Summary
本研究描述了一种工作流程，用于确定和比较单个感兴趣区域（例如，年龄相关性黄斑变性 [AMD] 中的玻璃膜疣和视网膜下玻璃膜疣样沉积物）的自发荧光水平，同时考虑整个眼底的不同自发荧光水平。
Abstract
眼底自发荧光 （FAF） 成像允许对眼底的内在荧光团进行无创映射，特别是视网膜色素上皮 （RPE），随着基于共聚焦扫描激光检眼镜的定量自发荧光 （QAF） 的出现，现在可以量化。研究显示，在年龄相关性黄斑变性 （AMD） 中，QAF 在后极普遍降低。QAF 与各种 AMD 病变（玻璃膜疣、视网膜下玻璃膜样沉积物）之间的关系尚不清楚。
本文介绍了确定 AMD 病变特异性 QAF 的工作流程。使用多模态 活体 成像方法，包括但不限于光谱域光学相干断层扫描 （SD-OCT）、黄斑体积扫描和 QAF。使用定制的FIJI插件，相应的QAF图像与SD-OCT扫描的近红外图像（特征标志，即船只分叉）对齐。在OCT图像中标记中央凹和视神经头的边缘（并转移到注册的QAF图像中），以便准确定位分析网格。
然后可以在单个 OCT BScan 或 QAF 图像本身上标记 AMD 特异性病变。创建规范 QAF 图以解释整个眼底 QAF 值的变化平均值和标准偏差（对代表性 AMD 组的 QAF 图像进行平均以构建规范标准视网膜 QAF AMD 图）。这些插件记录 X 和 Y 坐标、z 分数（一种数值测量值，用于描述与 AF 贴图平均值相关的 QAF 值，表示与平均值的标准偏差）、平均强度值、标准偏差和标记的像素数。这些工具还可以根据标记病变的边界区域确定 z 分数。该工作流程和分析工具将提高对AMD病理生理学和临床AF图像解释的理解。
Introduction
眼底自发荧光 （FAF） 成像可对眼底1 的自然和病理性荧光团进行无创映射。最常见的蓝色（488 nm激发）自发荧光（AF）激发视网膜色素上皮（RPE）的脂褐素和黑素颗粒2,3,4。颗粒的分布和增加/减少在正常衰老和各种视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性 （AMD））中起着核心作用5。
FAF 的进一步发展，即定量眼底自发荧光 （QAF），现在可以准确测定地形分辨的视网膜 AF 强度 4,6。通过将参考纳入 FAF 成像设备的光路，可以比较设备、时间点和被摄体之间的自动对焦强度。该技术导致了 AMD 中假定的致病因素的范式转变，长期以来，人们推测这是由于 RPE 细胞中脂褐素的过度积累7。然而，AF 的组织学和临床定量显示 AMD 的 AF 减少（由于自发荧光脂褐素和黑素寡藻素颗粒的重新分布和丢失），而不是 AF8、9、10 的拟议增加。
监测心房颤动具有临床意义。Von der Emde 等人等人表明，在高危、中度 AMD 眼中，AF 不仅降低，而且在 AMD 过程中进一步降低 8,9。此外，组织学研究表明，大多数受 AMD 影响的 RPE 细胞在 RPE 细胞通过俯冲、脱落、迁移或萎缩而丢失之前表现出颗粒聚集和挤出的特征性行为13,14,15,16。这进一步表明，心房颤动丧失可能是即将疾病进展的触发因素或替代信号。
到目前为止，QAF 研究仅在使用预制网格极坐标系（例如 QAF8/Delori 网格）的后极点上评估了全局 AF 17。使用预制网格测量自动对焦会导致被摄体每只眼睛的预定区域产生多个自动对焦值。以这种方式研究心房颤动值可能会错过心房颤动病理改变区域的局部变化，例如，在玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物 （SDD） 顶部或附近的 AMD 中。玻璃膜疣和更高程度的 SDD 与晚期 AMD 和视力丧失的高风险相关。特别是玻璃膜疣，其典型的周期是多年内体型增加，并可能在萎缩前迅速恶化。可以想象，例如，AMD的整体心房颤动会降低，但在这些特定的疾病相关局灶性病变中和周围会增加甚至进一步减少。
