Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Använda kycklingembryohjärnan som modell för in vivo- och ex vivo-analyser av humant glioblastomcellbeteende

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65199
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care, 3Department of Neurosurgery, Winthrop P. Rockefeller Cancer Institute, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Chick embryon används för att studera humana glioblastom (GBM) hjärntumörer i ovo och i ex vivo brain slice samkulturer. GBM-cellbeteende kan registreras genom time-lapse-mikroskopi i ex vivo-samkulturer, och båda preparaten kan analyseras vid experimentell slutpunkt genom detaljerad 3D-konfokalanalys.

Abstract

Kycklingembryot har varit ett idealiskt modellsystem för studier av ryggradsdjurens utveckling, särskilt för experimentella manipulationer. Användningen av kycklingembryot har utvidgats för att studera bildandet av humant glioblastom (GBM) hjärntumörer in vivo och tumörcellernas invasivitet i omgivande hjärnvävnad. GBM-tumörer kan bildas genom injektion av en suspension av fluorescerande märkta celler i E5-mellanhjärnan (optisk tektum) ventrikel i ovo.

Beroende på GBM-cellerna bildas kompakta tumörer slumpmässigt i ventrikeln och inom hjärnväggen, och grupper av celler invaderar hjärnväggsvävnaden. Tjocka vävnadssnitt (350 μm) av fast E15 tecta med tumörer kan immunfärgas för att avslöja att invaderande celler ofta migrerar längs blodkärlen när de analyseras genom 3D-rekonstruktion av konfokala z-stackbilder. Levande E15 mellanhjärna och framhjärnskivor (250-350 μm) kan odlas på membraninsatser, där fluorescerande märkta GBM-celler kan införas på icke-slumpmässiga platser för att tillhandahålla ex vivo-samkulturer för att analysera cellinvasion, som också kan inträffa längs blodkärl, under en period av cirka 1 vecka. Dessa ex vivo-samkulturer kan övervakas med widefield eller konfokal fluorescens time-lapse-mikroskopi för att observera levande cellbeteende.

Samodlade skivor kan sedan fixeras, immunfärgas och analyseras med konfokalmikroskopi för att avgöra om invasionen inträffade längs blodkärl eller axoner. Dessutom kan samodlingssystemet användas för att undersöka potentiella cell-cellinteraktioner genom att placera aggregat av olika celltyper och färger på olika exakta platser och observera cellrörelser. Läkemedelsbehandlingar kan utföras på ex vivo-kulturer , medan dessa behandlingar inte är kompatibla med in ovo-systemet . Dessa två kompletterande tillvägagångssätt möjliggör detaljerade och exakta analyser av humant GBM-cellbeteende och tumörbildning i en mycket manipulerbar ryggradsdjurs hjärnmiljö.

Introduction

In vitro-studier av cancercellsbeteenden används ofta för att dissekera potentiella mekanismer som fungerar under det mer komplexa beteendet som observeras under tumörbildning och cellinvasion i in vivo xenograftmodeller. Till exempel, med glioblastom (GBM), in vitro-studier har avslöjat mekanismer för hur L1CAM potentiellt fungerar under tumörbildning och hjärninvasion i en ny chick embryo xenograft hjärntumör modell 1,2,3,4,5. Även om in vitro- och in vivo-experiment kompletterar varandra på användbara sätt, lämnar de ett betydande gap i hur resultaten kan korreleras. Till exempel är mekanistiska analyser av GBM-cellmotilitet på en maträtt en mycket artificiell situation, och in vivo xenograftmodeller kan bara avslöja statiska tidpunkts- eller slutpunktsanalyser av tumörbildning och cellbeteende. In vivo-studier med antingen gnagare eller kycklingembryon lämpar sig inte lätt för att övervaka cellbeteende medan cellerna invaderar hjärnvävnad i dessa xenograftmodeller. Ändå har xenograftmodellen för kycklingembryo visat att adhesionsproteinet L1CAM spelar en stimulerande roll i den invasiva förmågan hos humana T98G GBM-celler 2,5.

En lämplig lösning på detta problem kan nås genom att överbrygga både in vivo- och in vitro-metoder med hjälp av en organotypisk hjärnskivodlingsmodell, kallad ex vivo-modell. I denna ex vivo-modell kan levande hjärnvävnad bibehållas vid en tjocklek av flera hundra mikron i upp till några veckor, vilket gör det möjligt att implantera cancerceller, observera deras beteende i verklig vävnad över tid och sedan utföra en mer detaljerad marköranalys vid experimentets slutpunkt.

En populär organotypisk skivodlingsmetod har varit att odla en flera hundra mikron tjock hjärnskiva ovanpå ett genomskinligt eller transparent poröst membran, vilket lämnar vävnaden utsatt för luft, men ändå tillåter näringsmedier att upprätthålla vävnaden under membranet (se Stoppini et al.6). Olika varianter av denna metod har använts för olika studier, inklusive användning av olika medier eller olika membraninsatser. Olika membraninsatser inkluderar en 30 mm diameter, porös (0,4 μm) membraninsats i en 35 mm odlingsskål6 och cellodlingsinsatser (0,4 μm) för 6-brunnsplattor7. Olika medier inkluderar 50% MEM / HEPES + 25% värmeinaktiverat hästserum + 25% Hanks balanserad saltlösning (HBSS)8, 50% reducerat serummedia + 25% hästserum + 25% HBSS9, liksom andra. Om ett genomskinligt eller transparent membran används tillsammans med fluorescerande märkta GBM-celler, kan sådana kulturer avbildas underifrån med hjälp av ett inverterat widefield eller konfokalt fluorescensmikroskop 10,11,12,13,14,15.

Medan många in vivo ortotopiska hjärntumörxenograft och ex vivo organotypiska hjärnskivodlingsmodeller har etablerats med gnagare, som nämnts ovan, har kycklingembryot (Gallus gallus) underutnyttjats för dessa ändamål. Kycklingembryot har dock visat sig kunna användas som en in vivo ortotopisk xenograftmodell för studier av både humant och råttgliominvasion 1,2,5. Xenotransplanterade celler i kycklingembryohjärnor har uppvisat invasionsmönster som liknar dem som observerats i gnagarmodeller, vilket ytterligare stöder användningen av kycklingembryon som en in vivo-modell för GBM-tumörcellanalys. Chickembryon är också billiga, kan lättare underhållas än gnagare (dvs. i sina äggskal i en laboratorieinkubator) och är mycket lättare att arbeta med, vilket gör dem till ett attraktivt alternativ för kortvariga GBM-studier in vivo. En ny artikel har beskrivit användningen av kycklingembryo hjärnskivkulturer för bildning och tillväxt av axoner under normal hjärnutveckling där skivorna var livskraftiga i minst 7 dagar16. Användningen av sådana kycklingembryo hjärnskivkulturer för ex vivo-analys av GBM-cellbeteende i en vävnadsmiljö saknas dock. I denna artikel beskrivs både transplantation av humana GBM-celler och GBM-stamceller (GSC) i den tidiga kycklingembryohjärnan in vivo, liksom införandet av GBM-celler på levande kycklingembryo-hjärnskivkulturer ex vivo. Några representativa exempel på de resulterande tumörerna och cellinvasionsmönstren erhållna från dessa preparat tillhandahålls också.

Protocol

Inget godkännande eller godkännande behövdes vid University of Delaware för att utföra detta arbete.

1. GBM-cellinjektion i chick optic tectum

  1. Beredning av GSC och GBM-celler för injektion
    1. Generalsekretariat för kultur i generalsekretariatets medier (tabell 1). Kultur etablerade GBM-cellinjer i GBM-media (tabell 1).
    2. Skölj cellerna på plattor med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och placera 1 ml trypsinlösning i en 10 cm skål. Lämna i en cellodlingsinkubator i 2-3 minuter tills cellerna börjar lossna.
    3. Inaktivera trypsinet genom att tillsätta 10 ml lämpligt seruminnehållande odlingsmedium i 10 cm-skålen och lossa cellerna genom pipettering upp och ner. Placera cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt centrifugrör.
    4. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 800 × g i 5 min vid 4 °C.
    5. Aspirera mediet från cellpelleten med en engångspipett av fint glas fäst vid en sidoarmkolv och vakuumpump. Resuspendera cellerna i lämpliga odlingssubstrat till en koncentration av 10 000 celler per mikroliter och placera i ett mikrofugerör eller litet skruvrör på is.
    6. Blanda cellerna med en liten mängd sterilt 1% Fast Green FCF-färgämne (använd ett förhållande på 5 μL färgämne/100 μL cellsuspension).
  2. Injektion av GBM-celler i E5 optisk tektum i ovo. Se kompletterande figur 1.
    1. Inkubera de befruktade kycklingäggen i en fuktad ägginkubator med den spetsiga änden nedåt vid 37,5 °C (den första inkubationsdagen är embryonal dag 0 [E0]). På den 6: e inkubationsdagen (E5), sterilisera äggskalet genom sprutning med 70% etanol.
    2. Använd en äggljus, spåra längs omkretsen av luftrummet ovanför embryot med en penna och täck det skisserade området med transparent tejp.
    3. Använd böjd sax, skär försiktigt runt det spårade området, var försiktig så att du inte skär in i embryonala membran eller blodkärl och kassera toppen av äggskalet.
    4. Placera några droppar saltlösning eller cellodlingsmedia på luftrumsmembranet för att blöta det så att det lätt lossnar. Använd fina pincett, genomborra försiktigt luftrumsmembranet över toppen av embryot, ta bort det och lokalisera kycklingembryots huvud.
    5. Använd fina pincett för att ta tag i det transparenta amnionmembranet som omedelbart omger embryot för att placera huvudet så att det optiska tektum kan injiceras med celler. Använd med ena handen de fina pincetterna för att hålla i amnionen för att hålla huvudet på plats under injektionsprocessen. Var försiktig så att du inte skadar de extraembryonala blodkärlen i chorioallantoic membranet på äggulan.
      OBS: Ovanstående procedur kräver lite övning för att effektivt kunna ta tag i det klara amnionmembranet som omger embryot, eftersom det är osynligt tills det grips och dras. Öva på att använda fina pincett för att ta tag i det klara amnionen som omedelbart omger embryot.
    6. Håll huvudet stadigt genom att ta tag i amnionmembranet med fina pincett. Med hjälp av en glasmikropipett och en pneumatisk pikopump injiceras cirka 50 000 celler i 5 μL lämpligt cellodlingsmedium i optic tectum (5 μL är ungefär 1/2 av en fylld mikropipett).
      OBS: Se Cretu et al.1 för en bild av ett E5-embryo som har injicerats med GBM-celler blandade med färgämne.
    7. Placera några droppar 50 mg / ml ampicillin ovanpå embryot.
    8. Täck hålet i toppen av ägget med klar tejp och låt stå i luftfuktare tills E15 för dissektion.

