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Biology

मुराइन इंटेस्टाइनल क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड्स की 3 डी खेती और ऑर्गेनॉइड रिसर्च के लिए एक एकल स्टेम सेल

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65219
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Suntory Foundation for Life Sciences, Bioorganic Research Institute, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (KUIAS-iCeMS), Kyoto University, 3Faculty of Medicine, Osaka Medical and Pharmaceutical University

Summary

हम मुराइन छोटे आंतों के क्रिप्ट्स को अलग करने और क्रिप्ट्स से आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक उप-उपकला सेलुलर आला की अनुपस्थिति में एकल आंतों के स्टेम सेल से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

वर्तमान में, ऑर्गेनॉइड संस्कृति विभिन्न अंगों में विभिन्न जैविक पहलुओं और बीमारियों के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है। मुराइन छोटे आंतों के क्रिप्ट ऑर्गेनोइड बना सकते हैं जो 3 डी बाह्य मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर आंतों के उपकला की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड्स सभी सेल प्रकारों से बने होते हैं जो विभिन्न आंतों के होमियोस्टैटिक कार्यों को पूरा करते हैं। इनमें पनेथ कोशिकाएं, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं, एंटरोसाइट्स, गोब्लेट कोशिकाएं और टफ्ट कोशिकाएं शामिल हैं। अच्छी तरह से विशेषता वाले अणुओं को आंतों के स्टेम कोशिकाओं (आईएससी) को समृद्ध करने के लिए संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है, जो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5 युक्त ल्यूसीन युक्त दोहराव के साथ लेबल किया जाता है और विशिष्ट वंशों में भेदभाव को चलाने के लिए उपयोग किया जाता है; इन अणुओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर, नोगिन (एक हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन), और आर-स्पोंडिन 1 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एकल एरिथ्रोपोइटिन-उत्पादक हेपेटोसेलुलर रिसेप्टर बी 2 (एएफबी 2) -पॉजिटिव आईएससी से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी विस्तृत है। इस विधि लेख में, ऊतकों से छोटे आंतों के क्रिप्ट और एक एकल आईएससी को अलग करने और ऑर्गेनोइड्स की कुशल स्थापना सुनिश्चित करने की तकनीकों का वर्णन किया गया है।

Introduction

आंतों के ऑर्गेनोइड्स, जो पहली बार 2009 में स्थापित किए गए थे, परिपक्व ऊतकों के लिए उनकी रूपात्मक और कार्यात्मक समानता को देखते हुए आंतों के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली इन विट्रो उपकरण के रूप में उभरे हैं। हाल ही में, वयस्क-ऊतक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स में तकनीकी प्रगति ने आत्म-नवीकरण और भेदभाव क्षमता के साथ आंतों के स्टेम कोशिकाओं (आईएससी) की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति दी है। इन ऑर्गेनोइड्स का व्यापक रूप से गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी और पैथोफिज़ियोलॉजी 1,2,3,4,5,6 पर बुनियादी और ट्रांसलेशनल शोध अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया है। क्लेवर्स समूह द्वारा विकसित 3 डी ऑर्गेनोइड्स बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता के साथ आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदानकरते हैं। चूंकि आंतों के ऑर्गेनोइड ऊतक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं और कई सेल प्रकारों से बने होते हैं, इसलिए वे आंतों के उपकला की कार्यक्षमता को पुन: उत्पन्न करते हैं। ध्यान दें, एक एकल-क्रमबद्ध ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव युक्त जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5-पॉजिटिव (एलजीआर 5+) स्टेम सेल भी किसी भी पेनेथ कोशिकाओं या आईएससी आला जैसे उपकला आला या स्ट्रोमल आला 7 के बिना 3 डी ऑर्गेनोइड उत्पन्न कर सकताहै। हालांकि, क्रिप्ट और आईएससी-पेनेथ सेल डबल्स8 की तुलना में एकल-क्रमबद्ध एलजीआर 5 + कोशिकाओं की ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता कम है।

अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) इनक्यूबेशन या कोलेजनेज पृथक्करण के तरीके एपिथेलियम में ढीलापन और क्रिप्ट्स की रिहाई का कारण बनते हैं। चूंकि एंजाइमैटिक पृथक्करण का क्रिप्ट्स की कोशिका स्थिति पर प्रभाव पड़ सकता है, इसलिए आमतौर पर ऊतक को अलग करने के लिए एक यांत्रिक अलगाव विधि का उपयोग किया जाता है। हालांकि यांत्रिक पाचन एक तेज़ तकनीक है, इस विधि को असंगत क्रिप्ट पैदावार या खराब सेल व्यवहार्यता 9 के साथ जोड़ा जा सकताहै। इसलिए, ईडीटीए उपचार और यांत्रिक पृथक्करण को बेहतर क्रिप्ट पैदावार उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस लेख में दिखाई गई पद्धति की एक विशेषता ईडीटीए चेलेशन10 के बाद ऊतक के टुकड़ों के जोरदार झटकों का उपयोग है। जोरदार झटके छोटी आंत में क्रिप्ट-विलस कॉम्प्लेक्स से क्रिप्ट्स के कुशल अलगाव की अनुमति देते हैं। मैन्युअल झटकों की डिग्री पृथक्करण को निर्धारित करती है। इस प्रकार, इस क्षेत्र में प्रयोगकर्ताओं के लिए परिसरों से क्रिप्ट प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, उचित कौशल विलस संदूषण को कम से कम कर सकता है और क्रिप्ट की संख्या बढ़ा सकता है।

