum, som er den store, runde strukturen i midten av hjernen. Generelt varierer levedyktigheten til injiserte embryoer fra 25% til 75%, avhengig av ukjente faktorer, og praktisk talt hvert embryo som overlever inneholder minst en liten svulst i optisk tektum. Kritiske trinn i å generere levedyktige hjerneskiver inkluderer blotting vevet av overflødig væske slik at agarose fester seg til hjernen under skiver og for å holde vev og skiver kaldt til plassert på membraninnsatsen. Siden forskjellige celletyper danner sfæroider forskjellig (i hastighet og størrelse), bør den belagte celletettheten på poly-HEMA-plater og hvor lang tid det tar før høsting av sfæroider optimaliseres for hver celletype.
Arbeidet her har ikke vært gjenstand for en formell longitudinell studie av hjerneskivens levedyktighet. Yang et al. brukte kyllingembryohjerneskivekulturer som ligner på de som brukes her og viste god levedyktighet av skivene i minst 7 dager16. Tidligere arbeid viste at når OT-vev ble holdt i suboptimale medier, oppstod mange pyknotiske kjerner i vevet, noe som ikke forekom i skivene i arbeidet her. I tillegg, når skiver degenererer under suboptimale forhold, fragmenterer blodkarene og vises som rader av laminin-positive kuler (ikke vist). Således, selv om levedyktigheten her ikke er kontrollert ved metoder som elektrofysiologi eller aktivt caspase-3-uttrykk, oppstod ingen av indikatorene for celledød som ble sett under suboptimale kulturforhold her.
OT har vært fokusert på for in vivo hjernesvulsteksperimenter fordi det er den lettest injiserte regionen med den største ventrikkelen. Ved E5, som er den siste dagen embryoet er lite nok til å forbli tilgjengelig på toppen av eggeplommen, må injeksjoner gjøres i en ventrikkel, da alle hjernegrupper ikke er noe mer enn en tynn ventrikkelsone. Likevel resulterer disse injeksjonene vellykket i innebygde svulster med celler som invaderer hjerneparenkymet. Noen ganger er resulterende svulster funnet i forebrain eller cerebellum, men dette er ikke vanlig. Ex vivo skiver av E15 optisk tektum har primært blitt brukt til eksperimenter her, slik at ex vivo co-kultur resultatene kan korreleres med in vivo injeksjon eksperimenter. Imidlertid er forhjerneskiver også egnet og har et større overflateareal og en veldig tynn ventrikkel sammenlignet med optisk tektum, noe som kan gjøre forhjernen mer egnet for ex vivo-kokulturer som ikke blir korrelert med in vivo-injeksjoner.
Det har her blitt vist at in vivo-injeksjoner , etterfulgt av vevsfiksering, vibrerende vevskutterseksjonering og immunfarging for laminin og andre markører, resulterte i høyoppløselige bilder av GBM-celler og GSC i hjernevev i nærheten av blodkar. Evnen til å bestemme sammenhenger mellom tumorceller og blodkar ble sterkt tilrettelagt ved å lage 3D-volumgjengivelser fra z-stabler av konfokale optiske seksjoner ved hjelp av konfokalprogramvaren og produsentens instruksjoner. Time-lapse-avbildning ved bruk av bredfeltfluorescensmikroskopi av GFP-, mCherry- og DiD-merkede celler var mulig; Imidlertid ble migrerende celler som var i nærheten av de svært fluorescerende sfæroidene noen ganger skjult av “gløden” fra sfæroiden. Denne uønskede effekten kan minimeres noe ved å nøye justere eksponeringstidene for innsamling av bredfeltbilder. Time-lapse-avbildning ved bruk av konfokale z-stacks over tid (4D) eliminerte den ufokuserte gløden fra sfæroidene og resulterte i skarpt definerte migrerende celler med mørk bakgrunn. Dette ble ikke beskrevet i protokollen, men ble utført på samme måte som widefield time-lapse-avbildning, som ble utført mens hjerneskiver var på de gjennomsiktige membraninnsatsene i en 6-brønns plastplate. Selv om konfokal time-lapse-avbildning resulterer i markant klarere bilder av individuelle celler og deres oppførsel, er et flerpunkts time-lapse-eksperiment som samler z-stabler på 10 z-plan / punkt, med 10 minutters intervaller over en 20 timers periode, en omfattende bruk av skannehodegalvanometre. Siden dette kan redusere levetiden til galvanometrene betydelig, brukes denne metoden med omhu.