2. Dissektion av hjärnregioner från E15-embryon

OBS: Dissektionen av E15-hjärnor här för fixering liknar den som beskrivs i steg 8.2 för levande hjärnskivor, men dissektionen här behöver inte göras under aseptiska förhållanden.

  1. Klipp bort tejpen runt toppen av skalet, så att du får tillgång till embryot.
  2. Halshugg embryot vid halsen och placera huvudet i en 10 cm skål med steril kalcium- och magnesiumfri Tyrodes (CMF Tyrodes) lösning. Se kompletterande figur 2.
  3. Använd fina pincett, skala bort huden som täcker hjärnan för att avslöja den underliggande dura materen. Ta bort de bildande skallbenen på vänster och höger sida av hjärnan. De bildande skallbenen täcker ännu inte majoriteten av hjärnan.
  4. Använd försiktigt fina spetsiga pincett för att riva igenom hjärnhinnorna som ligger över hjärnans centrum och skala den till varje sida för att avslöja hjärnan.
  5. Använd böjda pincett för att skopa hjärnan underifrån och dra den försiktigt ur sin hålighet.
  6. Dissekera hjärnan i dess delar: framhjärna, tecta, cerebellum.
  7. Ta bort den överliggande pia mater från tecta med fina pincett. Observera att pia skiljer sig lätt från tecta, men inte från framhjärnan eller cerebellum. Ta bort pia från framhjärnan genom att röra vid den eller rulla den på en liten bit filterpapper.
  8. Placera de dissekerade hjärnregionerna i en liten skål.
  9. Placera hjärnregionerna för fixering i en 24-brunnsplatta och fixera i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M natriumkakodylatbuffert. Låt stå i minst 24 timmar vid 4 °C.
  10. Efter fixering, skölj vävnaden i 3x PBS under minst 1 timme innan du bäddar in i agar.

3. Inbäddning och skivning av skördade hjärnregioner

  1. Förvärm en lösning av 3,5% agar och 8% sackaros i PBS tills den smälts och håll den vid smälttemperatur.
  2. Använd böjda pincett som en skopa, plocka försiktigt upp antingen optisk tektum eller framhjärnregion i kycklingembryohjärnan och tappa något på filterpapper för att avlägsna extra vätska för att säkerställa vidhäftning av agar till den yttre hjärnytan.
  3. Fyll formen med agarlösning med en steril överföringspipett.
    OBS: En enkel form kan tillverkas genom att bilda aluminiumfolie runt ett föremål av lämplig storlek, såsom små rektangulära metallvibrerande vävnadsskivblock.
  4. Placera hjärnregionen i agar och låt agaren stelna helt.
  5. Ta bort aluminiumfolien från den inbäddade hjärnan och trimma överflödig agar runt sidorna med ett rakblad eller skalpell.
  6. Lägg en droppe cyanoakrylatlim på skivplåtens rostfria stål, placera agarosblocket med hjärnan på limet och låt limet binda i 1 minut. Placera brickan i den vibrerande vävnadsskivaren, dra åt och fyll brickan med tillräckligt med PBS för att täcka toppen av agarblocket.
  7. Skär hjärnskivorna på en vibrerande vävnadsskivare med en tjocklek på 350 μm med ett rakblad av stål.
  8. När hjärnskivor skärs och flyter fritt i skivplåten, använd en spatel för att skopa upp och ta bort skivorna från brickan. Skjut försiktigt av sektionen från spateln och in i en märkt 10 cm petriskål med PBS så att sektionerna flyter fritt.
    OBS: Agar som omger hjärnskivan kan lossna om hjärnan inte är tillräckligt blottad med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska före inbäddning. Om detta inträffar kan hjärnvävnaden försiktigt avlägsnas från den stelnade agaren och återinbäddas efter korrekt blottning av överskottsvätska.

4. Immunfärgning av hjärnskivor med tumörceller

  1. Använd ett stereomikroskop utrustat med epifluorescens, screena enskilda skivor i 10 cm skålen en efter en för närvaro eller frånvaro av tumörceller.
  2. Bered en tillräcklig mängd fosfatbuffrad saltlösning med 0,1 % Triton X-100 och 5 % normalt getserum (PBSTG) (se tabell 1) för immunfärgning och skölj skivorna som ska immunfärgas.
  3. Halvfyllningsbrunnar i en 24-brunnsplatta som kommer att användas för färgning av hjärnsektioner med PBS.
  4. Klipp av hörnen av agar runt hjärnskivorna med kanten på en spatel eller en skalpell och placera dem försiktigt i brunnarna som innehåller PBS.
  5. Aspirera PBS och ersätt med 350 μl primär antikroppsfärgningslösning i PBSTG (t.ex. 2 μg/ml UJ127 i PBSTG).
  6. Inkubera i 24 timmar i ett kallt rum med försiktig omrörning så att skivan ses röra sig fritt i brunnen.
  7. Efter 24 timmar, avlägsna den primära antikroppslösningen och skölj 3 x 1 timme med PBSTG i ett kallt rum med omrörning.
  8. Efter avslutad sköljning, inkubera sekundär antikroppsfärgningslösning i PBSTG i 350 μl/brunn (t.ex. 1/200 spädning av biotin-GAM i PBSTG). Inkubera i 20 timmar i ett kallrum med omrörning.
    OBS: Om du föregår det tertiära steget och inkuberar med den fluorkrominnehållande sekundära antikroppen i detta steg, täck över för att skydda mot ljus under inkubationen nu och hoppa sedan till steg 4.11.
  9. Ta bort den sekundära antikroppslösningen och skölj 3 x 1 h i PBSTG i ett kallt rum med omrörning.
  10. Ta bort PBSTG och inkubera i tertiär lösning (t.ex. 1:250 spädning av Alexa Fluor 647 streptavidin i PBSTG). Om så önskas, färga kärnorna i detta steg genom att tillsätta 0,1 μg/ml bisbensimid till blandningen. Inkubera i 20 timmar i ett kallrum med omrörning.
  11. Ta bort tertiärlösningen och skölj 3 x 1 h i PBSTG i ett kallt rum med omrörning.
  12. Lämna i PBS tills det är klart att montera på mikroskopglas.

5. Montera skivor på mikroskopglas

  1. Förbered så många mikroskopglas som det finns sektioner att montera.
  2. För varje bild, placera en 50 mm lång remsa av 10 mil (254 μm) tjock vinyl elektrisk tejp på en bit parafilm.
  3. Använd en 1 cm x 1 cm fyrkantig hålstans och slå ett hål genom mitten av den elektriska tejpen och parafilmen.
  4. Dra bort tejpen från parafilmen och placera den ovanpå mikroskopglaset, vilket ger utrymme för märkningstejp på bilden.
  5. Använd en mikropipett och placera en eller två droppar anti-fade monteringsmedia i det fyrkantiga hålet i mitten av den elektriska tejpen.
  6. Använd en böjd spatel för att lyfta den önskade vibrerande vävnadsskivsektionen från PBSTG och transportera bort fukt noggrant med en ren laboratorieduk eller filterpapper.
  7. Tryck på skivans kant till monteringsmedlets droppe och använd en annan spatel för att försiktigt skjuta in sektionen i monteringsmediet.
  8. Täck sektionen med några droppar monteringsmedel och placera försiktigt ett täckglas på 24 mm x 30 mm (# 1,5 tjocklek) ovanpå sektionen och fästet.
  9. Försegla kanterna på täckglaset med nagellack för att hålla det på plats.

6. Konfokalmikroskopi av fasta hjärnskivor

  1. Använd widefield fluorescens för att hitta fluorescerande tumörer i den monterade hjärnskivan med hjälp av lämplig objektivlins och filteruppsättning(ar).
    OBS: Vissa tumörer kan vara ganska stora och är lätt synliga med 4x-målet, medan enskilda celler kan kräva 10x-målet.
  2. Byt till konfokalmikroskopi med lämplig objektivlins, laser, hålstorlek och detektorinställningar. För att följa detta protokoll, använd ett 20x mål (numerisk bländare [N.A.] = 0,75) för rutinmässig avbildning och ett 60x oljemål (N.A. = 1,40) för högupplöst bildbehandling.
  3. Ställ in övre och nedre gränser för z-axeln och stegstorlek (för den specifika situationen enligt konfokalmikroskoptillverkarens instruktioner) för att förvärva optiska sektioner. Skaffa en z-stack med optiska sektioner.
  4. Använd konfokalmikroskopprogramvaran för att skapa en 3D-volymåtergivning av tumören, enligt tillverkarens instruktioner.