不同的局部心房颤动模式也可能与疾病进展的预后相关。例如，自发荧光水平可用于评估玻璃膜疣的大小是否正在增加或已经消退为萎缩。已经表明，地理性萎缩中 AF 病灶周围模式的改变在很大程度上影响了萎缩的进展18。此外，局部自发荧光模式可以揭示RPE健康状况的更多细节。光学相干断层扫描 （OCT） 通常显示脉络膜毛细血管的超反射，但 RPE 层看起来完好无损。结合局部 QAF 值和 OCT 的多模式方法可能有助于鉴别具有 RPE 破坏和即将萎缩的高风险病变。
研究中没有进行空间分辨分析的一个原因是，最常用的制造商软件没有提供这些类型分析的工具。不同病变的心房颤动特性取决于AMD疾病分期，可以进一步解释AMD的发病机制。因此，需要一种工具来测量区域性、病变特异性心房颤动。为了准确比较位于整个视网膜的病变，工作流程需要一种方法来解释人体眼底中不同程度的心房颤动19。最核心的是，由于黄斑色素的阴影效应和不同的颗粒计数20,21，AF 特征性较低。
AF 在 ~9°（所有方向上到中央凹的距离）达到峰值，并在外周更大程度上降低4.因此，如果要比较软玻璃膜疣（位于低 AF 区域的中央凹和副中央凹）和 SDD（位于高 AF 区域的中央凹），结果将不具有可比性22。受 Pfau 等人的研究和眼底控制视野测量的灵敏度损失概念（在 AMD 中测量的视力山的灵敏度 [视网膜敏感性随着与中央凹的距离下降]）的启发，将 AF 与整个黄斑的标准化 AF 值进行比较23,24。结果报告为 z 分数（感兴趣区域值与均值关系的数值测量值）。
本研究的目的是评估使用一种新工具来测量 AMD 患者不同类型病变中的局部 QAF 水平。该工具旨在测量 OCT 扫描中发现的病变的自发荧光水平。这样可以评估病变（如软玻璃膜疣或 SDD）的局部自发荧光水平，并允许跟踪病变随时间变化的 AF 变化。该工具的潜在用途是启用一种新的结构生物标志物，该生物标志物可以估计 RPE 的健康状况，并可能对所研究的病变具有预后价值。
Protocol
该研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到了波恩大学伦理委员会的批准（协议代码305/21）。从参与研究的所有受试者那里获得了书面知情同意书。我们要求视频中的所有参与者签署授权书，允许我们在制作在线视频时使用他们的肖像和个人信息。
1. 定量自发荧光（QAF）图像采集
- 为了使用 QAF 设备进行准确的图像采集，请确保参与者舒适地坐在设备前。让参与者将下巴和前额压在下巴和头枕上。调整下颌托的高度，直到侧眼睑角度与红色标记的高度相同。
- 通过旋转记录设备上的轮子，直到小血管对焦，确保图像以近红外模式聚焦。通过向前移动相机来放大眼睛，直到图像的角落被均匀照亮。根据经验，将焦点调整到等效球面。在 QAF 成像之前将焦点降低一个或两个屈光度，因为蓝色 QAF 使用较短的波长，并将 QAF 设备的模式从近红外模式切换到 QAF 模式。
- 重新调整和放大照明并微调图像的焦点，直到最靠近中央凹的小血管对焦，并且图像明亮明亮，没有红点（表示过度照明）。在图像采集之前，通过在 QAF 模式下等待至少 30 秒来漂白光色素，以允许持续的蓝光激发在相机设置的视野中漂白感光色素。
- 要捕获图像，请按成像设备触摸板上 的图像采集 ;确保拍摄多个 QAF 图像，以防在采集过程中出现眨眼或突然眼球运动。
注：该工作流程还需要光谱域光学相干断层扫描 （SD-OCT） 图像。OCT图像采集详见其他专题，因为它在临床实践中被广泛使用25。
2. 图片导出
- 对于此分析管道，请确保 QAF 和 OCT 映像采用可扩展标记语言 （XML） 文件格式。在 HEYEX 查看器中，右键单击所需的 QAF/OCT 图像，然后从下拉菜单中选择 “导出 | 为 XML ”。
3. QAF分析开源插件-安装流水线
注意：所提供的 QAF 软件是为开源软件 ImageJ（FIJI 扩展）26 创建的名为“Spectralis pipeline”的开源插件。
- 要访问该插件，请打开 FIJI，从下拉菜单中选择“帮助”，然后选择“更新”，然后单击“管理更新站点”，将 Creative Computation 更新站点“https://sites.imagej.net/CreativeComputation/”添加到预先存在的更新站点。