इसलिए, यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, जो मुराइन-व्युत्पन्न छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को नियोजित करता है, पृथक्करण के लिए ईडीटीए के साथ उपचार के बाद भौतिक बल के साथ क्रिप्ट को बेहतर ढंग से अलग कर सकता है। यह ज्ञात है कि एरिथ्रोपोइटिन-उत्पादक हेपेटोसेलुलर रिसेप्टर बी 2 (एएफबी 2) का अभिव्यक्ति पैटर्न क्रिप्ट वातावरण को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, EphB2-पॉजिटिव कोशिकाओं को नीचे से शीर्ष11 तक व्यवस्थित किया जाता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) को एएफबी 2 अभिव्यक्ति के आधार पर किया गया था, और प्राप्त कोशिकाओं को चार समूहों में विभाजित किया गया था: एएफबी 2उच्च, एएफबी 2मेड, एएफबी 2कम, और एएफबी 2नेग। फिर, जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में एकल-क्रमबद्ध एएफबी 2उच्च कोशिकाओं से ऑर्गेनोइड वृद्धि का प्रदर्शन किया गया था।

Protocol

सभी माउस प्रयोगों को सनटोरी पशु आचार समिति (APRV000561) द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी जानवरों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार बनाए रखा गया था। मस मस्कुलस (सी 57बीएल 6 / जे) के एक मानक डब्ल्यूटी तनाव का उपयोग किया गया था। 10 सप्ताह से 20 सप्ताह की उम्र के नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को सीओ2 श्वासावरोध के साथ मार दिया गया था।

1. छोटी आंत का अलगाव

  1. प्रयोगशाला कैंची के साथ ग्रहणी और जेजुनम के समीपस्थ आधे हिस्से सहित छोटी आंतों का उत्पादन।
  2. ऊतक को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और ल्यूमिनल सामग्री को साफ करने के लिए 5 एमएल सिरिंज में 5 एमएल ठंडे पीबीएस-एबीएक्स (पीबीएस + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [1%] + जेंटामाइसिन [0.5%)) के साथ छोटी आंतों को फ्लश करें।
  3. प्रयोगशाला कैंची के साथ ऊतक को लंबाई में काटें, और हिलाते समय ठंडे पीबीएस-एबीएक्स के साथ मैन्युअल रूप से धो लें।
    नोट: एक स्लाइड के साथ विली को स्क्रैप करके, विलस संदूषण को कम किया जा सकताहै।
  4. प्रयोगशाला कैंची का उपयोग करके आंतों के खंड के लगभग 5 मिमी x 5 मिमी टुकड़े एकत्र करें। टुकड़ों को चिमटी के साथ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 25 एमएल ठंडा पीबीएस-एबीएक्स जोड़ें।
  5. 50 एमएल ट्यूब में आंतों की सामग्री को हटाने के लिए 25 एमएल ठंडे पीबीएस-एबीएक्स के साथ 10 गुना आगे और पीछे आंदोलन करके टुकड़ों को धोएं।