7. Sfäroidpreparat

  1. Skapa poly(2-hydroxietylmetakrylat) (poly-HEMA) plattor
    1. Skapa en lösning av 10 μg/ml poly-HEMA i 95 % etanol och täck 35 mm petriskålar (eller cellodlingsskålar) med 1 ml av denna lösning.
    2. Låt diskarna sitta på en vippa utan lock över natten vid rumstemperatur för att utveckla en beläggning av skålytan.
      OBS: Lösningsmedlet avdunstar och lämnar en genomskinlig beläggning på skålen, vilket kan verka ojämnt, men detta påverkar inte förmågan att göra cellsfäroider.
    3. Efter torkning, sterilisera de öppna diskarna under UV-ljus i ett biosäkerhetsskåp i 1 timme. Sätt tillbaka locken efter sterilisering. De belagda faten är nu klara att användas.
  2. Fluorescerande DiD-färgning för time-lapse-mikroskopi
    OBS: Detta avsnitt är för färgning av enskilda celler med DiD-fluorescerande färgämne som ska användas för att göra sfäroider, vilket optimerar visualisering av cellmotilitet för levande time-lapse-avbildning.
    1. Suspendera cellerna i ett serumfritt odlingsmedium.
    2. Tillsätt 5 μl DiD-stam/ml cellsuspension och blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera i 20 minuter vid 37 °C.
    3. Centrifugera den märkta cellsuspensionen vid 800 × g vid 5 °C i 5 minuter.
    4. Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i varma medier för att skölja.
    5. Upprepa centrifugeringen och skölj steget två gånger till.
      Om så önskas, hoppa till steg 7.3.6 för att göra sfäroider omedelbart efter denna process.
  3. Göra cellsfäroider
    1. Värm upp 0,25% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning till 37 ° C.
    2. Odlings-GSC i GSC-media17 (tabell 1) och U-118 maligna gloima-celler (MG) i U-118-odlingsmedium (se tabell 1). Använd en sammanflytande 10 cm skål för beredning av en 35 mm platta sfäroider. Lägg till bFGF (10 ng/ml slutlig koncentration) och TGF-α (20 ng/ml slutlig koncentration) tillväxtfaktorer till GSC initialt och sedan var 3:e dag.
      OBS: Cellerna som användes i den aktuella studien var grön GSC15-2/K72, grön GSC16-4/K72, röd U-118/L1LE/mCherry2x och röd U-118/1879/mCherry2x. En platta sfäroider bör vara tillräcklig för två 6-brunnsplattor av hjärnskivor på membraninsatser.
    3. Skölj cellerna på plattorna med steril PBS och placera 1 ml trypsinlösning på en 10 cm skål. Placera i cellodlingsinkubatorn i 2-3 minuter tills cellerna börjar lossna.
    4. Inaktivera trypsinet genom att tillsätta 10 ml lämpligt seruminnehållande odlingsmedium i 10 cm-skålen och lossa cellerna genom pipettering upp och ner. Placera cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt centrifugrör.
    5. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 800 × g i 5 min vid 4 °C.
    6. Aspirera mediet från cellpelleten och resuspendera cellerna i 10 ml media.
    7. Placera 2 ml cellsuspension på varje 35 mm poly-HEMA-belagd skål och tillsätt ytterligare 2 ml lämpligt medium för att erhålla 4 ml totalt medium per skål. Om du använder globala leveranskedjor, lägg till tillväxtfaktorer.
    8. Inkubera cellerna i en cellinkubator tills aggregaten når en storlek på 100-200 μm, vilket kan vara 1-2 dagar beroende på densiteten hos cellerna som pläterades.

8. Levande kycklingembryo hjärndissektion och vibrerande vävnadsskivning

  1. Förberedelse för dissektion
    1. Förbered en 6-brunns polyestermembraninsatsplatta med 1 ml hjärnskivodlingsmedia (se tabell 1) under membraninsatsen.
    2. Sterilisera arbetsområdet och verktygen med 70% etanol.
    3. Placera 6-brunnsinsatsplattan på is medan dissektionen äger rum.
    4. Förbered 100 ml vibrerande skivmedel för vävnadsskivning (tabell 1) och lägg på is.
    5. Placera en injektionsflaska med 4 % agaros med låg smälthalt i PBS i ett vattenbad tills den smälter till en vätska (ca 50 °C).
    6. Fyll upp det vibrerande vävnadsskivningskaret med is.
  2. Aseptisk E14/15 kycklingembryo hjärndissektion
    1. Använd ett äggljus, spåra längs luftfickans omkrets ovanför E14- eller E15-embryot med en penna och täck det konturerade området med transparent tejp.
    2. Använd böjd eller fin sax, skär försiktigt runt det spårade området, var försiktig så att du inte skär in i embryomembranet eller blodkärlen och kassera det övre skalet.
    3. Använd böjda pincett, ta bort luftrumsmembranet över toppen av embryot och lokalisera kycklingembryots huvud.
    4. Halshugg embryot och placera huvudet i en 10 cm skål med kall steril CMF-lösning. Se kompletterande figur 2.
    5. Använd sterila fina pincett, skala bort huden som täcker hjärnan för att avslöja den underliggande dura materen. Ta bort de bildande skallbenen på vänster och höger sida av hjärnan. De bildande skallbenen täcker ännu inte majoriteten av hjärnan.
    6. Använd försiktigt fina spetsiga pincett (# 5 eller # 55) för att riva igenom hjärnhinnorna som ligger över hjärnans centrum och skala den till varje sida för att avslöja hjärnan.
    7. Använd fina böjda pincett, skopa upp hjärnan från bottenfronten och dra den försiktigt ur hålrummet.
    8. Dissekera hjärnan i dess tre huvuddelar: framhjärna, mellanhjärna (optisk tekta), cerebellum. Konsultera en atlas över kycklingutveckling, om det behövs.
    9. Ta bort den överliggande pia mater från tecta med fina pincett.
      OBS: Pia separerar lätt från tekta, men inte från framhjärnan eller lillhjärnan. Pia kan avlägsnas från framhjärnan genom att röra den eller rulla den på steril gasbindning.
    10. Placera de dissekerade hjärnregionerna i en liten steril skål på is.
  3. Inbäddning och skivning av hjärnan
    1. Använd böjda pincett som en skopa, plocka försiktigt upp antingen optisk tektum eller framhjärnregion och blotta något på steril gasväv för att avlägsna extra vätska för att säkerställa vidhäftning av agarosen till den yttre hjärnytan.
    2. Fyll formen med en steril överföringspipett med agaros med låg smält. Förbered en enkel form genom att bilda aluminiumfolie runt ett föremål av lämplig storlek. Det lilla rektangulära metallvibrerande vävnadsskivblocket används rutinmässigt som föremål. Se kompletterande figur 3.
    3. Placera snabbt hjärnregionen i agaros och låt den stelna (ca 4-5 min) på is.
      OBS: Hjärnan kan sjunka till botten av formen innan agarosen härdar. Om detta inträffar, vänta 1 minut för att låta agaren börja stelna och placera sedan hjärnregionen i agarosen. Försök att avbryta hjärnregionen direkt i mitten av agarosen.
    4. Ta bort aluminiumfolien från den inbäddade hjärnan i den stelnade agarosen och trimma överflödig agaros runt sidorna med ett sterilt rakblad eller skalpell.
    5. Lägg en droppe cyanoakrylatlim på skivformens / brickans rostfria stål, placera agarosblocket med hjärnan och låt limmet binda i 1 minut. Placera skålen/brickan i den vibrerande vävnadsskivaren, dra åt och fyll brickan med skivmedia för att täcka toppen av agarosblocket.
    6. Skär sektionerna på en vibrerande vävnadsskivare vid 250-350 μm med en safirkniv, vilket har rapporterats resultera i mindre levande vävnadsskador än ett rakblad av stål.
    7. När hjärnskivor skärs och flyter fritt i skivplåten, använd en steril spatel för att skopa upp och ta bort skivan från brickan. Skjut försiktigt bort sektionen av spateln och på en membraninsats med en annan steril spatel.
      OBS: Normalt kan två eller tre hjärnskivor placeras på varje membraninsats, om så önskas. Agarosen som omger hjärnskivan kan lossna om hjärnan inte är tillräckligt blottad med steril gasväv för att avlägsna överflödig vätska. Om detta fortfarande inträffar efter tillräcklig blotting före inbäddning, plocka försiktigt upp skivan utan den omgivande agarosen och skjut den på membraninsatsen.
    8. Placera 6-brunnsplattan med hjärnskivor på membraninsatser i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och 5%CO2.
    9. Dagen efter plätering, använd en steril Pasteur-pipett för att aspirera mediet under insatsen (det finns luckor i skärens sidor så att en pipett kan få tillgång till mediet nedan). Tillsätt 1 ml färskt skivmedia till varje brunn under membraninsatsen. Fortsätt att byta media varannan dag därefter.
    10. Vänta några dagar tills hjärnskivorna fäster ordentligt på membraninsatserna och verkar plana ut något. Detta är ett tecken på att skivorna är livskraftiga och redo för introduktion av GBM-celler.

9. GBM-cellintroduktion på hjärnskivor

  1. Sfäroid-metod
    1. När cellsfäroiderna har nått 150-200 μm i storlek, använd en 20 μL mikropipett inställd på 5 μL för att ta bort en till flera sfäroider från deras odlingsskål. Se kompletterande figur 3.
    2. Utvisa försiktigt media med sfäroider på önskad hjärnskiva.
      OBS: Cellsfäroiderna ska vara synliga i pipettspetsen. Att använda en tydlig pipettspets gör dem lättare att se i spetsen. Om sfäroiden faller av hjärnskivan när vätskan släpps, bör en etanolsteriliserad ögonfrans limmad på en tunn träapplikatorpinne användas för att försiktigt knuffa sfäroiden tillbaka på hjärnskivan.
    3. Låt sfäroiderna växa på hjärnskivorna i 2-5 dagar.
      OBS: Begränsningen här verkar vara den eventuella nedbrytningen av blodkärl och hjärnceller i skivan. Nedbrutna blodkärl kommer att visas som diskontinuerliga bollar i skivan när de färgas för laminin.
  2. Biopsi stansmetod
    1. Låt hjärnskivorna fästa genom att se ut att plana ut på membraninsatsen (kan ta 2-5 dagar i odling).
    2. Tina cellmatrisen på is.
    3. Anslut en steril biopsistans med 1 mm diameter till ett vakuumsugrör i cellkulturens biosäkerhetsskåp.
    4. Rör försiktigt hjärnskivan med biopsistansen för att skapa ett 1 mm hål i mitten av hjärnskivan.
      OBS: Vävnaden i biopsistansen kommer att aspireras in i stansen av vakuumet.
    5. Bered en cellmatrissuspension genom att trypsinisera en 60% -70% konfluent 10 cm skål av celler och resuspendera i 10 ml media; Blanda sedan 1 ml av suspensionen med 100 μl matris.
    6. Använd en 20 μL mikropipett och placera 1 μL av cellmatrisblandningen i varje hål i hjärnskivorna.
    7. När cellblandningsplaceringen är klar, placera skålen med hjärnskivor med inbäddade celler tillbaka i inkubatorn och låt matrisen stelna och cellerna potentiellt invadera den omgivande hjärnskivan.