Selv om kyllingembryosystemet er svært egnet for både in vivo-injeksjon og ex vivo samkultureksperimenter som undersøker GBM-celleadferd, er det flere begrensninger for dette modellsystemet. Som med ethvert xenograftsystem, er miljøet der menneskelige celler implanteres, ikke den menneskelige hjerne, men GBM-celleadferd ser ut til å etterligne det i gnagermodeller og hos menneskelige pasienter. Etter å ha utført in vivo injeksjonseksperimenter på E5, får svulster normalt lov til å danne seg i 10 dager, til E15. Dette er tydeligvis ikke nok tid til å studere alle aspekter av tumorigenese og celleinvasjon. Imidlertid har det blitt påvist her at solide svulster dannes i hjerneparenkymet, celler interagerer og omorganiserer seg i svulsten, og betydelig hjerneinvasjon forekommer både langs blodkar og diffust innenfor denne relativt korte tidsperioden. En annen begrensning for in vivo kyllingembryosystemet er at det ikke er egnet for narkotika eller andre behandlinger på grunn av det store eggeplommen og ekstraembryonale sirkulasjonssystemet som opererer under kyllingembryoutvikling. Aktuelle flytende medikamentelle behandlinger vil resultere i en svært variabel og ukjent konsentrasjon i hjernen på grunn av diffusjon bort fra embryoet til den mye større eggeplommemassen. På samme måte vil intravenøs injeksjon av legemidler i det svært delikate ekstraembryonale sirkulasjonssystemet lekke eller diffundere ut av blodkarene og også resultere i ukjente konsentrasjoner i hjernen. Dette er en av hovedgrunnene til at ex vivo skivekulturmetoden ble tatt i bruk – slik at ikke bare celleadferd kunne observeres og spores via time-lapse-mikroskopi, men også slik at behandlinger som har vært vellykkede med å endre GBM-celleadferd i en tallerken4 , kunne testes i et mer relevant hjernevevsmiljø.
Utviklingen av chick embryo ortotopisk hjernesvulst modellsystem er sett på som et betydelig tillegg til systemene og verktøyene som er tilgjengelige for studiet av GBM-tumordannelse og invasiv celleadferd. Befruktede kyllingegg er sannsynligvis lett tilgjengelige i de fleste områder, de er billige sammenlignet med gnagere, det er ingen dyrepleiekostnader, embryoene er svært motstandsdyktige og motstandsdyktige mot infeksjon (dvs. det meste arbeidet gjøres på en benk), embryoene er svært manipulerbare og kan dyrkes i skallløs kultur19, og kyllingembryoer regnes ikke som virveldyr og krever derfor ikke IACUC-godkjenning av NIHs retningslinjer (institusjonelle krav kan variere). Dermed gjør disse mange fordelene kyllingembryosystemet veldig attraktivt hvis man begrenser sine spørsmål og eksperimenter til de som faller innenfor sine begrensninger. Flere GBM-cellestudier har blitt utført av andre som bruker kyllingembryoet, men disse har nesten utelukkende benyttet chorioallantoisk membran (CAM) av embryoet 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 og lem bud 30, og ikke hjernen. Det har også vært en rapport implantere medulloblastom i kyllinghjernen på E231. Utvilsomt bør bruken av kyllingembryoet som et ortotopisk xenograftmodellsystem, som beskrevet her, gi resultater som er mye mer meningsfulle for menneskelig GBM-tumorbiologi enn studier som bruker CAM.
