Summary
Vi beskriver ett protokoll för att isolera murina tunntarmskryptor och odla intestinala 3D-organoider från krypterna. Dessutom beskriver vi en metod för att generera organoider från en enda tarmstamcell i frånvaro av en subepitelial cellulär nisch.
Abstract
Idag utgör organoidodling ett viktigt verktyg för in vitro-studier av olika biologiska aspekter och sjukdomar i olika organ. Murina tunntarmskrypter kan bilda organoider som efterliknar tarmepitelet när de odlas i en 3D extracellulär matris. Organoiderna består av alla celltyper som uppfyller olika intestinala homeostatiska funktioner. Dessa inkluderar Paneth-celler, enteroendokrina celler, enterocyter, bägarceller och tuftceller. Välkarakteriserade molekyler tillsätts i odlingsmediet för att berika tarmstamcellerna (ISC) märkta med leucinrika upprepningar innehållande G-proteinkopplad receptor 5 och används för att driva differentiering ner specifika linjer; dessa molekyler innefattar epidermal tillväxtfaktor, Noggin (ett benmorfogenetiskt protein) och R-spondin 1. Dessutom beskrivs också ett protokoll för att generera organoider från en enda erytropoietinproducerande hepatocellulär receptor B2 (EphB2)-positiv ISC. I denna metodartikel beskrivs tekniker för att isolera tunntarmskrypter och en enda ISC från vävnader och säkerställa effektiv etablering av organoider.
Introduction
Intestinala organoider, som först etablerades 2009, har framstått som ett kraftfullt in vitro-verktyg för att studera tarmbiologi med tanke på deras morfologiska och funktionella likhet med mogna vävnader. Nyligen har tekniska framsteg inom odlade organoider härrörande från stamceller från vuxenvävnad möjliggjort långsiktig odling av tarmstamceller (ISC) med självförnyelse och differentieringspotential. Dessa organoider har använts i stor utsträckning för grundläggande och translationella forskningsstudier om gastrointestinal fysiologi och patofysiologi 1,2,3,4,5,6. 3D-organoiderna som utvecklats av Clevers-gruppen ger ett kraftfullt verktyg för att studera tarmepitelet med förbättrad fysiologisk relevans7. Eftersom intestinala organoider härrör från vävnadsstamceller och består av flera celltyper, rekapitulerar de funktionaliteten hos tarmepitelet. Observera att en enkelsorterad leucinrik upprepningsinnehållande G-proteinkopplad receptor 5-positiv (Lgr5+) stamcell också kan generera 3D-organoider utan några Paneth-celler eller en ISC-nisch som epitelnisch eller stromal nisch7. Den organoidbildande kapaciteten hos enkelsorterade Lgr5+-celler är dock låg jämfört med krypt- och ISC-Paneth-celldubbletter8.
Ett ökande antal studier har visat att metoderna för etylendiamintetraättiksyra (EDTA) inkubation eller kollagenasdissociation orsakar lossning i epitelet och frisättning av krypter. Eftersom enzymatisk dissociation kan ha en effekt på celltillståndet hos krypter, används vanligtvis en mekanisk isoleringsmetod för att dissociera vävnaden. Även om mekanisk matsmältning är en snabb teknik, kan denna metod associeras med inkonsekventa kryptutbyten eller dålig cellviabilitet9. Därför kan EDTA-behandling och mekanisk dissociation kombineras för att generera bättre kryptutbyten. En egenskap hos metoden som visas i denna artikel är användningen av kraftig skakning av vävnadsfragmenten efter EDTA-kelering10. Kraftig skakning möjliggör effektiv isolering av krypter från krypt-villuskomplex i tunntarmen. Graden av manuell skakning bestämmer separationen. Således är det viktigt att erhålla krypter från komplex för experimenter inom detta område. Dessutom kan rätt skicklighet minska villusförorening till ett minimum och öka antalet krypter.