10. Widefield fluorescens time-lapse mikroskopi

  1. Placera avtagbar tejp runt kanten på 6-brunnsplattan för att förhindra avdunstning av mediet och lämna ett litet mellanrum på ena sidan för gasutbyte.
  2. Placera plattorna i en anpassad odlingskammare på ett justerbart automatiserat steg på ett inverterat epifluorescensmikroskop.
    OBS: Kammaren hölls vid atmosfäriska förhållanden på 5% CO2 och 95% luft med hjälp av en gasinjektionsregulator, och temperaturen hölls vid 37 ° C med en varmluftstemperaturregulator och en temperaturkontrollerad steginsats. Se Fotos et al.18 för detaljer om det system som används här.
  3. Med hjälp av lämplig programvara för mikroskopkontroll skapar du ett time-lapse-förvärvsschema som samlar fluorescerande bilder av intresseområdena en gång var 10: e minut i 20 timmar.
    OBS: Om en grön fluorescerande etikett används i celler (t.ex. grönt fluorescerande protein [GFP]), använd sedan den minsta mängd blått excitationsljus som krävs för att visualisera cellerna för att förhindra fototoxicitet. Röda (t.ex. mCherry) och långt röda (t.ex. DiD) etiketter verkar inte ha detta potentiella problem på grund av längre våglängdsexcitation.

11. Immunfärgande hjärnskivor efter time-lapse-mikroskopi

OBS: Detta immunfärgningsprotokoll är optimerat för färgning av blodkärl med laminin och kärnor med bisbensimid. Använd lämpliga antikroppar för de önskade molekylerna av intresse.

  1. Aspirera mediet under membraninsatsen med en pasteurpipett och placera 1 ml 2% PFA i 0,1 M natriumkakodylatbuffert under insatsen och 1 ml ovanpå insatsen för att täcka hjärnskivan. Låt skivorna fixera över natten vid 4 °C.
  2. Ta bort fixeringsmedlet under membraninsatsen och eventuellt fixeringsmedel kvar på hjärnskivan (fixeringsmedel tenderar att läcka genom membraninsatsen i brunnen nedan).
  3. Ta bort insatsen med skivor från 35 mm-brunnen och lägg dem i en större plastform.
  4. Förbered en platta med 24 brunnar genom att tillsätta 350 μL PBS i lika många brunnar som det finns hjärnskivor (en skiva / brunn vid immunfärgning).
    1. Använd en tunn spatel, ta försiktigt bort agarosen från runt hjärnskivan utan att lossa hjärnskivan från membraninsatsen. Se till att agarosen lätt lossnar från hjärnskivans ytterkant. Om inte, lämna agarosen fäst vid hjärnskivan.
    2. Använd en skarp skalpell och skär genom membranet runt hjärnskivan tills skivan med det underliggande membranet är fri från resten av insatsen. Plocka upp membranet med den bifogade hjärnskivan, använd fina pincett för att ta tag i membranet och placera det i en brunn på 24-brunnsplattan i PBS.
  5. Skölj skivorna 3x med PBS under 1 timme i kylrummet med konstant försiktig omrörning eller gungning, så att skivan rör sig i brunnen.
  6. Under sköljning, förbered den primära antikroppslösningen.
    1. Späd antilaminin till 2 μg/ml i PBSTG (se tabell 1).
  7. Ta bort PBS från brunnarna och inkubera över natten i primär antikroppslösning i ett kallt rum med mild omrörning.
  8. Efter minst 20 timmars inkubation, aspirera den primära antikroppslösningen och skölj sektionerna 3x i 1 timme i PBSTG.
  9. Förbered den sekundära antikroppslösningen under sköljning.
    1. Späd fluorescerande GAM med den specifika fluorokrom som behövs till en spädning på 1:200 i PBSTG tillsammans med en koncentration av bisbensimid på 0,1 μg/ml.
    2. Ta bort PBSTG och inkubera över natten i ett kallt rum med omrörning i den fluorescerande sekundära antikroppslösningen.
    3. Ta bort den sekundära antikroppen och skölj 2x över 1 timme i PBSTG och 1x över 1 timme i PBS.
    4. Lämna i PBS tills det är klart att montera på mikroskopglas (avsnitt 5) och visa.

Representative Results

Här presenteras flera figurer för att visa några representativa resultat som erhölls genom att utföra in vivo-injektioner i optic tectum (figur 1 och figur 2), odla levande hjärnskivor och bedöma deras livskraft (figur 3), skapa ex vivo hjärnskivkulturer och implantera fluorescerande märkta celler med biopsistansmetoden (figur 4), generera cellsfäroider genom att odla celler på poly-HEMA (figur 5), skapa ex vivo hjärnskivsamkulturer med cellsfäroider och registrera det invasiva cellbeteendet med hjälp av 4D-konfokal time-lapse-mikroskopi (figur 6) och analysera invasivt cellbeteende från sfäroider i förhållande till blodkärl i fasta hjärnskivpreparat (figur 7 och figur 8). Dessa resultat är inte på något sätt uttömmande, utan ger snarare goda exempel på vad som kan erhållas med hjälp av kycklingembryohjärnan som en xenograftmodell för mänsklig GBM-forskning.

Figur 1 visar några representativa resultat av tumörer som bildades i optic tectum in vivo efter injektion av GSC som uttrycker GFP. GSC fäster vid den ventrikulära ytan och bildar invasiva tumörer i hjärnväggen. Generalsekretariaten finns tydligt nära blodkärlen och verkar migrera längs dem. Filmer av roterande 3D-volymrenderingar av fasta och immunfärgade skivor av in vivo GSC-tumörer ges i kompletterande video S1, kompletterande video S2, kompletterande video S3 och kompletterande video S4. I detta experiment användes fyra färger för att identifiera fem funktioner (gröna GSC, vita kärnor, vita blodkärl, blå integrin alfa-6 och antingen röd Sox2 eller röd nestin).

Figur 2 visar några representativa resultat av tumörer som bildades i optic tectum in vivo efter injektion av GSC som uttrycker GFP blandat med U-118 / L1LE-celler2 som uttrycker mCherry på grund av retroviral vektortransduktion. Dessa experiment avslöjade att när dessa tumörer bildades från en blandad cellsuspension, skedde sortering så att GSC bodde antingen i periferin eller mitten, medan U-118-celler bestod av antingen en inre kärna eller en yttre cortex, beroende på den specifika GSC-linjen.

Figur 3 visar viabilitetsresultat för ex vivo brain slice-kulturer. Efter 1 vecka i odling avslöjade fixering och immunfärgning för laminin många intakta blodkärl och uttrycket av Sox2, som båda användes här för att visa livskraften hos hjärnskivan. Detta visade att kycklingembryohjärnskivor kunde odlas på membraninsatser i cirka 2 veckor och förbli livskraftiga med normala blodkärl och transkriptionsfaktoruttryck.

Figur 4 visar resultaten av att införa "pluggar" av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler (blandade med matris) i ex vivo-hjärnskivor efter att ha skapat håligheter i skivorna med biopsistansmetoden. U-118-celler invaderade tydligt hjärnvävnaden, ibland i stor utsträckning och ofta längs blodkärlen. Cellinvasionen var emellertid inte enhetlig runt omkretsen av de införda cellerna. Blodkärl verkade ibland också skadade eller frånvarande i vissa skivor, förmodligen på grund av det extra traumat av stansmetoden eller tiden i kulturen. Detta visade att biopsi punch / cell plug-metoden kunde användas för att införa GBM-celler på specifika platser i en odlad ex vivo-hjärnskiva , varefter cellerna invaderar hjärnskivan.

Figur 5 visar levande sfäroider i odling och flera exempel på widefield-fluorescens av levande GBM-cellsfäroider introducerade på ex vivo-hjärnskivor för time-lapse-experiment. Filmer av cellinvasion från sfäroiderna till hjärnskivan ges i kompletterande video S5 och kompletterande video S6 . Detta visade att cellsfäroider är en annan framgångsrik metod för att introducera GBM-celler eller GSC på specifika platser i en ex vivo-hjärnskiva , och invasivt cellbeteende kan övervakas med widefield fluorescensmikroskopi, även om upplösningen av enskilda celler kan vara dålig.

Figur 6 visar statiska bilder av konfokala timelapse-experiment av levande GSC16-4/GFP och U-118/L1LE/mCherry cell invasion i hjärnskivor. Konfokala z-stackbilder förvärvades var 10: e minut under en 20-timmarsperiod i ett flerpunkts time-lapse-experiment. Filmer av cellinvasion från sfäroiderna till hjärnskivor tagna som konfokala z-staplar över tid presenteras i kompletterande video S7, kompletterande video S8, kompletterande video S9, kompletterande video S10 och kompletterande video S11. Detta experiment avslöjade att konfokal time-lapse-avbildning var överlägsen widefield-fluorescens för att spåra individuellt cellinvasivt beteende. U-118/L1LE-cellerna var märkbart mer invasiva än GSC under dessa förhållanden. Detta är till och med uppenbart i de statiska bilderna, där GSC: erna är placerade mer centralt och U-118-cellerna är mer spridda.