2. क्रिप्ट अलगाव

  1. पीबीएस-एबीएक्स में टुकड़ों को बिना किसी झटके के बर्फ पर 30 मिनट के लिए 2 एमएम ईडीटीए युक्त इनक्यूबेट करें।
  2. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के आसान जमने के लिए, पहले से ही 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 24-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. वैक्यूम पंप के साथ सेल कल्चर सिस्टम से ईडीटीए समाधान को एस्पिरेट करें, 25 एमएल ताजा, ठंडा पीबीएस-एबीएक्स जोड़ें, और फिर क्रिप्ट-विलस कॉम्प्लेक्स को छोड़ने के लिए टुकड़ों को हाथ 30x-40x से जोर से ऊपर और नीचे हिलाएं।
    नोट: अलग किए गए क्रिप्ट और विली को 4x आवर्धन पर निलंबन से 25 μL की बूंद के सूक्ष्म अवलोकन द्वारा जांचा जा सकता है।
  4. इसके बाद, निलंबन को एक बार 70 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 390 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. क्रिप्ट पेलेट को 20 एमएल सोर्बिटोल डीएमईएम (उन्नत डीएमईएम /एफ 12 + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [1%] + जेंटामाइसिन [0.5%] + भ्रूण गोजातीय सीरम [1%] + सोर्बिटोल [2%)) में पिपेटिंग के साथ पुन: निलंबित किया जाता है, और कम गति पर सेंट्रीफ्यूज के लिए दो 10 एमएल समाधानों में विभाजन के लिए क्रिप्ट निलंबन को दो नए 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है।
    नोट: बड़े सेल द्रव्यमान और कोशिकाओं / मलबे को कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। बड़ा सेल द्रव्यमान गोली में है, और कोशिकाएं / मलबे सतह पर तैरने वाले में हैं।
  7. दो क्रिप्ट सस्पेंशन को 80 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर धीरे से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    नोट: चूंकि गोली का गठन कमजोर है, इसलिए बहुत अधिक एस्पिरेट न करें। प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल सतह पर तैरने वाला छोड़ दें।
  8. प्रत्येक ट्यूब में फिर से 10 एमएल सोर्बिटोल डीएमईएम जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 80 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सतह पर तैरने वाले को एस्पिर करने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल सुपरनैटेंट छोड़ने के बाद, पुन: निलंबन के लिए 10 एमएल सोर्बिटोल डीएमईएम जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 3 मिनट के लिए क्रिप्ट निलंबन को 80 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सतह पर तैरने वाले को सुखाने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल सुपरनैटेंट छोड़ने के बाद, 10 एमएल पूर्ण डीएमईएम (उन्नत डीएमईएम / एफ 12 + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [1%] + जेंटामाइसिन [0.5%] + भ्रूण गोजातीय सीरम [1%)) जोड़ें, ताकि गोली को ऊपर और नीचे करके पुन: निलंबन किया जा सके, और इसे 1 मिनट के लिए छोड़ दिया जाए।
    नोट: फ्लोटिंग क्रिप्ट्स को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  11. 1 मिनट के बाद, कुल 20 एमएल के लिए प्रत्येक 10 एमएल निलंबन एकत्र करें, और क्रिप्ट को शुद्ध करने के लिए 70 μm सेल स्ट्रेनर के साथ एक बार फ़िल्टर करें।
  12. अनिवार्य रूप से शुद्ध क्रिप्ट्स को सीड करने से पहले, फ़िल्टर किए गए पूर्ण डीएमईएम में क्रिप्ट्स की संख्या की गणना करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 290 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    1. तीन बिंदुओं पर 6 सेमी डिश में 25 μL बूंदों को ड्रिप करें। माइक्रोस्कोप के तहत क्रिप्ट्स की संख्या को 4x आवर्धन पर गिनें, और प्रति 25 μL बूंद पर क्रिप्ट्स की एकाग्रता की गणना करें।
  13. प्रति कुएं 40 μL ईसीएम के साथ 100 क्रिप्ट निलंबित करें। ईसीएम में क्रिप्ट्स का सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए 5x-10x ऊपर और नीचे करें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस प्रीवार्ड 24-वेल प्लेट में बीज लें।
    नोट: पोलीमराइजेशन से बचने के लिए हमेशा ईसीएम को बर्फ पर रखें। ईसीएम में हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए पिपेट सावधानी से।
  14. ईसीएम के पोलीमराइजेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए 24-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  15. अंत में, ईसीएम को 500 μL संस्कृति माध्यम के साथ कवर करें जिसमें माउस एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF), पुनः संयोजक माउस R-spondin 1, और कमरे के तापमान पर पुनः संयोजक माउस नोगिन शामिल हैं। प्रति कुएं सामग्री की अंतिम एकाग्रता निम्नानुसार है: पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%), 50 यू / एमएल प्रत्येक; जेंटामाइसिन (0.5%), 25 μg / ईजीएफ, 20 एनजी / नोगिन, 100 एनजी / आर-स्पोंडिन 1, 500 एनजी / एमएल; एल-ग्लूटामाइन, 2 एमएम।
  16. 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रिप्ट कल्चर शुरू करें।
    नोट: 24-वेल प्लेट में ऑर्गेनोइड्स के लिए संस्कृति माध्यम के लिए, तालिका 1 देखें।
  17. ऑर्गेनॉइड मोर्फोजेनेसिस का निरीक्षण करने के लिए दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग करें, जिसमें 7 दिनों तक हर 3 घंटे में 20x उद्देश्य से लैस रिकॉर्डिंग टाइम-लैप्स इमेज माइक्रोस्कोप है। 1 μm (1 μm x पांच चरण) के z-चरणों पर सीरियल z-स्टैक ्ड छवियाँ प्राप्त करें।
  18. हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।

3. फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस)