Därför kan detta experimentella protokoll, som använder murin-härledda tunntarmsorganoider, bättre isolera krypter med fysisk kraft efter behandling med EDTA för dissociation. Det är känt att uttrycksmönstret för erytropoietinproducerande hepatocellulär receptor B2 (EphB2) delvis återspeglar kryptmiljön. Till exempel är EphB2-positiva celler organiserade från botten till topp11. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) utfördes baserat på EphB2-uttrycket, och de erhållna cellerna delades in i fyra grupper: EphB2hög, EphB2med, EphB2låg och EphB2neg. Därefter demonstrerades organoidtillväxten från enstaka sorterade EphB2-höga celler i vildtypsmöss (WT).
Protocol
Alla musförsök godkändes av Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561), och alla djur hölls i enlighet med kommitténs riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. En standard WT-stam av Mus musculus (C57BL6/J) användes. Både manliga och kvinnliga möss från 10 veckor till 20 veckors ålder användes. Mössen avlivades med CO 2-kvävning.
1. Isolering av tunntarmen
- Accis tunntarmen, inklusive tolvfingertarmen och den proximala halvan av jejunum, med laboratorie sax.
- Överför vävnaden till en petriskål och spola tunntarmen med 5 ml kall PBS-ABx (PBS + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%]) i en 5 ml spruta för att rensa luminalinnehållet.
- Skär vävnaden öppen på längden med laboratoriesax och tvätta manuellt med kall PBS-ABx under skakning.
OBS: Genom att skrapa ut villi med en bild kan villusförorening minskas12. - Samla ca 5 mm x 5 mm bitar av tarmsegmentet med hjälp av laboratoriesax. Överför fragmenten till ett 50 ml rör med pincett och tillsätt 25 ml kall PBS-ABx.
- Tvätta fragmenten genom att agitera fram och tillbaka 10x med 25 ml kall PBS-ABx för att ta bort tarminnehållet i 50 ml röret.
2. Krypta isolering
- Inkubera bitarna i PBS-ABx innehållande 2 mM EDTA i 30 minuter på is utan skakning.
- För enkel stelning av den extracellulära matrisen (ECM), inkubera en platta med 24 brunnar i en 37 °C vävnadsodlingsinkubator i förväg.
- Aspirera EDTA-lösningen från cellodlingssystemet med en vakuumpump, tillsätt 25 ml färsk, kall PBS-ABx och skaka sedan bitarna upp och ner kraftigt för hand 30x-40x för att frigöra krypt-villuskomplexen.
OBS: De separerade krypterna och villi kan kontrolleras genom mikroskopisk observation av en 25 μL droppe från suspensionen vid 4x förstoring. - Filtrera sedan suspensionen genom en sil på 70 μm en gång.
- Centrifugera suspensionen vid 390 × g i 3 min vid 4 °C.
- Återsuspendera kryptpelleten i 20 ml sorbitol DMEM (avancerad DMEM / F12 + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + fetalt bovint serum [1%] + sorbitol [2%]) med pipettering och överför kryptsuspensionen till två nya 15 ml rör för uppdelning i två 10 ml lösningar för att centrifugera vid låg hastighet.
OBS: Den stora cellmassan och cellerna / skräpet kan separeras med låghastighetscentrifugering. Den stora cellmassan finns i pelleten och celler/skräp finns i supernatanten. - Centrifugera de två kryptsuspensionerna vid 80 × g i 3 minuter vid 4 °C och aspirera sedan supernatanten försiktigt.
OBS: Eftersom pelletsbildningen är svag, aspirera inte för mycket. Lämna 2 ml supernatant i varje rör. - Tillsätt 10 ml sorbitol DMEM till varje rör igen. Centrifugera suspensionen vid 80 × g i 3 min vid 4 °C.
- Efter aspirering av supernatanten och lämna 2 ml supernatant i varje rör, tillsätt 10 ml sorbitol DMEM för resuspension och centrifugera kryptsuspensionen vid 80 × g under en sista 3 min vid 4 °C.
- Efter aspirering av supernatanten och lämna 2 ml supernatant i varje rör, tillsätt 10 ml komplett DMEM (avancerat DMEM / F12 + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + fetalt bovint serum [1%]) för resuspension av pelleten genom pipettering upp och ner och låt den stå i 1 min.
OBS: Vänta i 1 min för att få de flytande krypterna effektivt. - Efter 1 minut, samla upp varje 10 ml suspension för totalt 20 ml och filtrera en gång med en 70 μm cellsil för att rena krypterna.