Figur 7 visar flera exempel på ex vivo hjärnskiva / sfäroidpreparat, där två olika separat märkta sfäroider (U-118 / L1LE / mCherry sfäroider och GSC16-4 / GFP-sfäroider) placerades på hjärnskivor, odlades i flera dagar och fixerades därefter, immunfärgades för laminin och avbildades genom optisk snittning på ett konfokalmikroskop. Detta avslöjade att båda celltyperna invaderade hjärnskivan och reste längs blodkärlen. När de olika typerna av sfäroider var tillräckligt nära för att kontakta varandra verkade det finnas liten, om någon, invasion av en celltyp i sfäroiden av den andra celltypen, och sfäroiderna förblev segregerade.

Figur 8 visar flera exempel på ex vivo hjärnskiva/sfäroidpreparat där sfäroider av "blandad celltyp" genererade i odling med användning av två olika märkta celltyper (U-118/L1LE/mCherry blandat med GSC16-4/GFP) placerades på hjärnskivor, odlades i flera dagar och därefter fixerades, immunfärgades för laminin och avbildades genom optisk snittning på ett konfokalmikroskop. Detta avslöjade att de röda U-118 / L1LE / mCherry-cellerna migrerade ut ur sfäroiderna och dispergerade mycket tydligare än de gröna GSC16-4 / GFP-cellerna, som tenderade att förbli i klumpar nära mitten av sfäroiderna. Dessutom färgades U-118 / L1LE / mCherry-celler också med DiD så att de två separata etiketterna (mCherry och DiD) kunde jämföras direkt i de fasta ex vivo-preparaten . DiD-etiketten kunde fortfarande detekteras, även i enskilda celler som hade invaderat hjärnskivan; Detta var dock som intracellulär puncta.

Figure 1
Figur 1: Tumörer vid E15 till följd av injektion av GSC i E5 optic tectum in vivo. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck. GSC15-2-celler visas i panelerna A, C och E, och GSC16-4-celler visas i panelerna B, D och F. (A) Lågförstoringsvy av optisk tektum med en tumör nära ventrikeln (V). Sox2-färgning visas i rött, vilket fläckar de flesta kärnorna i OT-celler. (B) Liknande bild som A men med GSC16-4-celler som också är färgade för nestin i rött, vilket kan se gult eller vitt ut i bilden på grund av färgblandning och bildexponering. OT-kärnor verkar vita på grund av motfärgning med bisbensimid. (C-F) Olika perspektiv på volymåtergivningar genererade från z-staplar med ett 60x oljenedsänkningsmål. Cellkärnor verkar vita på grund av bisbensimidfärgning, och vissa verkar röda i panelerna C och E på grund av immunfärgning för Sox2. Röd färgning i panelerna D och F är från färgning för bo. Observera att på grund av "Alpha Blending" för volymåtergivningar i konfokalmikroskopprogramvaran, blandas inte färger som de skulle använda en maximal intensitetsprojektion, och den vanligaste färgen dominerar och döljer den mindre intensiva färgen. Blodkärlen är färgade vita på grund av immunfärgning för laminin. GSC-markören integrin alpha-6-färgning visas i blått och visas punkterad på GSC-ytor. Mikronskalor visas längs kanterna på volymrenderingarna. Videor av rotationer av volymrenderingar i paneler C-F presenteras i kompletterande video S1, kompletterande video S2, kompletterande video S3 och kompletterande video S4. Skalstänger = 500 μm (A,B). Förkortningar: GSC = glioblastomstamceller; OT = optisk tektum; GFP = grönt fluorescerande protein; BV = blodkärl. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Tumörer vid E15 till följd av en blandning av GSC och U-118 GBM-celler injicerade i E5 optisk tektum. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck och U-118 / L1LE-celler är röda på grund av mCherry-uttryck. GSC15-2 visas i panelerna A-D och GSC16-4 visas i panelerna E och F. (A) Konfokal enkel-z-plan med låg förstoring av en blandad celltumör (pil) nära ventrikeln. Kärnor motfärgas vit med bisbensimid. (B) Högre förstoring (10x objektiv) av tumör som visas i A med invasion av röda U-118-celler i OT nära kammarytan. (C) Ett något annorlunda plan för optisk sektion än det i A som visar tumören (pilen) inbäddad djupare i OT-väggen. (D) Maximal projektion (20x mål) av flera z-plan av tumören i C som visar detaljer om de sorterade cellerna i tumören. (E) Enkel z-planbild (20x objektiv) av en blandad tumör med GSC16-4-celler, som visar att sortering inom tumören inträffade i ett motsatt mönster från GSC15-2-celler, med de gröna GSC: erna som skapade en tunn och jämn cortex som omger de röda U-118-cellerna. Tumörens fästområde på OT-väggen visas inte i detta z-plan. Observera tumörområdet där det finns en diskontinuitet i GSC-cortex med U-118 / L1LE-celler som buktar igenom (pil). Immunfärgning för L1CAM visas i blått. (F) Samma bild som i E, men visar endast de gröna globala kontrollgrupperna och blå L1CAM-färgning. Skalstänger = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Förkortningar: GSC = glioblastomstamceller; OT = optisk tektum; GFP = grönt fluorescerande protein; V = ventrikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Viabilitet för ex vivo optiska tektumskivor efter 1 vecka i odling. E14 optiska tektumskivor odlades på membraninsatser i 1 vecka och fixerades sedan och immunfärgades. Visas i A och B är konfokala bilder (10x objektiv) av en hjärnskiva färgad för kärnor med bisbensimid (A) och immunfärgad för laminin (B), som tydligt visar normala, intakta blodkärl optiskt snittade i olika konfigurationer på grund av lamininfärgningen. (C) En konfokal bild liknande den som visas i panelerna A och B där kärnor och lamininfärgning båda är synliga. (D) En konfokalbild med högre förstoring (60x oljemål) som visar detaljer om kärn- och lamininfärgning. (E) Maximal projektionsbild av konfokal z-stack (20x objektiv) av hjärnskiva färgad för Sox2-transkriptionsfaktor i rött och totala kärnor med bisbensimid i vitt. Observera att majoriteten av kärnorna uppvisar Sox2-färgning, som visas in vivo (se figur 1). Skalstänger = 100 μm (A, B, C, E), 25 μm (D). Förkortning: P = pial yta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: U-118 / mCherry-celler placerade i en ex vivo-hjärnskiva via biopsistansmetoden. Håligheter skapades i hjärnskivor med hjälp av en 1 mm biopsistans, och sedan implanterades röda U-118 / L1LE / mCherry-celler blandade med matris som en "plugg". Efter flera dagar fixerades hjärnskivorna, immunfärgades för laminin och monterades på glas för konfokalmikroskopanalys. Panelerna A och C visar konfokala, enkla z-planbilder med låg förstoring (4x objektiv) av den resulterande "tumören" och omgivande celler som invaderade hjärnskivan. (B) En volymåtergivning av en z-stack från preparatet i panel A vid en högre förstoring (20x objektiv), som visar omfattande invasion av U-118-celler (pil). (D) Bilden visar en liknande volymåtergivning av den nedre delen av de omfattande invaderande cellerna som visas i panel C. Lamininfärgning visas i grönt, men inga tydliga blodkärl är uppenbara. (E) Bilden visar en del av en cellplugg och grupp av celler som har invaderat hjärnskivan, tillsammans med lamininfärgning för blodkärl i blått. (F) En högre förstoring av de invaderande cellerna som visas i panel E, och celler kan tydligt ses inriktade längs blodkärl (pilar). Alla paneler visar vit nukleär motfärgning med bisbensimid. Skalstänger = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). Skalan för panelerna B och D ligger längs volymrenderingsaxlarna. Förkortning: OT = optic tectum. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Levande cellsfäroider i odling och bredfältsfluorescensbilder av levande GBM-celler i ex vivo hjärnskivor. I panelerna A och B visas faskontrastbilder (med ett 10x-mål på ett inverterat mikroskop) av U-118/L1LE GBM-celler (A) och GSC (B) som växer som sfäroider (pilar). I bakgrunden på panel A visas ojämnheterna i poly-HEMA-beläggningen som kan uppstå på cellodlingsskålen. Visas i paneler C-F är widefield fluorescensbilder av U-118 / L1LE cellsfäroider och invaderande celler (pilar) under ett time-lapse-experiment för att övervaka det levande beteendet för invasion i ex vivo-skivorna (med hjälp av ett 20x-mål på ett anpassat time-lapse-mikroskopsystem 18). I panelerna C och E färgas cellerna med det långröda fluorescerande membranfärgämnet DiD, och i panelerna D och F avbildas cellerna via sitt röda mCherry-uttryck. Skalstänger = 100 μm. Videor av widefield fluorescens time-lapse-experiment som visas i panelerna C och D finns i kompletterande video S5 respektive kompletterande video S6. Förkortningar: GBM = glioblastom; GSC = GBM-stamceller; S = sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Volymåtergivningsbilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC:er och GBM-celler. I alla paneler visas slutpunktsbilderna av fem olika blandade cellsfäroidgraveringar på separata hjärnskivor. För paneler A-E togs konfokala z-stackbilder med 10 μm steg var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. Preparaten inkluderade hjärnskivor med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivor odlades på membraninsatser i en 6-brunns plastodlingsskål med hjälp av en extra lång arbetsdistans (ELWD) 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det nödvändiga extra arbetsavståndet. Volymrenderingar genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Timelapse-videor av dessa konfokala volymåtergivningar över tid presenteras i kompletterande video S7, kompletterande video S8, kompletterande video S9, kompletterande video S10 och kompletterande video S11. Förkortningar: GBM = glioblastom; GSC = GBM-stamceller; GFP = grönt fluorescerande protein; NA = numerisk bländare. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Konfokala bilder av fasta hjärnskivor med invasiva GBM-celler från sfäroider av olika celltyper. Gröna sfäroider bestod av GSC16-4 / GFP-celler och röda sfäroider bestod av U-118 / L1LE / mCherry-celler. Visas i paneler A-F är olika vyer av hjärnskivor, på vilka flera röda och gröna sfäroider odlades i flera dagar före fixering och immunfärgning för laminin (blå). Paneler A-C är av samma OT-skiva där A togs med ett 4x mål, och paneler B och C är högre förstoringsvolymrenderingar (20x objektiv) av celler som invaderade hjärnskivan från två av sfäroiderna som visas i panel A. Båda celltyperna invaderade tydligt vävnad längs blodkärlen. Panel D visar en volymrendering (20x mål) av en annan hjärnskiva där två olika sfäroider var belägna nära varandra, och celler från båda ses migrera längs samma blodkärl som ligger mellan dem (pil). Panel E är en hög förstoring (60x oljemål) volym som avslöjar att de gröna cellerna migrerar längs blodkärlets yttre yta, medan de röda blodkropparna migrerar inuti blodkärlet (pil). Infällningen visar en enda optisk sektion i z-planet, där de röda blodkropparna är tydligt omgivna av blå färgning av blodkärlet (pilen) och den gröna cellen är tydligt utanför blodkärlet. Skalstapel i insats = 50 μm. Panel F visar en volymåtergivning (10x mål) av en framhjärneskiva med två tätt placerade olikfärgade sfäroider. Mycket liten, om någon, cellinvasion inträffade från en sfäroid till den andra, och en skarp gräns fanns mellan dem. Panelerna A, B, C och E visar också vit nukleär motfärgning med bisbensimid. Skalstapel = 500 μm (A). Skalor för paneler B-F finns längs volymrenderingsaxlarna. Förkortningar: GBM = glioblastom; GSC = GBM-stamceller; GFP = grönt fluorescerande protein; OT = optisk tektum. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Konfokala bilder av fasta hjärnskivor med invasiva GBM-celler från blandade cellsfäroider och sfäroider märkta med DiD. Panelerna A-D visar volymrenderingar av hjärnskivor som innehöll blandade cellsfäroider bestående av gröna GSC16-4 / GFP-celler och röda U-118 / L1LE / mCherry-celler. Många röda U-118-celler spreds från sfäroiderna och invaderade hjärnskivan i alla riktningar, medan de gröna GSC: erna inte skingrades och förblev på sfäroidernas centrala platser. Panelerna E och F visar ett ex vivo-skivpreparat med röda U-118 / L1LE / mCherry-sfäroider som också är märkta med långrött membranfärgämne DiD (visas som blått). Efter fixering immunfärgades skivan för laminin i grönt. DiD-etiketten var synlig i röda blodkroppar som punkterad färgning (pilar) och var synlig även i celler som hade spridit sig från sfäroiderna längs blodkärlen. Nukleär motfärgning med bisbensimid visas inte i denna figur så att den andra färgningen är tydligare synlig. Skalstänger = 100 μm (E,F). Förkortningar: GBM = glioblastom; GSC = GBM-stamceller; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Medium/lösning Sammansättning
Medier från generalsekretariatet 1:1 blandning av DMEM/F12, 1% fetalt bovint serum (FBS), 15 mM HEPES-buffert, 2 mM L-glutamin, 100 μg/ml penicillin-streptomycin (penna/strep), 2% B27-tillskott utan vitamin A och 2,5 μg/ml heparin.
GBM media DMEM (hög glukos), 10% FBS, penna / strep och 2 mM L-glutamin.
Fixeringsbuffert 2% PFA i 0,1 M natriumkadodylatbuffert
Inbäddning medium 3,5 % agar och 8 % sackaros i PBS
PBSTG 0,1% Triton X-100 + 5% normalt getserum (NGS) i PBS
U-118 MG cellodlingsmedium DMEM + 10% FBS + penna / strep + L-glutamin
hjärnan skiva kultur media 50% MEM + 25% HBSS + 25% Hästserum + B27 + penna/strep + L-glut + 15 mM HEPES buffert
vibrerande skivmedia för vävnadsskivare Medium 199 + penna/strep + 15 mM HEPES buffert