- 下载插件，然后重新启动 FIJI。现在，Spectralis Pipeline 已安装。不同的 Spectralis 插件位于下拉菜单 Plugins |Spectralis 或 插件 |SpectralisBatch。
4. 设置 - 数据存储
注意：为了实现无缝的工作流程，建议按如下 方式设置文件夹结构 。首先，为每个研究对象设置一个文件夹。Oculus dexter （OD） 和 oculus sinister （OS） 分别指右眼和左眼，这些缩写在整个工作流程中使用。
- 对于每个研究对象的每只被检查的眼睛，为 OCT 设置一个文件夹，分别命名为 OD_OCT 和 OS_OCT。让 Spectralis 管道自动将其从“Mark_BScans_OCT”插件的输出存储为这些文件夹中的制表符分隔值。
- 对于 QAF 映像，创建两个名为 OD_QAF 和 OS_QAF 的文件夹。
- 如果使用其他多模式成像模式，请创建其他文件夹。确保生成的文件夹结构类似于下面列出的结构：
CASE_ID
OD_OCT
OD_QAF
OD_other_imaging_modality
OS_OCT
OS_QAF
OS_other_imaging_modality
5. 将 QAF XML 文件转换为 QAF 映像（使用的插件：QAF_xml_reader）
- Spectralis QAF XML 导出文件以红-绿-蓝 （RGB） 格式存储，限制为 0 到 255（代表测量的 AF 值），包括“标准”和“黑色”校准区域。“QAF_xml_reader”插件生成 QAF 映像。为此，请打开 插件 下拉菜单，选择 Spectralis |QAF_XML_Reader，然后丢弃打开屏幕。
- 此时将显示一个新窗口，显示提示 Choose a directory containing a Spectralis XML QAF Export：。 选择 目录 ，然后单击 选择。
- 输入 QAF 设备的参考校准因子 （RCF）（包含在 QAF 图像的图像信息中）和拍摄图像时 患者的年龄 。
- 下一个窗口称为 QAF 参数。如果患者在图像采集时是假晶状体，则选择 20 岁（这会产生不应用年龄校正的效果）。单击“确定”后，当出现标记为“映射到 8 位”的弹出窗口时，输入颜色编码的 QAF 图像的最小 QAF （qafMin） 值和最大 QAF （qafMax） 值。如果 qafMin 和 qafMax 未知，请使用默认设置，单击“确定”，然后观察显示标记为“原始 QAF 数据”的原始图像，以及 32 位 QAF 和 8 位颜色编码的 QAF 图像。
注意：颜色编码的 QAF 图像仅用于说明目的;使用具有实际 QAF 值的 32 位 QAF 图像进行进一步分析。
6. 将 QAF 映像注册到 OCT 映像（使用的插件：Register_OCT_2）
注意：需要此步骤才能将 OCT 图像与 QAF 图像准确对齐，以便对齐 QAF 图像和 OCT BScan 中的病变。
- 通过下拉菜单访问插件 |Spectralis，或创建一个热键来访问所使用的不同插件。为此，请在“插件”|Register_OCT_2”快捷方式 |添加快捷方式并选择所需的热键。
- 打开插件后，在出现的第一个窗口中单击 “确定 ”。接下来，ImageJ 主窗口中将出现一个包含提示符的窗口： Choose a directory containing the Spectralis OCT XML export： 。选择包含 Spectralis OCT XML 导出 的文件夹，然后单击 “打开”。
注意：OCT 现在将加载，根据所用计算机的处理能力，这可能需要长达 2 分钟的时间。 - 接下来，等待一个窗口，其中包含提示 将注册的图像保存到： 弹出。选择 将存储EnFaceStack （对齐的图像文件）的目录，然后单击 “打开”。