  1. चूहों से क्रिप्ट्स को अलग करें (अनुभाग 2 देखें)।
  2. पृथक क्रिप्ट्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 2 एमएल के साथ इलाज करें।
  3. पीबीएस के 10 एमएल के साथ प्रतिक्रिया बंद करें, और फिर 20 μm सेल स्ट्रेनर से गुजरें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 390 × ग्राम पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें, और पूर्ण डीएमईएम के 100 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
  5. एंटी-एफबी 2 एपीसी-संयुग्मित एंटीबॉडी (1/50) जोड़ें, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3x धोएं, और अंत में 7-एमिनो-एक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) (1/100) जोड़ें।
  7. एफएसीएस के माध्यम से दाग वाली कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें।
    1. क्षेत्र स्केलिंग कारक को समायोजित करें, और सेल आकार (फॉरवर्ड स्कैटर, एफएससी-ए) बनाम ग्रैन्यूलैरिटी (साइड स्कैटर, एसएससी-ए) के अनुसार क्रमबद्ध करें।
    2. 488 एनएम और 50 एमवी शक्ति की तरंग दैर्ध्य पर लेजर सेट के साथ व्यवहार्यता के लिए 7-एएडी नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें।
    3. 640 एनएम और 100 एमवी शक्ति की तरंग दैर्ध्य पर लेजर सेट के साथ EphB2-उच्च (EphB2उच्च), EphB2-मध्यम (EphB2med), EphB2-निम्न (EphB2कम), और EphB2-नकारात्मक (EphB2neg) कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए द्वारों का सीमांकन करें।
  8. 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एएफबी 2उच्च सेलसंस्कृति शुरू करें।

4. एकल-कोशिका सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स

  1. वर्गीकृत EphB2 सतह स्तर11 के अनुसार सेल अलगाव विधि करें, और फिर चार अलग-अलग आबादी (उच्च, मध्यम, निम्न और नकारात्मक) प्राप्त करें।
  2. 390 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ पेलेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए इकट्ठा करें, और पाइपिंग द्वारा ईसीएम में एकल-क्रमबद्ध एएफबी 2उच्च कोशिकाओं को एम्बेड करें, इसके बाद 24-वेल प्लेट (ईसीएम / वेल के 100 सिंगल्स / 40 आरएल) पर बीज बोएं।
  3. चरण 2.14 के रूप में, ईसीएम को पॉलीमराइज़ करने की अनुमति दें, और ईसीएम को एक संस्कृति माध्यम के साथ कवर करें जिसमें एफबी 2उच्च कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए पहले 2 दिनों के लिए आरएचओ-संबद्ध किनेज (रॉक) अवरोधक (10 μM) होता है।
    नोट: रॉक अवरोधक एनोइकिस के खिलाफ प्रभावी है।
  4. मैन्युअल रूप से 40x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं का निरीक्षण करें, और स्फेरॉइड गठन और क्रिप्ट प्रोट्रूशन के साथ व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स का निरीक्षण करें।

Representative Results

माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए, ईडीटीए उपचार और एक यांत्रिक अलगाव विधि का एक संयोजन क्रिप्ट10,13 को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि लगभग सभी पृथक क्रिप्ट्स को तुरंत सील कर दिया गया था और उपकला आला (चित्रा 1 ए) से निचोड़ने के बाद शंकु के आकार के दिखाई दिए थे। विलस संदूषण को कम करने के लिए, परिणामी निलंबन को 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से पारित किया गया था, और फिर निस्पंदन को सेंट्रीफ्यूज किया गया था। चूंकि निस्पंदन और निलंबन के दौरान कुछ क्रिप्ट बाधित होते हैं, इसलिए इन चरणों को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। परिणामों से पता चला कि अंतिम अंश में लगभग सभी क्रिप्ट एकीकृत थे और संस्कृति में उपयोग के लिए उपयुक्त थे (चित्रा 1 बी)। सभी प्लेटेड क्रिप्ट्स को व्यक्तिगत रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए, प्रति कुएं 100 क्रिप्ट्स चढ़ाए गए थे (चित्रा 1 सी)। विशिष्ट क्रिप्ट कल्चर माध्यम (चित्रा 1 डी) को जोड़ने के बाद, ऑर्गेनोइड्स के विकास की निगरानी दैनिक माइक्रोस्कोप के साथ की गई थी। इसके अलावा, क्रिप्ट्स से ऑर्गेनॉइड वृद्धि को उनके विकास की निगरानी के लिए टाइम-लैप्स छवियों द्वारा देखा गया था (चित्रा 1 ई और पूरक वीडियो एस 1)। सुसंस्कृत क्रिप्ट्स ने रूढ़िवादी तरीके से व्यवहार किया। ऑर्गेनॉइड का आंतरिक लुमेन एपोप्टोटिक कोशिकाओं के द्रव्यमान से भरा था। आईएससी का सक्रिय प्रसार और भेदभाव उभरते (चित्रा 1 ई और पूरक वीडियो एस 1) के साथ क्रिप्ट क्षेत्र में हुआ। नवोदित को आईएससी माइग्रेशन और प्रसार और पनेथ सेल भेदभाव के साथ जोड़ा गया था। विभेदित पनेथ कोशिकाएं हमेशा नवोदित साइट (पूरक चित्रा एस 1) पर स्थित थीं। चूंकि ऑर्गेनोइड्स को 10x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संस्कृति में स्थिर होने की पुष्टि की गई थी, इसलिए तकनीक का उपयोग विकासशील छोटी आंत में क्रिप्ट गठन की जांच करने और ऊतक पुनर्जनन और आईएससी की क्षमता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ताकि नई आंतों के उपकला कोशिकाओं 14,15,16 के उत्पादन के लिए दीर्घकालिक अस्तित्व हो सके।