Tabell 1: Sammansättning av medier och buffertar som används i detta protokoll.

Kompletterande figur 1: Injektion i E5 optic tectum. (A) Efter att ett hål har skurits i äggskalet över luftutrymmet och luftrumsmembranet fuktas med saltlösning eller media, avlägsnas membranet med fina pincett. (B) För att injicera celler i optic tectum kläms amnionen och hålls med fina pincett för att placera huvudet så att det optiska tektum är tillgängligt.  Sedan sätts mikropipetten in i det optiska tektumet och celler tryckinjiceras i det. (C) Efter injektion av celler tillsätts några droppar ampicillinlösning ovanpå embryot med hjälp av en spruta och fin nål. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Dissektion av E15-hjärnregioner. (A) Efter halshuggning placeras embryohuvudet E15 i en skål med steril CMF-lösning. (B) Huden som ligger över hjärnan avlägsnas sedan med fina pincett. (C) De två skallbenen avlägsnas sedan från överliggande de två framhjärnhalvorna (FB). (D) Bindväven dura avlägsnas sedan försiktigt från omgivande framhjärnan (FB), optisk tektum och cerebellum. (E) Hela hjärnan avlägsnas sedan från huvudet genom att försiktigt skopa ut den ur hjärnhålan underifrån med hjälp av böjda pincett. (F ) Visas är dorsal vy av hela den borttagna hjärnan med framhjärnan (FB), optisk tektum (OT) och cerebellum (CB). (G ) Den isolerade hjärnan dissekeras sedan i framhjärnan (FB), optisk tektum (OT) hemisfär och cerebellum (CB) med hjälp av fin sax. (H ) Den känsliga bindvävspia avlägsnas sedan lätt från optic tectum (OT) halvklotet med hjälp av fina pincett. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Inbäddning och skivning av E15 optiskt tektum och placering av cellsfäroider. (A) En optisk tektumhalvklot är nedsänkt i agaros med låg smält med hjälp av böjda pincett. (B) Efter att agarosen härdat på is trimmas blocket som innehåller optic tectum och limmas på piedestalen av rostfritt stål i skivformen/brickan. (C) När limmet har torkat placeras skivformen/brickan i chucken på den vibrerande vävnadsskivaren och fylls med kallt skivmedium.  Skivor skärs sedan med safirkniven från det nedsänkta vävnadsblocket.  Skurna skivor flyter ner i skålen/brickan och kan tas bort med en spatel.  (D) Skurna skivor avlägsnas från skålen/brickan och placeras direkt på membraninsatser med underliggande skivodlingsmedia i en flerbrunnsplatta. E) Efter det att cellsfäroider har odlats på poly-HEMA-belagda skålar avlägsnas en sfäroid från skålen i en minimal mängd media med hjälp av en 20 μL mikropipettor. (F) Den isolerade sfäroiden placeras sedan direkt på hjärnskivan i det minimala mediet. (G) Om sfäroiden faller av hjärnskivan på grund av medieflödet, kan den knuffas tillbaka på hjärnskivan med hjälp av en ögonfrans limmad på en träapplikatorpinne. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video S1: Video med hög förstoringsvolym rendering av en liten GSC15-2-tumör vid E15. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck. Video motsvarar figur 1C och visar GSC15-2-celler. Videon visar rotation av en volymrendering som genereras från en z-stack med ett 60x oljenedsänkningsmål. Cellkärnor verkar vita på grund av bisbensimidfärgning, och vissa verkar röda på grund av immunfärgning för Sox2. Observera att på grund av "Alpha Blending" för volymåtergivningar i konfokalmikroskopprogramvaran blandas inte färger som de skulle använda en maximal intensitetsprojektion, och den mest intensiva färgen dominerar och döljer den mindre intensiva färgen. Blodkärlen är färgade vita på grund av immunfärgning för laminin. GSC-markören integrin alpha-6-färgning visas i blått och visas punkterad på gröna GSC-ytor. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S2: Video med hög förstoringsvolym rendering av liten GSC16-4 tumör vid E15. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck. Video motsvarar figur 1D och visar GSC16-4-celler. Videon visar rotation av en volymrendering som genereras från en z-stack med ett 60x oljenedsänkningsmål. Cellkärnor verkar vita på grund av bisbensimidfärgning, och vissa GSC verkar röda på grund av immunfärgning för nestin. Observera att på grund av "Alpha Blending" för volymåtergivningar i konfokalmikroskopprogramvaran blandas inte färger som de skulle använda en maximal intensitetsprojektion, och den mest intensiva färgen dominerar och döljer den mindre intensiva färgen. Blodkärlen är färgade vita på grund av immunfärgning för laminin. GSC-markören integrin alpha-6-färgning visas i blått och visas punkterad på gröna GSC-ytor. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S3: Video med hög förstoringsvolym renderar av liten GSC15-2-tumör vid E15. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck. Video motsvarar figur 1E och visar GSC15-2-celler. Videon visar rotation av en volymrendering som genereras från en z-stack med ett 60x oljenedsänkningsmål. Cellkärnor verkar vita på grund av bisbensimidfärgning, och vissa verkar röda på grund av immunfärgning för Sox2. Observera att på grund av "Alpha Blending" för volymåtergivningar i konfokalmikroskopprogramvaran blandas inte färger som de skulle använda en maximal intensitetsprojektion, och den mest intensiva färgen dominerar och döljer den mindre intensiva färgen. Blodkärlen är färgade vita på grund av immunfärgning för laminin. GSC-markören integrin alpha-6-färgning visas i blått och visas punkterad på gröna GSC-ytor. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S4: Video med hög förstoringsvolym renderingar av små GSC16-4-tumörer vid E15. GSC är gröna på grund av GFP-uttryck. Video motsvarar figur 1F och visar GSC16-4-celler. Videon visar rotation av en volymrendering som genereras från en z-stack med ett 60x oljenedsänkningsmål. Cellkärnor verkar vita på grund av bisbensimidfärgning, och vissa verkar röda på grund av immunfärgning för bo. Observera att på grund av "Alpha Blending" för volymåtergivningar i konfokalmikroskopprogramvaran blandas inte färger som de skulle använda en maximal intensitetsprojektion, och den mest intensiva färgen dominerar och döljer den mindre intensiva färgen. Blodkärlen är färgade vita på grund av immunfärgning för laminin. GSC-markören integrin alpha-6-färgning visas i blått och visas punkterad på gröna GSC-ytor. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S5: Video av levande GBM-celler i ex vivo hjärnskiva. Video motsvarar figur 5C och visar widefield-fluorescensbilder av U-118 / L1LE-cellsfäroider och invaderande celler under ett tidsfördröjningsexperiment för att övervaka invasionens levande beteende i ex vivo-skivan (med ett 20x-mål på ett anpassat time-lapse-mikroskopsystem). U-118/L1LE-cellerna färgades med det långröda fluorescerande membranfärgämnet DiD. Bilder förvärvades med en monokrom kamera. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S6: Video av levande GBM-celler i ex vivo hjärnskiva. Video motsvarar figur 5D och visar widefield-fluorescensbilder av U-118 / L1LE-cellsfäroider och invaderande celler under ett tidsfördröjningsexperiment för att övervaka invasionens levande beteende i ex vivo-skivan (med ett 20x-mål på ett anpassat time-lapse-mikroskopsystem). Cellerna avbildades via sitt röda mCherry-uttryck. Bilder förvärvades med en monokrom kamera. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S7: Video av volym återger bilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC och GBM-celler. Video motsvarar figur 6A. Konfokala z-stackbilder togs i steg om 10 μm var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. Preparatet var av en hjärnskiva med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivan odlades på en membraninsats i en 6-brunns plastcellskål med hjälp av en ELWD 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det extra arbetsavstånd som behövdes. Volymrenderingen genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Videon observeras bäst genom att manuellt dra skjutreglaget för videoförlopp i videospelaren fram och tillbaka för att observera cellrörelser snarare än att låta videospelaren fortsätta med normal långsam hastighet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S8: Video av volym återger bilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC och GBM-celler. Video motsvarar figur 6B. Konfokala z-stackbilder togs i steg om 10 μm var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. Preparatet var av en hjärnskiva med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivan odlades på en membraninsats i en 6-brunns plastcellskål med hjälp av en ELWD 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det extra arbetsavstånd som behövdes. Volymrenderingen genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Videon observeras bäst genom att manuellt dra skjutreglaget för videoförlopp i videospelaren fram och tillbaka för att observera cellrörelser snarare än att låta videospelaren fortsätta med normal långsam hastighet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S9: Video av volym återger bilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC och GBM-celler. Video motsvarar figur 6C. Konfokala z-stackbilder togs i steg om 10 μm var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. Preparatet var av en hjärnskiva med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivan odlades på en membraninsats i en 6-brunns plastcellskål med hjälp av en ELWD 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det extra arbetsavstånd som behövdes. Volymrenderingen genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Videon observeras bäst genom att manuellt dra skjutreglaget för videoförlopp i videospelaren fram och tillbaka för att observera cellrörelser snarare än att låta videospelaren fortsätta med normal långsam hastighet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S10: Video av volym återger bilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC och GBM-celler. Video motsvarar figur 6D. Konfokala z-stackbilder togs i steg om 10 μm var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. Preparatet var av en hjärnskiva med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivan odlades på en membraninsats i en 6-brunns plastcellskål med hjälp av en ELWD 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det extra arbetsavstånd som behövdes. Volymrenderingen genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Videon observeras bäst genom att manuellt dra skjutreglaget för videoförlopp i videospelaren fram och tillbaka för att observera cellrörelser snarare än att låta videospelaren fortsätta med normal långsam hastighet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S11: Video av volym återger bilder av konfokal 4D-tidsfördröjning av levande GSC och GBM-celler. Video motsvarar figur 6E. Konfokala z-stackbilder togs i steg om 10 μm var 10:e minut under en 20-timmarsperiod. preparatet inkluderade en hjärnskiva med implanterade blandade cellsfäroider av röda U-118 / L1LE / mCherry-celler och gröna GSC16-4 / GFP-celler. Konfokala bilder togs medan hjärnskivan odlades på en membraninsats i en 6-brunns plastcellskål med hjälp av en ELWD 20x objektivlins (0,45 NA), vilket gav det extra arbetsavstånd som behövdes. Volymrenderingen genererades med hjälp av konfokalmikroskopprogramvaran "Alpha Blending", vilket ger en uppenbar 3D-effekt. Mikronskalor visas längs kanterna på volymåtergivningen. Videon observeras bäst genom att manuellt dra skjutreglaget för videoförlopp i videospelaren fram och tillbaka för att observera cellrörelser snarare än att låta videospelaren fortsätta med normal långsam hastighet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Discussion