- 等待弹出窗口，其中包含提示 Choose an image to add to the EnFaceStack： 要显示，请选择 32 位 QAF 图像以将图像与 SD-OCT 对齐，然后单击 Open。如果此 EnFaceStack 中包含所有必要的图像，请选择 “取消”。
- 当下一个窗口要求用户为 EnFaceStack 选择标签时，选择预制的 QAF 标签;或者，在“其他”框中输入所需的模态名称。选择“ 确定 ”以注册映像。
注意：请勿在 “其他 ”字段中包含空格或其他标点符号。 - 观察弹出的三个窗口。第一个标记为 Localizer，并将 SD-OCT 显示为左眼 （OS） 图像。第二个窗口被命名为 QAF 或之前选择的其他模式之一，作为原始左眼 （OS） 或右眼 （OD）。最后一个窗口称为地标，它要求在每个图像中选择一到三个地标。
- 通过为每个图像选择一到三个地标来对齐两个图像-容器分叉或位于两种模式上的其他特征。在选择地标之前放大（使用“+”键盘字符放大，“-”缩小）。确保所选地标在图像中垂直和水平展开。批注所有地标后，在“地标”选项卡上选择“确定”，然后在下一个提示中选择“取消”。
- 当出现提示是否 要查看结果 的窗口时，选择 “是 ”以检查图像是否已正确对齐。为此，请放大一个小容器并将光标放在它旁边，然后向上或向下滚动以检查容器相对于光标移动了多少。如果对齐方式不精确，请删除OD_QAF目录中的“.tiff”文件，然后从步骤 2 开始重新启动该过程。
注意：由于Mark_BScans_OCT上的标记必须精确，因此 SD-OCT 和 QAF 图像之间的对齐也必须非常准确。在大多数图像上都可以实现像素完美的对齐，但在某些情况下，对齐的精度仅限于三到四个像素。
7. 创建用于比较的平均 QAF 图像（使用的插件：StandardRetina/BatchStandardRetina）
注意：QAF 值很大程度上取决于视网膜位置（例如，由黄斑色素引起的中央阴影）。因此，应将玻璃膜疣的QAF值与同一区域的标准QAF值进行比较。作为分析的先决条件， StandardRetina 会创建平均 QAF 图像（例如，来自年龄匹配的对照队列）的面图。生成的 enface 图显示了中央视网膜平均 QAF 值的逐像素图。
- 在 Spectralis 管道中有两种方法可以创建标准视网膜：第一种是 AddToStandardRetina_OCT，允许一次向 enface 映射添加一个新案例，而第二种方法， 即 BatchStandardRetina，一次添加多个案例。
- 要一次添加一个图像，请选择 “插件”|”光谱 | AddToStandardRetina_OCT 并关闭打开屏幕。当弹出一个窗口，显示文本 选择包含 Spectralis OCT XML 导出的目录时，选择 文件夹 并单击 “选择 ”以打开 BScan。
- 当出现一个新窗口，显示提示“ 选择包含已注册的 EnFace 图像的目录：”时，选择 相应的文件夹 ，然后单击 “选择”。
- 观察弹出的三个窗口，一个标记为 EnFaceStack ，显示第二步中所选文件夹中的堆叠图像，第二个标记为 Bscan Stack 显示 OCT BScan ，第三个窗口出现在中间，标记为 选择模式。从 EnFaceStack中选择一种模式。
- 选择一种模式并观察弹出的新窗口，该窗口显示提示“选择包含 StandardRetina 的目录”。如果包含 StandardRetina 的目录尚不存在，请选择一个空文件夹以创建新的 StandardRetina。
- 检查新的 StandardRetina，上下滚动，然后移动光标以查看该特定位置的平均值和标准差。点击 按钮 接受？ 将最新照片添加到 StandardRetina 或将其丢弃。
- 若要一次添加多个图像，请使用 Batch_QAF_StandardRetina。
- 首先，在与案例 ID 相同的文件夹中准备一个“manifest.txt”文件，并确保它列出了从 .txt 文件位置到 OCT 和 EnFaceStack 的相对路径。用制表符隔开两者，并确保名称前后没有额外的空格。该文件应类似于以下设置：
pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF - 在电子表格软件中创建文件并将其保存为 txt 文件。确保所有路径都包含切片（字符字母） QAF ，以便清单文件正常运行。插件位于下拉菜单 Plugins |SpectralisBatch-批处理 | QAF_StandardRetina。
- 关闭打开的屏幕并等待新窗口打开，显示提示：选择初始标准视网膜。选择具有预先存在的 StandardRetina 的文件夹，或选择一个空文件夹以创建新的 StandardRetina。
- 查找标有“选择模态”的提示;默认值为 QAF。确保相应模态的文件名与清单文件中命名的每个EnFaceStack中切片的文件名完全匹配。接下来，当打开一个窗口提示用户选择清单文件（如前所述）时，如果没有其他清单文件添加到此 StandardRetina，请单击“取消”，或者选择另一个清单文件。在标记为“接受”的新窗口中检查新的 StandardRetina，并决定是将最新批次添加到 StandardRetina 还是丢弃最新批次。
注意：将所有 QAF 组合到 StandardRetina 的过程可能需要一段时间。
- 首先，在与案例 ID 相同的文件夹中准备一个“manifest.txt”文件，并确保它列出了从 .txt 文件位置到 OCT 和 EnFaceStack 的相对路径。用制表符隔开两者，并确保名称前后没有额外的空格。该文件应类似于以下设置：
8. 注释感兴趣的分析区域（使用的插件：Mark_BScans_OCT）
- 要标记病变（如玻璃膜疣），请打开 插件 |光谱 |Mark_BScans_OCT 并关闭打开提示。查找标有 “选择包含 Spectralis OCT XML 导出的目录” 的新窗口。选择具有所需 OCT 的文件夹，然后单击 “确定”。
- FIJI 加载 OCT 后，观察带有标签的新窗口 选择要显示的包含 已注册人脸图像的目录 。选择包含 EnFaceStack 的目录，然后单击 “选择”。
- 现在出现三个新窗口，一个标记为 EnFaceStack，一个标记为 BscanStack，另一个名为 “用户参数”。
- “用户参数”窗口提示用户输入以下 参数 ： 案例 ID（随后将出现在输出 csv 文件的名称中）、 带宽（以毫米为单位）、 面线宽度、 BScan 线宽和 区域掩码不透明度。
- 以毫米 为单位 的参数带宽决定了每个等壳体的宽度，以毫米 （mm） 为单位。使用 Enface 线宽更改标记为 EnFaceStack 的窗口上标记病变的线宽。
- BScan 线宽决定了窗口 Bscan 堆栈上的线宽。请注意，在大多数情况下，将此参数设置为 1 是最佳线宽设置。
- 在单独窗口中显示的 En Face Mask 或 Distance Map 之间进行选择，以决定是否应为内部带子着色。然后，在插件的“在 BScan 中标记”窗口中单击“完成”。
- 接下来，当系统提示您选择预先存在的 StandardRetina 时，请选择包含 StandardRetina 的文件夹，然后单击“选择”。 请注意，如果选择了 StandardRetina，则输出Mark_BScans_OCT将选择模式 z 分数（与 StandardRetina 相比的测量 QAF 值）。如果首选原始 QAF 值，请单击“取消”并等待标记为“消息”的新窗口，该窗口警告结果将是原始值，而不是 z 分数。
- “用户参数”窗口提示用户输入以下 参数 ： 案例 ID（随后将出现在输出 csv 文件的名称中）、 带宽（以毫米为单位）、 面线宽度、 BScan 线宽和 区域掩码不透明度。
- 查找要弹出的新窗口，提示 选择包含已保存状态和已 保存数据的目录。如果存在保存文件，请单击 包含切片的目录 |选择。如果不保存进度，请选择 取消。 在 BScan 中查找标记为“标记”的新窗口，然后从下拉菜单中选择 “保存”、“忽略”、“完成”和 “标记”。