Lgr5 को एक ISC मार्कर के रूप में परिभाषित किया गया है, और मुराइन Lgr5+ कोशिकाएं 3D ऑर्गेनोइड्स7 बनाती हैं। हालांकि, चूंकि एलजीआर 5 प्रोटीन की कोशिका सतह की प्रचुरता कम है और उच्च-आत्मीयता विरोधी एलजीआर 5 एंटीबॉडी की कमी है, एफएसीएस द्वारा मुराइन आईएससी को कुशलतापूर्वक अलग करना चुनौतीपूर्ण है। EphB2 को पहले आंतों के ऊतकों से मुराइन और मानव आईएससी के शुद्धिकरण के लिए एक सतह मार्कर के रूपमें पहचाना गया है। एएफबी 2 का अभिव्यक्ति पैटर्न आईएससी मार्करों में शामिल जटिलता को बढ़ाता है। EphB2-पॉजिटिव कोशिकाओं को पूरे प्रोलिफेरेटिव डिब्बे में व्यवस्थित किया जाता है, जो क्रिप्ट्स के तल पर चरम पर होता है, जबकि वे क्रिप्ट11 के शीर्ष की ओर एक ढाल में कम हो जाते हैं। पेनेथ कोशिकाओं और पूर्वज कोशिकाओं को भी क्रिप्ट में स्थानीयकृत किया जाता है। पनेथ कोशिकाएं मुख्य रूप से एएफबी 3 को व्यक्त करती हैं, जो उनकी स्थिति के लिए आवश्यक है, और क्रिप्ट में उनके ऊपर पूर्वज कोशिकाएं मुख्य रूप से एएफबी 2 व्यक्त करती हैं। इस प्रकार, एंटी-एएफबी 2 एंटीबॉडी का उपयोग करके आईएससी शुद्धिकरण के दौरान दोनों सेल प्रकारों का संदूषण हो सकता है। तदनुसार, उनके मार्कर जीन अभिव्यक्ति और एफएसीएस द्वारा एएफबी 2 का उपयोग करके पृथक कोशिकाओं की ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

इन तथ्यों के आधार पर, एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके, एएफबी 2 सतह-लेबल कोशिकाओं को डब्ल्यूटी क्रिप्ट्स19 से अलग किया जा सकता है। यह जांच की गई है कि क्या EphB2 अभिव्यक्ति विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के साथ चार समूहों के बीच अंतर कर सकती है, जैसे कि ISC-विशिष्ट मार्कर जीन (Lgr5, Ascl2, और Olfm4) और पूर्वज सेल-विशिष्ट मार्कर जीन (Ki67, Myc, और FoxM1)। इस प्रयोग से पता चला कि EphB2उच्च कोशिकाएं मुख्य रूप से ISCs थीं, EphB2मेड कोशिकाओं20,21 के विपरीत। अंत में, सेल अलगाव विधि के आधार पर, प्राप्त कोशिकाओं को चार समूहों में विभाजित किया गया था (EphB2उच्च, EphB2med, EphB2कम, और EphB2neg कोशिकाएं) (चित्रा 2)। फिर, एफएसीएस द्वारा क्रमबद्ध एएफबी 2 के उच्च स्तर को व्यक्त करने वाली एकल कोशिकाओं को ऑर्गेनोइड विकास के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एक एकल EphB2उच्च कोशिका को स्वतंत्र रूप से स्थानीय उपचार के लिए लागू किया जा सकता है और सामान्य छोटी आंत (चित्रा 3) की याद दिलाने वाले स्व-संगठित क्रिप्ट-विलस संरचनाओं को फिर से बनाया जा सकता है। हालांकि, अन्य समूहों (EphB2med, EphB2कम, और EphB2neg) से प्राप्त कोशिकाएं ऑर्गेनोइड20 उत्पन्न नहीं करती हैं।

पिछले अध्ययन में, ~ 6% एकल-क्रमबद्ध Lgr5-GFPhi कोशिकाएं क्रिप्ट-विलस ऑर्गेनोइड्स7 शुरू करने में सक्षम थीं। हालांकि, शेष कोशिकाएं ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने में असमर्थ थीं और पहले 12 घंटे7 के भीतर मर गईं। लेखकों ने माना कि यह अलगाव प्रक्रिया7 में निहित शारीरिक और / या जैविक तनाव का परिणाम था। डब्ल्यूटी चूहों में एकल-क्रमबद्ध एएफबी 2उच्च कोशिकाओं से 6% से कम ऑर्गेनोइड वृद्धि भी प्राप्त की गई थी। संस्कृति के दिन 5 तक, स्फेरॉइड जैसी संरचनाओं का गठन हुआ (चित्रा 3)। दिन 7 से दिन 9 तक, क्रिप्ट बनाने के लिए धब्बों का निष्कासन हुआ (चित्रा 3)। महत्वपूर्ण रूप से, एकल-क्रमबद्ध EphB2उच्च कोशिकाओं के लिए एक चयनित रॉक अवरोधक के आवेदन ने पृथक्करण-प्रेरित एपोप्टोसिस को कम कर दिया और ऑर्गेनोइड विकास की दक्षता में वृद्धि की।

Figure 1
चित्र 1: माउस के छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी। (ए) ईडीटीए चेलेशन और यांत्रिक पृथक्करण के संयोजन द्वारा तैयार क्रिप्ट्स। (बी) परिणामी शुद्ध क्रिप्ट। (सी) बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड क्रिप्ट्स। (ए-सी) काले तीर क्रिप्ट का संकेत देते हैं। (डी) क्रिप्ट्स और ऑर्गेनोइड्स की त्रि-आयामी संस्कृति। (ई) एक क्रिप्ट से प्राप्त बढ़ते ऑर्गनॉइड की प्रतिनिधि छवियां। सफेद तीर क्रिप्ट नवोदित का संकेत देते हैं। स्केल पट्टियाँ = (A-C) 100 μm और (E) 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जंगली प्रकार के चूहों में EphB2-पॉजिटिव (EphB2+) कोशिकाओं की आबादी प्राप्त करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। (A) आगे और साइड स्कैटर प्लॉट का उपयोग क्रमशः उनके आकार और ग्रैन्यूलैरिटी के अनुसार कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। (बी) प्रतिदीप्ति स्कैटर का उपयोग कोशिकाओं की 7-एएडी (पेरसीपी) प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। 7-एएडी-नकारात्मक सेल आबादी के लिए गेट चुना गया था। (C) EphB2-उच्च (EphB2उच्च), EphB2-मध्यम (EphB2med), EphB2-निम्न (EphB2निम्न), और EphB2-नकारात्मक (EphB2neg) सेल आबादी के लिए द्वार चुने गए थे। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; 7-एएडी = 7-एमिनो-एक्टिनोमाइसिन डी कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जंगली प्रकार के चूहों में एकल-क्रमबद्ध EphB2उच्च कोशिका ऑर्गेनॉइड वृद्धि का समय पाठ्यक्रम। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: 24-वेल प्लेट के लिए संस्कृति माध्यम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 1: एक बढ़ते ऑर्गेनोइड की टाइम-लैप्स छवियां। स्केल पट्टी = 50 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: एक ऑर्गेनॉइड में एंटी-लाइसोजाइम एंटीबॉडी धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। सफेद तीर पनेथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। संक्षिप्त नाम: डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप। स्केल पट्टी = 10 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल लगातार छोटे आंतों के क्रिप्ट और 3 डी ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। क्रिप्ट-रिलीज़िंग दर में सुधार करने के लिए, ईडीटीए के साथ उपचार के बाद जोरदार झटकों को शामिल करने वाली एक यांत्रिक अलगाव विधि स्थापित की गई थी। मध्यम रचना सातो एट अल.7 के मूल प्रोटोकॉल से अलग है। मूल माध्यम अपेक्षाकृत महंगा है। इस प्रकार, फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर, पुनः संयोजक विकास कारकों और / या वातानुकूलित मीडिया युक्त मुराइन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए एक संस्कृति माध्यम और अनुकूलित मीडिया तालिका 1 में दिखाया गया है। Wnt3A और N-एसिटाइलसिस्टीन इस प्रोटोकॉल में संस्कृति माध्यम में शामिल नहीं हैं। जैसा कि पनेथ कोशिकाएं डब्ल्यूएनटी 3 व्यक्त करती हैं, कोशिकाएं डब्ल्यूएनटी 3 का उत्पादन करती हैं और आईएससी रखरखाव का समर्थन करती हैं। इसके अतिरिक्त, क्रिप्ट अलगाव के दौरान, वातानुकूलित माध्यम का उपयोग नहीं किया जाता है। ऑर्गेनॉइड मॉडल गतिशील है और इसमें सेलुलर और संरचनात्मक विषमता (पनेथ कोशिकाएं, एंटरोसाइट्स, गोब्लेट कोशिकाएं, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं, टफ्ट कोशिकाएं और आईएससी) हैं। इसलिए, इन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ऑर्गेनॉइड जीव विज्ञान के मौलिक मुद्दों का अध्ययन करने के लिए पैमाने पर किया जा सकता है।