- Innan sådd i huvudsak rena krypter, räkna antalet krypter i den filtrerade fullständiga DMEM och centrifugera sedan vid 290 × g i 3 minuter vid 4 °C.
- Droppa 25 μL droppar i en 6 cm skål på tre punkter. Räkna antalet krypter under ett mikroskop vid 4x förstoring och beräkna koncentrationen av krypter per 25 μL droppe.
- Stäng av 100 krypter med 40 μL ECM per brunn. Pipettera upp och ner 5x-10x för att erhålla en homogen suspension av krypter i ECM, och frö sedan i en 37 °C förvärmd 24-brunnsplatta.
OBS: Håll alltid ECM på is för att undvika polymerisation. Pipettera försiktigt för att undvika att göra luftbubblor i ECM. - Inkubera plattan med 24 brunnar i 15 minuter i en 5 % CO2-inkubator på 37 °C för polymerisation av ECM.
- Slutligen täck ECM med 500 μL odlingsmedium innehållande musepidermal tillväxtfaktor (EGF), rekombinant mus R-spondin 1 och rekombinant mus Noggin vid rumstemperatur. Den slutliga koncentrationen av material per brunn är följande: penicillin-streptomycin (1%), 50 U / ml vardera; gentamicin (0,5%), 25 μg/ml; EGF, 20 ng/ml; Noggin, 100 ng / ml; R-spondin 1, 500 ng / ml; L-glutamin, 2 mM.
- Starta kryptkulturen vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
OBS: För odlingsmediet för organoider i en platta med 24 brunnar, se tabell 1. - Utför långvarig live-avbildning för att observera organoidmorfogenes med ett inspelningstidsfördröjningsbildmikroskop utrustat med ett 20x-mål var 3: e timme i upp till 7 dagar. Hämta seriella z-staplade bilder i z-steg på 1 μm (1 μm x fem steg).
- Byt medium varannan dag.
3. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
- Isolera krypter från mössen (se avsnitt 2).
- Behandla de isolerade krypterna med 2 ml trypsin i 30 minuter vid 37 °C.
- Stoppa reaktionen med 10 ml PBS och passera sedan genom en 20 μm cellsil.
- Centrifugera lösningen vid 390 × g i 3 min vid 4 °C och suspendera igen med 100 μl komplett DMEM.
- Tillsätt anti-EphB2 APC-konjugerad antikropp (1/50) och inkubera i 30 minuter på is.
- Tvätta cellerna 3x med PBS och tillsätt slutligen 7-amino-aktinomycin D (7-AAD) (1/100).
- Sortera de färgade cellerna via FACS.
- Justera areaskalningsfaktorn och sortera efter cellstorlek (framåtspridning, FSC-A) kontra kornighet (sidospridning, SSC-A).
- Sortera 7-AAD negativa och positiva celler för livskraft med laseruppsättningen vid en våglängd på 488 nm och 50 mV effekt.
- Avgränsa grindarna för att sortera EphB2-höga (EphB2höga), EphB2-medium (EphB2 med), EphB2-låga (EphB2låga) och EphB2-negativa (EphB2neg) cellermed lasern inställd på en våglängd på 640 nm och 100 mV effekt.
- Starta EphB2högcellsodling vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator .
4. Encelliga odlade organoider
- Utför cellisoleringsmetoden enligt graderade EphB2-ytnivåer11 och få sedan fyra distinkta populationer (hög, medium, låg och negativ).
- Samla, pellet med centrifugering vid 390 × g i 3 min vid 4 °C och bädda in de enkelsorterade EphB2-högcellerna i ECM genom pipettering, följt av sådd på en 24-brunnsplatta (100 singlets/40 μL ECM/brunn).
- Som i steg 2.14, låt ECM polymerisera och täck ECM med ett odlingsmedium innehållande en Rho-associerad kinas (ROCK) -hämmare (10 μM) under de första 2 dagarna för att upprätthållaEphB2-högcellerna .
OBS: ROCK-hämmaren är effektiv mot anoikis. - Inspektera cellerna manuellt med ett inverterat mikroskop vid 40x förstoring och observera livskraftiga organoider med sfäroidbildning och kryptutsprång.
Representative Results
För att generera musens tunntarmsorganoider kan en kombination av EDTA-behandling och en mekanisk isoleringsmetod användas för att effektivt isolera krypter10,13. Resultaten av denna studie visade att nästan alla isolerade krypter omedelbart förseglades och verkade konformade efter att de pressades ut ur epitelnischerna (figur 1A). För att minimera villuskontaminering leddes den resulterande suspensionen genom en 70 μm cellsil och därefter centrifugerades filtratet. Eftersom vissa krypter störs under filtrering och upphängning bör dessa steg utföras noggrant. Resultaten visade att nästan alla krypter i slutfraktionen var integrerade och lämpliga för användning i kultur (Figur 1B). För att visualisera alla pläterade krypter individuellt pläterades 100 krypter per brunn (figur 1C). Efter tillsats av det specifika kryptodlingsmediet (figur 1D) övervakades utvecklingen av organoider med ett mikroskop dagligen. Vidare observerades organoidtillväxt från krypterna genom timelapse-bilder för att övervaka deras utveckling (figur 1E och kompletterande video S1). De kultiverade kryptorna betedde sig på ett stereotypt sätt. Organoidens inre lumen fylldes med en massa apoptotiska celler. Aktiv spridning och differentiering av ISC inträffade i kryptregionen med spirande (figur 1E och kompletterande video S1). Budding var kopplad till ISC-migration och proliferation och Paneth-celldifferentiering. De differentierade Paneth-cellerna var alltid belägna på den spirande platsen (kompletterande figur S1). Eftersom organoiderna bekräftades vara stabila i odling med hjälp av ett inverterat mikroskop vid 10x förstoring, kunde tekniken användas för att undersöka kryptbildning i den utvecklande tunntarmen och för att bestämma kapaciteten för vävnadsregenerering och ISC långsiktig överlevnad för produktion av nya tarmepitelceller14,15,16.
Lgr5 definieras som en ISC-markör och murina Lgr5+-celler bildar 3D-organoider7. Men eftersom cellytans överflöd av LGR5-protein är lågt och det saknas anti-LGR5-antikroppar med hög affinitet, är det utmanande att effektivt isolera murina ISC med FACS. EphB2 har tidigare identifierats som en ytmarkör för rening av murina och humana ISC från tarmvävnader17,18. Uttrycksmönstret för EphB2 ökar komplexiteten i ISC-markörer. EphB2-positiva celler är organiserade i hela det proliferativa facket, med topp i botten av krypterna, medan de minskar i en gradient mot toppen av krypterna11. Paneth-celler och stamceller är också lokaliserade vid kryptan. Paneth-celler uttrycker huvudsakligen EphB3, vilket krävs för deras positionering, och stamcellerna ovanför dem i kryptan uttrycker huvudsakligen EphB2. Således kan kontaminering av båda celltyperna inträffa under ISC-rening med användning av anti-EphB2-antikroppen. Följaktligen bör deras markörgenuttryck och den organoidbildande kapaciteten hos celler isolerade med EphB2 av FACS bedömas.
Baserat på dessa fakta, med hjälp av FACS-analys, kan EphB2 ytmärkta celler isoleras från WT-krypter19. Det har undersökts om EphB2-uttryck kan skilja mellan fyra grupper med uttryck av specifika markörer, såsom ISC-specifika markörgener (Lgr5, Ascl2 och Olfm4) och stamcellsspecifika markörgener (Ki67, Myc och FoxM1). Detta experiment visade att EphB2höga celler var övervägande ISC, till skillnad från EphB2med celler20,21. Slutligen, baserat på cellisoleringsmetoden, delades de erhållna cellerna in i fyra grupper (EphB2hög, EphB2med, EphB2låg och EphB2neg celler) (Figur 2). Därefter odlades enstaka celler som uttryckte höga nivåer av EphB2 sorterade efter FACS för organoidtillväxt. En enda EphB2högcell kan oberoende appliceras för lokal behandling och återskapa självorganiserande krypt-villösa strukturer som påminner om den normala tunntarmen (figur 3). Cellerna härledda från andra grupper (EphB2med, EphB2low och EphB2neg) genererar emellertid inte organoider20.
I en tidigare studie kunde ~ 6% av enstaka Lgr5-GFPhi-celler initiera krypt-villösa organoider7. De återstående cellerna kunde emellertid inte generera organoider och dog inom de första 12 h7. Författarna antog att detta var resultatet av fysisk och / eller biologisk stress som är inneboende i isoleringsproceduren7. Mindre än 6% organoidtillväxt erhölls också från enstaka sorterade EphB2-höga celler i WT-möss. Vid dag 5 av kulturen bildades sfäroidliknande strukturer (figur 3). Från dag 7 till dag 9 inträffade evagination av fläckarna för att bilda krypter (figur 3). Viktigt är att appliceringen av en utvald ROCK-hämmare på de enstaka sorterade EphB2-högcellerna minskade dissociationsinducerad apoptos och ökade effektiviteten av organoidtillväxt.
Figur 1: Generering av musorganoider i tunntarmen. (A) Krypter beredda genom en kombination av EDTA-kelering och mekanisk dissociation. (B) Resulterande renade krypter. (C) Krypter inbäddade i den extracellulära matrisen. (A–C) De svarta pilarna indikerar krypter. (D) Tredimensionell kultur av krypter och organoider. (E) Representativa bilder av en växande organoid som härrör från en krypta. De vita pilarna indikerar kryptspirande. Skalstreck = (A-C) 100 μm och (E) 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödescytometri grindstrategi för att erhålla en population av EphB2-positiva (EphB2+) celler i vildtypsmöss. (A) Framåt- och sidospridningsdiagram används för att separera cellerna beroende på deras storlek respektive granularitet. (B) Fluorescensspridning används för att separera viabla celler enligt cellernas 7-AAD (PerCP) fluorescensintensitet. Porten för den 7-AAD-negativa cellpopulationen valdes. (C) Portarna för EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) och EphB2-negative (EphB2neg) cellpopulationer valdes. Förkortningar: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = sidospridningstoppare; 7-AAD = 7-amino-aktinomycin D. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tidsförlopp för enkelsorterad EphB2högcellig organoidtillväxt hos vildtypsmöss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Odlingsmedium för en platta med 24 brunnar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande video S1: Time-lapse-bilder av en växande organoid. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Representativ bild av anti-lysozymantikroppsfärgning i en organoid. De vita pilarna indikerar Paneth-celler. Förkortning: DIC = differential interferens kontrastmikroskop. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att konsekvent isolera tunntarmskrypter och den efterföljande kulturen av 3D-organoider. För att förbättra krypteringsfrisättningshastigheten etablerades en mekanisk isoleringsmetod med kraftig skakning efter behandling med EDTA. Mediesammansättningen skiljer sig från det ursprungliga protokollet från Sato et al.7. Det ursprungliga mediet är relativt kostsamt. Således visas ett odlingsmedium och anpassade medier för murina tunntarmsorganoider innehållande farmakologiska hämmare, rekombinanta tillväxtfaktorer och/eller konditionerade medier i tabell 1. Wnt3A och N-acetylcystein ingår inte i odlingsmediet i detta protokoll. När Paneth-celler uttrycker Wnt3 producerar cellerna Wnt3 och stöder ISC-underhåll. Dessutom, under kryptisolering, används inte det konditionerade mediet. Organoidmodellen är dynamisk och har cellulär och strukturell heterogenitet (Paneth-celler, enterocyter, bägarceller, enteroendokrina celler, tuftceller och ISC). Därför kan dessa organoider användas i stor skala för att studera grundläggande frågor om organoidbiologi.
EphB2-gradienten upprätthåller ISC-stamhet och spridning längs krypt-villusaxeln i den vuxna tunntarmen18. Fördelen med att göra organoider från en enda EphB2-cell jämfört med isolerade krypter avser att förstå biologin hos murina ISC: er, eftersom ISC spelar nyckelroller i olika mänskliga tarmsjukdomar. Enstaka EphB2höguttryckande ISC kan odlas för att bilda organoider på ett liknande sätt som utvecklingen av organoider från enstaka Lgr5-uttryckande ISC. Det viktigaste steget är att exakt dela upp cellerna i fyra grupper (EphB2hög, EphB2 med, EphB2låg och EphB2neg) enligt EphB2-uttrycket i krypternamed FACS. Framåt kontra sidospridningsdiagram (FSC kontra SSC) används ofta för att identifiera intressanta celler baserat på deras storlek och granularitet. FSC anger cellstorleken och SSC relaterar till cellens komplexitet eller granularitet i P0-grinden (figur 2A). I detta arbete analyserades därefter cellerna som föll inom den definierade grinden (P0) för livskraft. Därefter bestämdes deras livskraft enligt de negativa och positiva populationerna av 7-AAD-fluorescenssignaler. Gränsen mellan de 7-AAD-negativa och -positiva cellerna bestämdes strikt för att få de negativa med minimal positiv cellkontaminering. EphB2-grindarna sattes grovt baserat på EphB2-graderat uttryck.
För att bekräfta att de fyra grupperna var exakt uppdelade analyserades mRNA-uttrycket av utvalda gener. MRNA-nivåerna av ISC-markörer är höga i EphB2höga celler20. Dessutom är mRNA-nivåerna av stamcellsspecifika markörer relativt höga i EphB2med celler20. EphB2-exdpressionen i EphB2låga och EphB2neg-celler är dock låg eller negativ jämfört med EphB2hög och EphB2med celler20. Föregående åtgärder bör vidtas för att säkerställa anrikning avEphB2-högcellspopulationen före plätering. Organoidtillväxt på mindre än 6% från EphB2höga celler kan dock bero på stamcellernas död under odlingsprocessen, inte den kraftiga skakningen under kryptisoleringen. Det har visats att tillämpningen av en selektiv Rho-associerad kinas (ROCK)-hämmare på mänskliga embryonala stamceller markant minskar dissociationsinducerad apoptos22. Således, som en teknisk förändring, är det värt att försöka tillsätta ROCK-hämmaren i en högre koncentration och med en längre inkubation för att förbättra livskraften.
Wnt3A-utsöndrande Paneth-celler bredvid ISC ger viktigt stöd till ISC8. Faktum är att ISC-Paneth-celldubbletter uppvisar en starkt ökad organoidbildande kapacitet jämfört med enskilda ISC8. Dessutom har tillsatsen av Wnt3A vid koncentrationen 100 ng/ml under de första 3 odlingsdagarna visat sig öka den organoidbildande kapaciteten8. Således, som en annan teknisk förändring, kan tillägg av exogent Wnt3A förbättra organoidbildande kapacitet hos enstaka EphB2höguttryckande ISC.
Jämfört med in vivo-metoder kan organoider enkelt användas för genetisk manipulation, analys av malignitetsfenotyper och läkemedelsscreening20,23. En kombination av EDTA-kelering och en mekanisk isoleringsmetod är effektiv, reproducerbar och tidseffektiv för att skapa tunntarmsorganoider från krypter och kan enkelt följas av laboratoriepersonal utan avancerad erfarenhet. Således kan tillsatsen av den mekaniska isoleringen med kraftig skakning efter behandlingen med EDTA effektivt etablera murina tunntarmsorganoider ex vivo och ge ett potentiellt verktyg för organoidodling och sjukdomsmodellering av andra vuxna epitelvävnader.
Intestinala epitelceller är polariserade och orienterade med den apikala sidan riktad mot lumen. Den apikala sidan som vetter mot lumen av 3D-organoider är dock i deras inre. Således förhindrar denna organisation åtkomst till den apikala sidan, vilket är ett problem när man studerar effekterna av luminala komponenter, såsom näringsämnen, mikrober och metaboliter på epitelceller. För att kringgå denna nackdel har en odling av organoidceller som 2D-monolager utvecklats24. När det gäller framtida tillämpningar kommer kulturen av organoidcellmonolager att utnyttjas, eftersom detta representerar det mest effektiva och lätthanterliga systemet.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) till T.T. (bidragsnummer JP17K07495 och JP20K06751). Vi tackar professor Mineko Kengaku för användningen av utrustning för långsiktig time-lapse-avbildning (LCV100; Olympen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