Selv om disse studiene bare har begynt å utnytte chick embryo hjernesvulstmodellsystemet fullt ut for studier av menneskelig GBM-celle- og GSC-oppførsel, er det håpet at andre vil utvide bruken og finne ytterligere potensielle applikasjoner. Man kan forestille seg at dette systemet ikke bare vil avdekke mekanismer som regulerer GBM-tumordannelse og celleadferd, men også vil tillate preklinisk testing av spesifikke legemidler og stoffer på spesifikke pasienters celler. For eksempel, hvis hjerneskivekulturer ble satt opp på forhånd, kunne tumorceller, stykker fra kirurgiske tumorreseksjoner eller pasientavledede GBM-organoider32 plasseres direkte i ex vivo samkultur, og ulike behandlinger kunne vurderes i løpet av få dager. På samme måte kan dissosierte pasientceller injiseres direkte inn i E5 midbrains i ovo for å vurdere deres evne til å danne svulster og invadere hjerneparenkym. Det er derfor å håpe at beskrivelsene av metodene og representative resultater her vil lette og oppmuntre til økt bruk av dette svært underutnyttede systemet for hjernekreftforskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend til DSG fra National Cancer Institute (R03CA227312) og av et sjenerøst tilskudd fra Lisa Dean Moseley Foundation. Levende GBM-prøver ble innhentet med pasientens samtykke gjennom Tissue Procurement Center ved Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansiering til AR ble gitt av National Center for Research Resources og National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Sommerstipendiat til NP, AL, ZW og KS ble levert av University of Delaware Undergraduate Research Program.
1 cm x 1 cm square hole paper punch | Birabira | N/A | |
1 mm biopsy punch pen | Robbins Instruments | 20335 | |
6 well insert plate (Corning Transwell) | Millipore Sigma | CLS3450 | |
9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
24 well plate | Corning Costar | 3526 | |
50 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
Agar | Fisher BioReagents | BP1423-500 | for embedding fixed brains |
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
Aluminum foil | ReynoldsWrap | N/A | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A-9518 | |
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
anti-laminin monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
B27 supplement without vitamin A | GIBCO | 17504-044 | |
bisbenzimide (Hoechst 33258) | Sigma-Aldrich | B2883 | nuclear stain |
Cell culture incubator | Forma | standard humidified CO2 incubator | |
Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Confocal microscope | Nikon Instruments | C2si+ | With custom-made cell incubator chamber |
Confocal microscope objective lenses | Nikon Instruments | Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging | |
Confocal microscope software | Nikon Instruments | NIS Elements | Version 5.2 |
Curved foreceps | World Precision Intruments | 504478 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | ||
Curved spatula | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | KG-585 12R | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
DiD far red fluorescent dye | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
egg incubator | Humidaire | ||
electrical tape (10 mil thick/254 µm) | Scotch | N/A | |
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
Fast green FCF dye | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
filter paper | Fisher Scientific | ||
Gauze | Dynarex | 3353 | |
Glass Capillaries for microinjection | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP228-1 | for mounting media |
GSCs (human glioblastoma stem cells) | Not applicable | Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector. Cells used were between passage 10 and 30. | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Hausser scientific | ||
Heparin | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
Horse Serum (HI) | Gibco | 26050-088 | |
Human FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
Human TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
Inverted phase contrast microscope | Nikon Instruments | TMS | for routine viewing of cultured cells |
KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
Laboratory film | Parafilm | ||
Labquake Shaker | LabIndustries | T400-110 | |
L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-products | 400-110 | |
Low-melt agarose | Fisher Scientific | BP1360 | for embedding live brains |
Matrix | Corning Matrigel | 354234 | |
Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
MEM | Corning | 10-010-CV | |
Metal vibratome block | |||
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) | Fisherbrand | ||
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) | Gilson | ||
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) | Fisherbrand | 12544A | |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | 526-M | |
N-propyl gallate | Sigma Aldrich | P3130 | for mounting media |
Parafilm | Parafilm | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
Pencil | |||
Plain Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Plastic 35 mm Petri dish | Becton Dickinson | 351008 | |
pneumatic picopump | World Precision Intruments | PV830 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | P-3932 | |
razor blade- double edge | PACE | for cutting fixed brain slices | |
sapphire knife | Delaware Diamond Knives | for cutting live brain slices | |
Scalpel | TruMed | 1001 | |
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Specimen chamber for vibratome | custom-made | ||
Stereo Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | Equipped with epifluorescence |
straight foreceps | World Precision Intruments | 500233 | |
straight scissors | Fine Science Tools | ||
Sucrose | Mallinckrodt | 7723 | |
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) | Nikon Instruments | TE2000-E | With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006) |
Tissue culture dish polystyrene 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | for cell culturing |
Tissue culture dish polystyrene 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | for cell culturing |
Transfer pipette | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
Transparent tape | Scotch | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
U-118 MG human GBM cell line | ATCC | HTB-15 | Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry. Passage numbers are unknown. |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
Vibrating tissue slicer | Vibratome | 3000 | for cutting live and fixed brain slices |