- 马克：开始在 BScan 中注释感兴趣的区域，使用与上述“Register_OCT_2”插件中类似的命令。要标记区域，请右键单击并将鼠标光标拖动到病变的末尾，选择“开始”，确保在“在 B-Sscan 中标记”窗口中选择了“标记”，然后单击“确定”。感兴趣的区域现在在此 BScan 中标记。
- 忽视：在“在 BScan 中标记”窗口中选择“忽略”，然后单击“确定”以忽略标记。
- 救：在“在 BScan 中标记”窗口中选择“保存”，然后单击“确定”以显示一个新窗口，其中包含选择要保存状态的目录的提示。 选择已存在的文件夹或创建一个新文件夹。通过启动“Mark_BScans_OCT”打开现有文件，并在出现“选择包含已保存状态的目录”窗口时选择包含保存状态的目录。
注意：不能在一个目录中存储多个保存状态;保存状态从一个语言环境切换到另一个语言环境不能轻易切换（例如，德语到美国）。 - 做：在“在 BScan 中标记”窗口中选择“完成”，然后单击“确定”以显示带有标签选择模式的新窗口。
- 当出现标记为“将正确的模态放在 enface 堆栈顶部”的提示时，将名为 QAF 的模态放在顶部，该模态使用“Register_OCT_2”对齐。为此，请滚动浏览 EnFaceStack，选择 En face Stack 窗口，或单击向左或向右箭头。请注意，模态的名称显示在左上角。
- 为了更好地检查和标记病变，请放大 Bscan 窗口。点击 B扫描 窗口，将鼠标指向放大方向，按 + 键;要缩小，请按 - 键。
- 通过在鼠标上向上或向下滚动，向左或向右拖动底部的栏以在扫描过程中移动，或者通过选择B-Scan框架并单击键盘上的左右箭头键来滚动BScan堆栈。请注意，BScan 堆栈中当前区域的概览由 EnFaceStack 窗口上的红线提供，在 BScan 窗口的左上角显示 BScan 编号（例如，31/120）。
- 单击“ 确定 ”，在相应的“OD_OCT”或“OS_OCT”文件夹中创建新的 .tsv 文件。请注意，.tsv 文件名将由“Mark_Bscans_OCT”加上输入的案例 ID、偏性以及在Mark_Bscans_OCT的最后一步中选择的模式组成。 此外，玻璃膜疣的颜色编码“iso-hulls”现在将显示在 EnFaceStack中。
Representative Results
查看输出
为了充分分析结果并从中得出结论，了解 Mark_Bscans_OCT 的输出文件非常重要。前三列在案例 ID、文件的偏侧性和所选的成像方式之后进行标记。第四列按模式引用，并标记为 z 分数。请注意，在撰写本文时，Mark BScans 只能一次性计算所有病变;这些行是指等值壳，其与病变外边缘的距离在电子表格的下列和上列中指定。等壳体在病变周围指定圆周内以 z 分数（在 QAF 的情况下）测量 AF。请注意，等值包中像素的最小值可以在标记为 min 的列中找到，标记为 median、max、mean 和 stdev 的列分别包含等值包中像素值平均值的中位数、最大值、平均值和标准差。列 n 包含等值包中的像素总数。图 1 显示了一名 84 岁男性中度年龄相关性黄斑变性 （iAMD） 患者的单体明显软玻璃膜疣。
图 2 显示了用 QAF-Workflow 工具标记的 SDD 代表性患者的左眼（图 3）。该患者的 SDD 与心房颤动降低相关（z 评分 = -0.4 ± 0.2）。同样，与 StandardRetina 相比，SDD 周围的等值壳表现出降低的 AF（例如，最接近的等壳体 = -0.3 ± 0.3）。对这种现象的一个合理解释可能是 SDD 病变对 RPE 的阴影效应（半透明性降低）。SDD的使用堪称典范。该工具还可以评估其他病变（如玻璃膜疣）的局部心房颤动水平。此外，该工具允许跟踪病变随时间推移的 AF 变化。