EphB2 ढाल वयस्क छोटी आंत 18 में क्रिप्ट-विलस अक्ष के साथ आईएससी स्टेमनेस और प्रसार को बनाएरखता है। पृथक क्रिप्ट्स की तुलना में एक एकल एएफबी 2 सेल से ऑर्गेनोइड बनाने का लाभ मुराइन आईएससी के जीव विज्ञान को समझने से संबंधित है, क्योंकि आईएससी विभिन्न मानव आंतों के विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एकल EphB2उच्च-व्यक्त करने वाले ISCs को एकल Lgr5-व्यक्त ISCs से ऑर्गेनोइड्स के विकास के समान तरीके से ऑर्गेनोइड बनाने के लिए संवर्धित किया जा सकता है। एफएसीएस का उपयोग करके क्रिप्ट्स में ईपीबी 2 अभिव्यक्ति के अनुसार कोशिकाओं को चार समूहों (EphB2उच्च, EphB2med, EphB2कम, और EphB2neg) में सटीक रूप से विभाजित करना है। फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) प्लॉट आमतौर पर उनके आकार और ग्रैन्यूलैरिटी के आधार पर रुचि की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। एफएससी सेल आकार को इंगित करता है, और एसएससी पी 0 गेट (चित्रा 2 ए) में सेल की जटिलता या ग्रैन्यूलैरिटी से संबंधित है। इस काम में, परिभाषित गेट (पी 0) के भीतर गिरने वाली कोशिकाओं को बाद में व्यवहार्यता के लिए विश्लेषण किया गया था। इसके बाद, उनकी व्यवहार्यता 7-एएडी प्रतिदीप्ति संकेतों की नकारात्मक और सकारात्मक आबादी के अनुसार निर्धारित की गई थी। 7-एएडी-नकारात्मक और -सकारात्मक कोशिकाओं के बीच की सीमा को न्यूनतम सकारात्मक सेल संदूषण के साथ नकारात्मक लोगों को प्राप्त करने के लिए सख्ती से निर्णय लिया गया था। EphB2 गेट मोटे तौर पर EphB2 वर्गीकृत अभिव्यक्ति के आधार पर सेट किए गए थे।

यह पुष्टि करने के लिए कि चार समूहों को ठीक से विभाजित किया गया था, चयनित जीनों की एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। आईएससी मार्करों के एमआरएनए स्तर एएफबी 2 उच्च कोशिकाओं20 मेंउच्च हैं। इसके अतिरिक्त, पूर्वज सेल-विशिष्ट मार्करों के एमआरएनए स्तर एफबी 2मेड कोशिकाओं20 में अपेक्षाकृत अधिक हैं। हालांकि, EphB2कम और EphB2neg कोशिकाओं में EphB2 एक्सडप्रेशन EphB2उच्च और EphB2मेड कोशिकाओं20 की तुलना में कम या नकारात्मक है। चढ़ाना से पहले EphB2उच्च सेल आबादी के संवर्धन को सुनिश्चित करने के लिए पूर्ववर्ती उपाय किए जाने चाहिए। हालांकि, एएफबी 2उच्च कोशिकाओं से 6% से कम की ऑर्गेनॉइड वृद्धि संस्कृति प्रक्रिया के दौरान स्टेम कोशिकाओं की मृत्यु के कारण हो सकती है, न कि क्रिप्ट अलगाव के दौरान जोरदार झटके। यह दिखाया गया है कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक Rho-संबद्ध किनेज (ROCK) अवरोधक का आवेदन स्पष्ट रूप से पृथक्करण-प्रेरित एपोप्टोसिस22 को कम करता है। इस प्रकार, एक तकनीकी परिवर्तन के रूप में, व्यवहार्यता में सुधार के लिए रॉक अवरोधक को उच्च एकाग्रता पर और लंबे समय तक इनक्यूबेशन के साथ जोड़ने की कोशिश करना उचित है।

आईएससी के बगल में डब्ल्यूएनटी 3 ए-स्रावित पनेथ कोशिकाएं आईएससी 8 को आवश्यक सहायता प्रदान करतीहैं। दरअसल, आईएससी-पेनेथ सेल डबल्स एकल आईएससी8 की तुलना में एक मजबूत बढ़ी हुई ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, संस्कृति के पहले 3 दिनों के लिए 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता पर डब्ल्यूएनटी 3 ए को जोड़ने से ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता8 में वृद्धि हुई है। इस प्रकार, एक और तकनीकी परिवर्तन के रूप में, बहिर्जात WNT3A को जोड़ने से एकल EphB2उच्च-व्यक्त आईएससी की ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता में सुधार हो सकता है।