Kritiska steg i protokollet för injektion av celler i mellanhjärnan (optisk tektum) ventrikel inkluderar att inte skada blodkärlen i det korioallantoiska membranet i ägget eller omger embryot före och under injektionen, även om amnionmembranet omedelbart omger embryot kan dras försiktigt och hållas för att placera huvudet när cellerna injiceras i mitthjärnan. Amnionen är relativt tuff och kan dras med fina pincett för att placera huvudet och hålla det stadigt med ena handen, för injektion av celler med den andra handen i optisk tektum, som är den stora, runda strukturen i mitten av hjärnan. I allmänhet varierar livskraften hos injicerade embryon från 25% till 75%, beroende på okända faktorer, och praktiskt taget varje embryo som överlever innehåller åtminstone en liten tumör i optisk tektum. Kritiska steg för att generera livskraftiga hjärnskivor inkluderar blotting av vävnaden av överflödig vätska så att agarosen fäster vid hjärnan under skivning och för att hålla vävnad och skivor kalla tills de placeras på membraninsatsen. Eftersom olika celltyper bildar sfäroider olika (i hastighet och storlek), bör den pläterade celldensiteten på poly-HEMA-plattor och tiden före skörd sfäroider optimeras för varje celltyp.

Arbetet här har inte varit föremål för en formell longitudinell studie av hjärnskivans livskraft. Yang et al. använde kycklingembryo hjärnskivkulturer liknande de som används här och visade god livskraft hos skivorna i minst 7 dagar16. Tidigare arbete visade att när OT-vävnad hölls i suboptimala medier uppträdde många pyknotiska kärnor i vävnaden, vilket inte förekom i skivorna i arbetet här. Dessutom, när skivor degenererar under suboptimala förhållanden, fragmenteras blodkärlen och visas som rader av lamininpositiva sfärer (visas inte). Således, även om livskraften här inte har kontrollerats med metoder som elektrofysiologi eller aktivt kaspas-3-uttryck, uppträdde ingen av indikatorerna för celldöd som sågs under suboptimala odlingsförhållanden här.

OT har fokuserats på för in vivo hjärntumörexperiment eftersom det är den lättast injicerade regionen med den största ventrikeln. Vid E5, som är den senaste dagen som embryot är tillräckligt litet för att förbli tillgängligt ovanpå äggulan, måste injektioner göras i en kammare, eftersom alla hjärnregioner inte är något annat än en tunn ventrikulär zon. Ändå resulterar dessa injektioner framgångsrikt i inbäddade tumörer med celler som invaderar hjärnparenkymet. Ibland finns resulterande tumörer i framhjärnan eller cerebellum, men detta är inte vanligt. Ex vivo-skivor av E15 optic tectum har främst använts för experiment här, så att ex vivo-samodlingsresultaten kan korreleras med injektionsexperimenten in vivo . Skivor i framhjärnan är emellertid också lämpliga och har en större yta och en mycket tunn kammare jämfört med optisk tektum, vilket kan göra framhjärnan mer lämplig för ex vivo-samkulturer som inte korreleras med in vivo-injektioner .

Det har här visats att in vivo-injektioner , följt av vävnadsfixering, vibrerande vävnadssnittning och immunfärgning för laminin och andra markörer, resulterade i högupplösta bilder av GBM-celler och GSC i hjärnvävnad i närheten av blodkärl. Möjligheten att bestämma sambanden mellan tumörceller och blodkärl underlättades avsevärt genom att skapa 3D-volymrenderingar från z-staplar av konfokala optiska sektioner med hjälp av konfokalprogramvaran och tillverkarens instruktioner. Time-lapse-avbildning med widefield fluorescensmikroskopi av GFP-, mCherry- och DiD-märkta celler var möjlig; Migrerande celler som var i närheten av de starkt fluorescerande sfäroiderna doldes emellertid ibland av "glöd" från sfäroiden. Denna oönskade effekt kan minimeras något genom att noggrant justera exponeringstiderna för insamling av widefield-bilder. Time-lapse-avbildning med konfokala z-staplar över tid (4D) eliminerade glöden utanför fokus från sfäroiderna och resulterade i skarpt definierade migrerande celler med mörk bakgrund. Detta beskrevs inte i protokollet, men utfördes på samma sätt som widefield time-lapse imaging, som utfördes medan hjärnskivor var på de transparenta membraninsatserna i en 6-brunns plastplatta. Även om konfokal time-lapse-avbildning resulterar i markant tydligare bilder av enskilda celler och deras beteende, är ett flerpunkts time-lapse-experiment som samlar z-staplar med 10 z-plan / punkt, med 10 minuters intervall under en 20-timmarsperiod, en omfattande användning av skanningshuvudets galvanometrar. Eftersom detta avsevärt kan minska galvanometrarnas livslängd används denna metod klokt.