图 1：一名 84 岁男性中度年龄相关性黄斑变性 （iAMD） 患者的单体标记软玻璃膜疣。 （A） 带有标记玻璃膜疣的左眼的 QAF 图像。（B）玻璃膜疣特写：棕色中心代表标记的玻璃膜疣，彩色带代表周围的等壳体。下表描述了输出文件。将 QAF 玻璃膜疣值与 StandardRetina 相应偏心率的相应 QAF 值进行比较。这会导致 z 分数表示与未受影响区域平均值的偏差。蓝色框从左到右显示：病例 ID、眼睛的偏侧性、使用的模态和所需的输出（在本例中为 z 分数）。橙色框中的列以毫米为单位显示测量区域的边界（下限 = 下限，上限 = 上限）。绿色框标记显示 QAF 测量值的列。从左到右，它们包含平均值的最小值、中位数、最大值、像素数、平均值和标准差。每行代表一个等壳体，蓝色框中的行表示病变内的值，紫色框内的行表示每个病变周围的等值壳体（从上到下，与病灶的距离增加）。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：一名 80 岁女性早期 AMD 患者的 QAF 图像中标记的 SDD。 （A） 在 QAF 图像中可以看到 SDD。（B）在每个标记的病变周围，用颜色编码（浅绿色，深绿色和红色）描绘等壳。（C） 蓝色矩形的放大版本。每个 SDD 的外边缘都标记为蓝色。缩写：QAF=定量自发荧光;AMD = 年龄相关性黄斑变性;SDD = 视网膜下玻璃膜疣样沉积物。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：确定病变 AF 的工作流程。该图可视化了确定病变特异性 AF 所需的软件插件。（A） 图像显示了颜色编码的 QAF 图像，可用于可视化 QAF 值的分布，但不应用于进一步分析。 （B） 前景为QAF图像，背景为SD-OCT扫描的红外图像。这应该使用容器分叉来可视化对齐。这可以使用 Register_OCT_2 插件来完成。（C） 用于测量病变的 z 评分值的标准视网膜。可以使用 StandardRetina/BatchStandardRetina 创建 StandardRetina。（D） 描绘了带有蓝色箭头指向 SDD 的 BScan，SDD 用黄线突出显示（注意：病变始终标记在 RPE 下方，与 z 方向的位置无关）。（E） 所有标记的病变都印在 QAF 图像上（见图 1）。最后两个步骤是使用 Mark_BScans_OCT 插件完成的。缩写：AF = 自发荧光;QAF = 定量自发荧光;SDD = 视网膜下玻璃膜疣样沉积物;IR = 红外线;RPE = 视网膜色素上皮;SD-OCT = 光谱域光学相干断层扫描。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
此工作流程提供了使用开源 FIJI 插件工具确定和比较 AMD 特异性病变的 AF 的分步指南。这些插件提供了易于使用的模板，不需要任何编码知识，医生可以在没有技术支持的情况下应用27.据我们所知，这些工具是用于病变特异性 AF 量化的一种工具。
QAF 值在整个视网膜上自然变化，由于视网膜内的脂褐素和黑素分布不均匀、血管 AF 低和黄斑色素分布不均匀，QAF 值在外围较高，在黄斑中较低。由于视网膜中自然发生的 QAF 水平变化很大，因此直接分析病变的绝对 QAF 值不是一种有前途的方法。例如，外周的低自发荧光病变可能仍具有高于黄斑生理性荧光水平的绝对 QAF 值。使用标准视网膜和使用 z 分数来测量玻璃膜疣的荧光水平，可以校正这种自然发生的 QAF 值方差。
z 分数是感兴趣区域值与 StandardRetina 中平均值关系的数值测量。它的计算方法是从同一位置的标准视网膜的平均值中减去个体的平均值，然后将结果除以标准差。这种标准化允许比较不同的 QAF 图像，因为 z 分数表示值与平均值相差多少个标准差。正 z 分数表示该值高于平均值，而负 z 分数表示该值低于平均值。
需要注意的是，可能存在应考虑的潜在陷阱。虽然这种方法解释了整个眼底不同数量的心房颤动水平，但它可能仍然不是测量和比较 RPE 心房颤动的最准确方法。个体具有不同的黄斑色素水平和地形，病变也可能影响上覆视网膜的半透明性28,29。因此，在 SDD 区域测得的 AF 降低（参见代表性结果）是阴影效应的结果，而不是 RPE30,31,32 中荧光团减少的结果。
我们目前正在研究一种工作流程，以使用线性混合模型来考虑视网膜反射率、厚度和量化的黄斑色素（使用绿色和蓝色自动对焦）。此外，到目前为止，QAF 使用年龄依赖性校正因子来解释透镜混浊，忽略了33 岁相似参与者的透镜混浊的个体间差异。因此，我们目前正在研究一种工作流程，用于对透镜状自发荧光和混浊进行个性化校正因子。为了可靠地从小病灶中提取 AF 信息，需要对 QAF 图像进行足够的重测可靠性。为了进一步区分那些可以进行更详细分析的 QAF 图像，我们正在研究可以预测 QAF 图像重测信度的“QAF 图像可靠性指数”。在现阶段，谨慎的方法是获取重复图像并研究病变特异性 AF 的复测可靠性。
由于相邻病变的等壳合并，所提出的额外分析病变等壳体的方法在技术上难以实现。合并等壳体的区域可以根据所考虑的病变进行独特的表征。我们的解决方案是将一种类型的所有病变视为一个病变，并将其外围分析为关节等壳。然而，这种方法大大降低了测量单个玻璃膜疣等壳的能力，并可能被认为是该技术的进一步缺陷。在技术上更复杂的方法来解释合并的等壳或在合并的等壳区域暂停报告AF，可以促进未来在病变周围分析AF。
我们使用AMD作为本研究的模型疾病。该工作流程也可以用于研究其他疾病的病变。到目前为止，QAF 已用于许多脉络膜视网膜疾病，包括隐性 Stargardt 病、Bestrophin-1 相关疾病、各种形式的视网膜色素变性、急性地带性隐匿性外视网膜病变、弹性假黄色瘤等 17,33,34,35,36,37.由于该工作流程使用开源软件，我们鼓励其他人在确定病变特异性心房颤动时重复这项工作，并扩展我们对视网膜疾病的了解。总之，我们提出了一个工作流程来确定和比较整个黄斑不同视网膜病变的 AF 水平。该工作流程为更深入地分析心房颤动铺平了道路，并可促进AMD及其他领域新生物标志物的开发。
Disclosures
莱昂·冯·德·埃姆德（Leon von der Emde）报告说，他收到了海德堡工程公司的付款。Merten Mallwitz没有报告任何财务披露。肯尼斯·R·斯隆（Kenneth R. Sloan）也没有报告任何财务披露。Frank G. Holz 报告了 Acucela、Alcon （C）、Gyroscope Allergan Apellis、Bayer Bioeq/Formycon、CenterVue、Roche/Genentech、Geuder、Ivericbio、NightStarX、Novartis、Optos、Oxurion、Pixium Vision、Stealth BioTherapeutics、Zeiss 和 GRADE Reading center 的咨询/个人付款。Thomas Ach 报告拜耳、Apellis、罗氏和诺华的咨询/个人付款。
Acknowledgments
这项工作由德国眼科学会（DOG）博士生资助（MW）和NIH/NEI 1R01EY027948（TA）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BatchStandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| FIJI (Image J) | n.a. | n.a. | n.a. |
| Mark_Bscans_OCT plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Microspft office | Microsoft | n.a. | n.a. |
| QAF_xml_reader plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Register_OCT_2 plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Spectralis | Heidelberg Engineering | n.a. | QAF extension |
| StandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
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