विवो दृष्टिकोण की तुलना में, ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आनुवंशिक हेरफेर, घातक फेनोटाइप के विश्लेषण और दवा स्क्रीनिंग20,23 के लिए आसानी से किया जा सकता है। ईडीटीए चेलेशन और एक यांत्रिक अलगाव विधि का एक संयोजन क्रिप्ट से छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड बनाने के लिए प्रभावी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और समय-कुशल है और किसी भी उन्नत अनुभव के बिना प्रयोगशाला कर्मचारियों द्वारा आसानी से पालन किया जा सकता है। इस प्रकार, ईडीटीए के साथ उपचार के बाद जोरदार झटकों के साथ यांत्रिक अलगाव के अलावा कुशलतापूर्वक मुराइन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स एक्स विवो स्थापित कर सकते हैं और अन्य वयस्क उपकला ऊतकों के ऑर्गेनोइड खेती और रोग मॉडलिंग के लिए एक संभावित उपकरण प्रदान कर सकते हैं।

आंतों के उपकला कोशिकाओं को ध्रुवीकृत किया जाता है और लुमेन की ओर निर्देशित एपिकल पक्ष के साथ केंद्रित किया जाता है। हालांकि, 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लुमेन का सामना करने वाला एपिकल पक्ष उनके इंटीरियर में है। इस प्रकार, यह संगठन एपिकल पक्ष तक पहुंच को रोकता है, जो उपकला कोशिकाओं पर पोषक तत्वों, रोगाणुओं और मेटाबोलाइट्स जैसे ल्यूमिनल घटकों के प्रभावों का अध्ययन करते समय एक मुद्दा है। इस नुकसान को दरकिनार करने के लिए, 2 डी मोनोलेयर के रूप में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की एकसंस्कृति विकसित की गई है। भविष्य के अनुप्रयोगों के संदर्भ में, ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति का उपयोग किया जाएगा, क्योंकि यह सबसे कुशल और वापस लेने योग्य प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को टीटी (अनुदान संख्या जेपी 17 के07495 और जेपी 20के06751) के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (सी) के लिए सहायता अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम दीर्घकालिक टाइम-लैप्स इमेजिंग (एलसीवी 100) के लिए उपकरणों के उपयोग के लिए प्रोफेसर मिनको केंगाकू को धन्यवाद देते हैं; ओलंपस)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 125.215
5 mL syringe TERUMO SS-05SZ
15 mL Falcon tube Iwaki 2325-015
20 μm cell strainer Sysmex 04-004-2325
24-well plate Iwaki 3820-024
50 mL Falcon tube Iwaki 2345-050
60 mm tissue culture dish FALCON 353002
70 μm cell strainer Falcon 352350
100 mm Petri dish Iwaki 3020-100
7-AAD BD Biosciences 559925
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen A-11004
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody BD Biosciences 564699
C57BL6/J mice Japan SLC, Inc.
Clean bench HITACHI CCV-1306E
Confocal laser scanning microscope Olympus FV3000
EDTA (0.5 mol/L) Nacalai Tesque 06894-14 2 mM
FACSMelody BD Life Sciences-Biosciences 661762
Fetal bovine serum Sigma 173012 1% (v/v)
Fiji (software) https://fiji.sc/
Gentamicin (10 mg/mL) Nacalai Tesque 16672-04 25 μg/mL
Hammacher laboratory scissor SANSYO 91-1538
Incubator Panasonic MCO-170-PJ
Laboratory tweezer AS-ONE 7-164-04
L-Glutamine 200 mM Gibco 25030081 2 mM
Matrigel BD Biosciences 354230 ECM for 3D organoids
Mouse Anti-Human Lysozyme LSBio LS-B8704-100
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) PeproTech 315-09 20 ng/mL
PBS 1x Gibco 10010-023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 50 U/mL
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) GILSON 1-6855-12, -13, -15, and -16
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution R&D Systems 1967-NG-025 100 ng/mL
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/mL
Sorbitol Nacalai Tesque 32021-95 2% (w/v)
TE2000-S (inverted microscope) Nikon 24131
Time-lapse image microscope Olympus LCV100
TrypLE Express 1x Gibco 12605-010
ULVAC ULVAC KIKO Inc. 100073
Y-27632 Fujifilm 331752-47-7 10 μM

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References

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जीव विज्ञान अंक 194
मुराइन इंटेस्टाइनल क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड्स की 3 डी खेती और ऑर्गेनॉइड रिसर्च के लिए एक एकल स्टेम सेल
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Takase, Y., Fujishima, K.,… More

Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research. J. Vis. Exp. (194), e65219, doi:10.3791/65219 (2023).

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