Även om kycklingembryosystemet är mycket lämpligt för både in vivo-injektion och ex vivo-samodlingsexperiment som undersöker GBM-cellbeteende, finns det flera begränsningar för detta modellsystem. Som med alla xenograftsystem är miljön där mänskliga celler implanteras inte den mänskliga hjärnan, men GBM-cellbeteende verkar efterlikna det i gnagarmodeller och hos mänskliga patienter. Efter att ha utfört in vivo-injektionsexperiment på E5 tillåts tumörer normalt bildas i 10 dagar fram till E15. Detta är uppenbarligen inte tillräckligt med tid för att studera alla aspekter av tumörgenes och cellinvasion. Det har emellertid visats här att solida tumörer bildas i hjärnparenkymet, celler interagerar och omorganiserar sig inom tumören, och betydande hjärninvasion sker både längs blodkärl och diffust inom denna relativt korta tidsperiod. En annan begränsning för in vivo chick embryo systemet är att det inte är lämpligt för läkemedel eller andra behandlingar på grund av den stora äggula och extraembryonala cirkulationssystemet som fungerar under kycklingembryoutveckling. Topiska flytande läkemedelsbehandlingar skulle resultera i en mycket variabel och okänd koncentration i hjärnan på grund av diffusion bort från embryot till den mycket större äggula massan. På samma sätt skulle intravenös injektion av läkemedel i det mycket känsliga extraembryonala cirkulationssystemet läcka eller diffundera ut ur blodkärlen och också resultera i okända koncentrationer i hjärnan. Detta är en av de främsta anledningarna till att ex vivo-skivodlingsmetoden antogs - så att inte bara cellbeteende kunde observeras och spåras via time-lapse-mikroskopi, utan också så att behandlingar som har lyckats förändra GBM-cellbeteende i en maträtt4 kunde testas i en mer relevant hjärnvävnadsmiljö.

Utvecklingen av chick embryo orthotopic brain tumor model system ses som ett betydande tillskott till de system och verktyg som finns tillgängliga för studier av GBM tumörbildning och invasivt cellbeteende. Befruktade kycklingägg kommer sannolikt att vara lättillgängliga i de flesta områden, de är billiga jämfört med gnagare, det finns inga djurvårdskostnader, embryon är mycket motståndskraftiga och resistenta mot infektion (dvs. det mesta arbetet görs på en bänkskiva), embryona är mycket manipulerbara och kan odlas i skallös kultur19, och kycklingembryon betraktas inte som ryggradsdjur och kräver därför inte IACUC-godkännande enligt NIH-riktlinjer (institutionella krav kan variera). Således gör dessa flera fördelar kycklingembryosystemet mycket attraktivt om man begränsar sina frågor och experiment till de som faller inom dess begränsningar. Flera GBM-cellstudier har utförts av andra med hjälp av kycklingembryot, men dessa har nästan uteslutande utnyttjat det korioallantoiska membranet (CAM) i embryot 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 och lemknopp 30, och inte hjärnan. Det har också kommit en rapport som implanterar medulloblastom i kycklinghjärnan på E231. Utan tvekan bör användningen av kycklingembryot som ett ortotopiskt xenograftmodellsystem, som beskrivs här, ge resultat som är mycket mer meningsfulla för human GBM-tumörbiologi än studier med CAM.

Även om dessa studier bara har börjat utnyttja modellsystemet för hjärntumörer i kycklingembryon för studier av humant GBM-cell- och GSC-beteende, hoppas man att andra kommer att utöka användningsområdena och hitta ytterligare potentiella tillämpningar. Man kan tänka sig att detta system inte bara kommer att avslöja mekanismer som reglerar GBM-tumörbildning och cellbeteende, utan också kommer att möjliggöra preklinisk testning av specifika läkemedel och substanser på specifika patienters celler. Till exempel, om hjärnskivkulturer inrättades i förväg, kunde tumörceller, bitar från kirurgiska tumörresektioner eller patienthärledda GBM-organoider32 placeras direkt i ex vivo-samodling , och olika behandlingar kunde bedömas på några dagar. På liknande sätt kan dissocierade patientceller injiceras direkt i E5-mellanhjärnor i ovo för att bedöma deras förmåga att bilda tumörer och invadera hjärnparenkym. Förhoppningen är därför att beskrivningarna av metoderna och representativa resultat här kommer att underlätta och uppmuntra till ökad användning av detta mycket underutnyttjade system för hjärncancerforskning.

Disclosures

Ingen av författarna har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades delvis av ett bidrag till D.S.G. från National Cancer Institute (R03CA227312) och av ett generöst bidrag från Lisa Dean Moseley Foundation. Levande GBM-prover erhölls med patientens samtycke genom Tissue Procurement Center vid Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansiering till A.R. tillhandahölls av National Center for Research Resources och National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Sommarforskarstipendier till N.P., A.L., Z.W. och KS tillhandahölls av University of Delaware Undergraduate Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch Birabira N/A
1 mm biopsy punch pen Robbins Instruments 20335
6 well insert plate (Corning Transwell) Millipore Sigma CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
24 well plate Corning Costar 3526
50 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-9
Agar Fisher BioReagents BP1423-500 for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-545-146
Aluminum foil ReynoldsWrap N/A
Ampicillin Sigma Aldrich A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 Santa Cruz Biotechnology sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 Santa Cruz Biotechnology sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 Santa Cruz Biotechnology sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 Santa Cruz Biotechnology sc-365823
B27 supplement without vitamin A GIBCO 17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258) Sigma-Aldrich B2883 nuclear stain
Cell culture incubator Forma standard humidified CO2 incubator
Centrifuge Beckman Coulter
Confocal microscope Nikon Instruments C2si+ With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses Nikon Instruments Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software Nikon Instruments NIS Elements Version 5.2
Curved foreceps World Precision Intruments 504478
Curved scissors Fine Science Tools
Curved spatula Fisher Scientific 14-375-20
Cyanoacrylate glue Krazy Glue KG-585 12R
D-Glucose Millipore Sigma G8270
DiD far red fluorescent dye Invitrogen V22887 Vybrant DiD
DMEM Sigma Aldrich D5671
DMEM/F12 Sigma Aldrich D8437
DMSO Sigma Aldrich D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493-1L
egg incubator Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm) Scotch N/A
Ethanol 200 proof Decon Laboratories 2701
Fast green FCF dye Avocado Research Chemicals 16520
FBS Gemini Bio-products 900-108
filter paper Fisher Scientific
Gauze Dynarex 3353
Glass Capillaries for microinjection World Precision Instruments TW100-4
Glycerol Fisher BioReagents BP228-1 for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells) Not applicable Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Hausser scientific
Heparin Fisher Scientific BP2524-100
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887
Horse Serum (HI) Gibco 26050-088
Human FGF-2 BioVision 4037-1000
Human TGF-α BioVision 4339-1000
Inverted phase contrast microscope Nikon Instruments TMS for routine viewing of cultured cells
KCl Fisher Scientific BP366
KH2PO4 Fisher Scientific P284
Laboratory film Parafilm
Labquake Shaker LabIndustries T400-110
L-Glut:Pen:Strep Gemini Bio-products 400-110
Low-melt agarose Fisher Scientific BP1360 for embedding live brains
Matrix Corning Matrigel 354234
Medium 199 GIBCO 11150-059
MEM Corning 10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) Fisherbrand 12544A
NaCl Fisher Scientific S271
NaH2PO4 + H2O Fisher Scientific S369
NaHCO3 Fisher Scientific BP328
Normal goat serum Millipore Sigma 526-M
N-propyl gallate Sigma Aldrich P3130 for mounting media
Parafilm Parafilm
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS Sigma Aldrich P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish Becton Dickinson 351008
pneumatic picopump World Precision Intruments PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA) Sigma Aldrich P-3932
razor blade- double edge PACE for cutting fixed brain slices
sapphire knife Delaware Diamond Knives for cutting live brain slices
Scalpel TruMed 1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 11652
Specimen chamber for vibratome custom-made
Stereo Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ1500 Equipped with epifluorescence
straight foreceps World Precision Intruments 500233
straight scissors Fine Science Tools
Sucrose Mallinckrodt 7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) Nikon Instruments TE2000-E With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm Thermo Fisher Scientific 130182 for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm Becton Dickinson 353004 for cell culturing
Transfer pipette American Central Scientific Co. FFP011
Transparent tape Scotch
Triton X-100 Sigma Aldrich T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line ATCC HTB-15 Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump Cole-Parmer EW-07532-40 "Air Cadet"
Vibrating tissue slicer Vibratome 3000 for cutting live and fixed brain slices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).
  2. Yang, M., et al. L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation. Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).
  3. Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).
  4. Anderson, H. J., Galileo, D. S. Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation. Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).
  5. Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982 (2019).
  6. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  7. Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
  8. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  9. Aaberg-Jessen, C., et al. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).
  10. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).
  11. Ren, B., et al. Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture. Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).
  12. Fayzullin, A., et al. Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling. Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).
  13. Jensen, S. S., et al. Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model. PloS One. 11 (7), e0158746 (2016).
  14. Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435 (2018).
  15. Tamura, R., et al. Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion. Molecular Brain. 12 (1), 45 (2019).
  16. Yang, C., et al. Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).
  17. Murrell, W., et al. Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain. PloS One. 8 (8), e71334 (2013).
  18. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  19. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  20. Shoin, K., et al. Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  21. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  22. Balciūniene, N., et al. Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane. Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).
  23. De Magalhães, N., et al. Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research. Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).
  24. Szmidt, M., et al. Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo. Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).
  25. Jaworski, S., et al. Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane. Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).
  26. Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease. International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).
  27. Urbańska, K., et al. The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells. Nanoscale Research Letters. 10, 98 (2015).
  28. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  29. Han, J. M., Jung, H. J. Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells. Molecules. 27 (22), 7968 (2022).
  30. Ruiz-Ontañon, P., et al. Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue. Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).
  31. Cage, T. A., et al. Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).
  32. Darrigues, E., et al. Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720 (2021).

Tags

Neurovetenskap nummer 195
Använda kycklingembryohjärnan som modell för <em>in</em> vivo- och <em>ex vivo-analyser</em> av humant glioblastomcellbeteende
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin,… More

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin, A., Doerr, J., Waterman, Z., Sershen, K., Ray, P., Rodriguez, A., Galileo, D. S. Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior. J. Vis. Exp. (195), e65199, doi:10.3791/65199 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter