Summary
Denne forskning beskriver en arbejdsgang til at bestemme og sammenligne autofluorescensniveauer fra individuelle interesseområder (f.eks. drusen og subretinale drusenoidaflejringer i aldersrelateret makuladegeneration [AMD]), mens der tages højde for varierende autofluorescensniveauer i hele fundus.
Abstract
Fundus autofluorescens (FAF) billeddannelse muliggør ikke-invasiv kortlægning af iboende fluoroforer i den okulære fundus, især retinal pigmentepitel (RPE), der nu kan kvantificeres med fremkomsten af konfokal scanning laser oftalmoskopi-baseret kvantitativ autofluorescens (QAF). QAF har vist sig generelt at være nedsat ved den bageste pol i aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Forholdet mellem QAF og forskellige AMD-læsioner (drusen, subretinale drusenoidaflejringer) er stadig uklart.
Dette papir beskriver en arbejdsgang til bestemmelse af læsionsspecifik QAF i AMD. Der anvendes en multimodal in vivo-billeddannelsesmetode, herunder, men ikke begrænset til, spektraldomænets optiske kohærenstomografi (SD-OCT), makulær volumenscanning og QAF. Ved hjælp af tilpassede FIJI-plug-ins justeres det tilsvarende QAF-billede med det nær-infrarøde billede fra SD-OCT-scanningen (karakteristiske vartegn; dvs. fartøjsforgreninger). Foveola og kanten af synsnervehovedet er markeret i OCT-billederne (og overført til det registrerede QAF-billede) for nøjagtig placering af analysegitterne.
AMD-specifikke læsioner kan derefter markeres på individuelle OCT BScans eller selve QAF-billedet. Normative QAF-kort oprettes for at tage højde for den varierende middel- og standardafvigelse af QAF-værdier i hele fundus (QAF-billeder fra en repræsentativ AMD-gruppe blev beregnet i gennemsnit for at opbygge normative standard retinale QAF AMD-kort). Plug-ins registrerer X- og Y-koordinaterne, z-score (en numerisk måling, der beskriver QAF-værdien i forhold til gennemsnittet af AF-kort med hensyn til standardafvigelse fra middelværdien), middelintensitetsværdi, standardafvigelse og antal markerede pixel. Værktøjerne bestemmer også z-score fra grænsezonen for markerede læsioner. Denne arbejdsgang og analyseværktøjerne vil forbedre forståelsen af patofysiologi og klinisk AF-billedfortolkning i AMD.
Introduction
Fundus autofluorescens (FAF) billeddannelse giver en ikke-invasiv kortlægning af naturligt og patologisk forekommende fluoroforer af den okulære fundus1. Den mest almindelige blå (488 nm excitation) autofluorescens (AF) ophidser lipofuscin og melanolipofuscingranulat i retinale pigmentepitel (RPE)2,3,4. Fordelingen og forøgelsen/faldet af granulater spiller en central rolle i normal aldring og forskellige nethindesygdomme, herunder aldersrelateret makuladegeneration (AMD)5.
En videreudvikling af FAF, kvantitativ fundus autofluorescens (QAF), muliggør nu nøjagtig bestemmelse af topografisk opløste retinale AF-intensiteter 4,6. Ved at inkorporere en reference i FAF-billeddannelsesenhedens optiske vej kan AF-intensiteter sammenlignes mellem enheder, tidspunkter og emner. Denne teknik har resulteret i et paradigmeskift med hensyn til en formodet patogenetisk faktor i AMD, som i lang tid blev spekuleret i at skyldes overdreven lipofuscinakkumulering i RPE-celler7. Histologisk og klinisk kvantificering af AF har imidlertid afsløret et fald i AF i AMD (på grund af omfordeling og tab af autofluorescerende lipofuscin og melanolipofuscingranulat) i stedet for den foreslåede stigning i AF 8,9,10.
Overvågning af AF har kliniske implikationer. Von der Emde et al. og andre har vist, at AF ikke kun reduceres, men også falder yderligere i løbet af AMD i højrisiko, mellemliggende AMD-øjne 8,9. Derudover tyder histologiske undersøgelser på, at de fleste AMD-påvirkede RPE-celler viser en karakteristisk adfærd med granulataggregering og ekstrudering før RPE-celletab via subduktion, sloughing, migration eller atrofi13,14,15,16. Dette indikerer yderligere, at AF-tab kan være en udløser eller et surrogatsignal for forestående sygdomsprogression.
QAF-undersøgelser har indtil videre kun evalueret AF globalt ved hjælp af præfabrikerede gitterpolære koordinatsystemer (f.eks. QAF8/Delori Grid)17. Brug af præfabrikerede gitre til måling af AF resulterer i flere AF-værdier på forudbestemte områder pr. øje af et emne. Undersøgelse af AF-værdier på denne måde kan gå glip af lokale ændringer i områder med patologisk ændret AF, for eksempel i AMD oven på eller tæt på drusen eller subretinale drusenoidaflejringer (SDD'er). Drusen, og i højere grad SDD'er, er forbundet med en høj risiko for at udvikle sen AMD og synstab. Især Drusen har en typisk cyklus med stigende størrelse over mange år og kan forværres hurtigt før atrofi. Det er tænkeligt, at for eksempel global AF falder i AMD, men stiger eller endda reduceres yderligere i og omkring disse specifikke sygdomsrelaterede fokale læsioner.
Forskellige lokale AF-mønstre kan også have prognostisk relevans for sygdomsprogression. For eksempel kan autofluorescensniveauer bruges til at vurdere, om drusen stiger i størrelse eller allerede er i regression til atrofi. Det er allerede blevet vist, at ændrede AF-perilesionale mønstre i geografisk atrofi i høj grad påvirker atrofiprogression over tid18. Derudover kan lokale autofluorescensmønstre afsløre yderligere detaljer om RPE's sundhed. Ofte viser den optiske kohærenstomografi (OCT) hyperreflektans i choriocapillaris, selvom RPE-laget ser intakt ud. En multimodal tilgang, der kombinerer lokale QAF-værdier og OCT, kan hjælpe med at differentiere læsioner med høj risiko for RPE-forstyrrelser og forestående atrofi.
En af grundene til, at rumligt opløste analyser i undersøgelser ikke er blevet udført, er, at den mest almindeligt anvendte producentsoftware ikke giver et værktøj til denne type analyse. AF-egenskaber ved forskellige læsioner afhængigt af AMD-sygdomsstadiet kan yderligere forklare patogenesen af AMD. Derfor ville et værktøj til måling af regional, læsionsspecifik AF være ønskeligt. For nøjagtigt at sammenligne læsioner, der er placeret i hele nethinden, har arbejdsgangen brug for en måde at tage højde for forskellige grader af AF i den menneskelige fundus19. Mest centralt er AF karakteristisk lavere på grund af skyggevirkningerne af makulært pigment og forskellige granulattal20,21.
AF når sit højdepunkt ved ~9° (afstand til fovea i alle retninger) og falder i større grad perifert4. Hvis man derfor skulle sammenligne absolutte værdier af AF-niveauer fra blød drusen (placeret ved fovea og parafovea i lave AF-områder) og SDD'er (placeret paracentralt i områder med høj AF), ville resultaterne ikke være sammenlignelige22. Inspireret af arbejdet af Pfau et al. og begrebet følsomhedstab (korrigering af følsomhed målt i AMD for synsbakken [faldende retinal følsomhed med afstand til fovea] af sunde kontroller) for funduskontrolleret perimetri, sammenlignes AF med standardiserede AF-værdier i hele makulaen23,24. Resultaterne rapporteres som z-scores (numerisk måling af en region med interesseværdiens forhold til middelværdien).
Formålet med dette studie er at evaluere brugen af et nyt værktøj til måling af lokale QAF-niveauer i forskellige typer læsioner hos patienter med AMD. Dette værktøj er designet til at måle autofluorescensniveauer af læsioner identificeret på OCT-scanninger. Dette muliggør vurdering af lokale autofluorescensniveauer i læsioner, såsom blød drusen eller SDD'er, og muliggør sporing af AF-ændringer fra læsioner over tid. Den potentielle nytte af dette værktøj er at muliggøre en ny strukturel biomarkør, der estimerer sundheden for RPE og kan have prognostisk værdi for de undersøgte læsioner.
Protocol
Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og godkendt af den etiske komité ved universitetet i Bonn (protokolkode 305/21). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle forsøgspersoner, der var involveret i undersøgelsen. Vi krævede, at alle deltagere i videoen underskrev frigivelsesformularer, der gav os tilladelse til at bruge deres lighed og personlige oplysninger i oprettelsen af en onlinevideo.
1. Kvantitativ autofluorescens (QAF) billedoptagelse
- For nøjagtig billedoptagelse med QAF-enheden skal du sikre dig, at deltageren sidder komfortabelt foran enheden. Få deltageren til at presse hagen og panden mod hage- og nakkestøtten. Juster hagestøttens højde, indtil den laterale øjenlågsvinklen er i samme højde som den røde markering.
- Sørg for, at billedet er fokuseret i den nær-infrarøde modus ved at dreje hjulet på optageenheden, indtil de små fartøjer er i fokus. Zoom ind på øjet ved at flytte kameraet fremad, indtil billedets hjørner er jævnt oplyst. Som tommelfingerregel skal du justere fokus til den sfæriske ækvivalent. Reducer fokus før QAF-billeddannelse med en eller to dioptre, da blå QAF bruger en kortere bølgelængde, og skift QAF-enhedens modus fra nær-infrarød til QAF-tilstand.
- Juster og opskaler belysningen, og finjuster billedets fokus, indtil de små kar tættest på fovea er i fokus, og billedet er stærkt oplyst uden røde prikker (hvilket indikerer overbelysning). Bleg fotopigmentet ved at vente mindst 30 s i QAF-tilstand før billedoptagelse for at tillade den fortsatte excitation af blåt lys at blegge fotoreceptorpigmentet i synsfeltet for kameraindstillingerne.
- For at tage billeder skal du trykke på billedoptagelse på billedenhedens touchpad; Sørg for at tage mere end ét QAF-billede i tilfælde af blinkende eller pludselige øjenbevægelser under erhvervelsen.
BEMÆRK: Arbejdsprocessen kræver også SD-OCT-billeder (spektraldomænets optiske kohærenstomografi). OCT-billedoptagelse forklares andetsteds, da det er meget udbredt i klinisk praksis25.
2. Eksport af billeder
- Til denne analysepipeline skal du sikre dig, at QAF- og OCT-afbildningerne er i XML-filformatet (Extensible Markup Language). Højreklik på et ønsket QAF/OCT-billede i HEYEX viewer, og vælg Eksporter | som XML i rullemenuen.
3. Open source-plug-ins til QAF-analyse-installation af rørledningen
BEMÆRK: Den præsenterede QAF-software er et open source-plug-in med navnet "Spectralis pipeline", der er oprettet til open source-softwaren ImageJ (FIJI-udvidelse)26.
- For at få adgang til pluginnet skal du åbne FIJI, vælge Hjælp og derefter Opdater i rullemenuen og derefter klikke på Administrer opdateringswebsteder for at tilføje Creative Computation Update Site "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/" til de allerede eksisterende opdateringswebsteder.
- Download plug-ins, og genstart derefter FIJI. Nu er Spectralis Pipeline installeret. De forskellige Spectralis plug-ins er placeret under drop-down menuen Plugins | Spectralis eller plugins | SpectralisBatch.
4. Opsætning - datalagring
BEMÆRK: For at muliggøre en problemfri arbejdsgang anbefales det at konfigurere mappestrukturen som følger. Først skal du oprette en mappe for hvert studieemne. Oculus dexter (OD) og oculus sinister (OS) henviser til henholdsvis højre og venstre øje, og disse forkortelser bruges i hele denne arbejdsgang.
- For hvert undersøgt øje på hvert studieemne skal du oprette en mappe til en OCT, der hedder henholdsvis OD_OCT og OS_OCT. Lad Spectralis-pipelinen automatisk gemme sit output fra plug-in'et "Mark_BScans_OCT" som tabulatorseparerede værdier i disse mapper.
- For QAF-billederne skal du oprette to mapper med navnene OD_QAF og OS_QAF.
- Opret yderligere mapper, hvis der bruges andre multimodale billedbehandlingsmetoder. Sørg for, at den resulterende mappestruktur ligner strukturen nedenfor:
CASE_ID
OD_OCT
OD_QAF
OD_other_imaging_modality
OS_OCT
OS_QAF
OS_other_imaging_modality
5. Konvertering af QAF XML-filen til et QAF-billede (plug-in brugt: QAF_xml_reader)
- Spectralis QAF XML Export-filerne gemmes i rød-grøn-blå (RGB) format, begrænset til en skala fra 0 til 255 (repræsenterer målte AF-værdier) og inkluderer "standard" og "sort" kalibreringsregioner. Plug-in'et "QAF_xml_reader" producerer et QAF-billede. For dette skal du åbne rullemenuen plug-ins , vælge Spectralis | QAF_XML_Reader, og kassér åbningsskærmen.
- Der vises et nyt vindue, der viser prompten Vælg en mappe, der indeholder en Spectralis XML QAF Export:. Vælg mappen , og klik på Vælg.
- Indtast referencekalibreringsfaktoren (RCF) for QAF-enheden (inkluderet i billedinformationen for QAF-billedet) og patientens alder på det tidspunkt, hvor billedet blev taget.
- Det næste vindue kaldes QAF-parametre. Hvis patienten er pseudophakic ved billedoptagelse, skal du vælge alder 20 i stedet (dette har den virkning, at der ikke anvendes nogen alderskorrektion). Når du har klikket på OK, og der vises et pop op-vindue mærket Kort til 8bit, skal du indtaste den mindste QAF-værdi (qafMin) og den maksimale QAF-værdi (qafMax) for et farvekodet QAF-billede. Hvis qafMin og qafMax er ukendte, skal du bruge standardindstillingerne, klikke på OK og observere det originale billede mærket Raw QAF Data, der vises, samt 32-bit QAF og 8-bit farvekodet QAF-billede.
BEMÆRK: Det farvekodede QAF-billede bruges udelukkende til illustrative formål; 32-bit QAF-billedet med faktiske QAF-værdier bruges til yderligere analyse.
6. Registrering af QAF-billeder med OCT-afbildningen (anvendt plug-in: Register_OCT_2)
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for nøjagtigt at justere OCT-billedet med QAF-billedet, så læsioner i QAF-billederne og OCT BScans justeres.
- Få adgang til plug-in'et via rullemenuen Plugins | Spectralis, eller opret en genvejstast for at få adgang til de forskellige plug-ins, der bruges. For at opnå dette skal du vælge Register_OCT_2 under Plugins | Genveje | Tilføj genvej, og vælg den ønskede genvejstast.
- Når du har åbnet plugin'et, skal du klikke på OK i det første vindue, der vises. Dernæst vises et vindue, der indeholder prompten: Vælg en mappe, der indeholder Spectralis OCT XML-eksport : i hovedvinduet ImageJ. Vælg mappen, der indeholder Spectralis OCT XML Export , og klik på Åbn.
BEMÆRK: OCT indlæses nu, hvilket afhængigt af processorkraften på den computer, der bruges, kan tage op til 2 minutter. - Vent derefter på, at et vindue, der indeholder prompten Gem registrerede billeder til: vises. Vælg den mappe, hvor EnFaceStack (justeret billedfil) skal gemmes, og klik på Åbn.
- Vent på et pop op-vindue, der indeholder prompten Vælg et billede, der skal føjes til EnFaceStack: for at blive vist, skal du vælge 32bit QAF-billedet for at justere billedet med SD-OCT og klikke på Åbn. Hvis alle nødvendige billeder i denne EnFaceStack er inkluderet, skal du vælge Annuller.
- Når det næste vindue beder brugeren om at vælge en etiket til EnFaceStack, skal du vælge den foruddefinerede QAF-etiket ; alternativt skal du indtaste det ønskede navn på modaliteten i Andet boks. Vælg OK for at registrere billedet.
BEMÆRK: Medtag ikke mellemrum eller anden tegnsætning i feltet Andet . - Overhold de tre vinduer, der dukker op. Den første er mærket Localizer og viser SD-OCT som et venstre øje (OS) billede. Det andet vindue hedder QAF eller en af de andre modaliteter, der tidligere er valgt som det originale venstre (OS) eller højre (OD) øje. Det sidste vindue kaldes Landmarks, som beder om at vælge et til tre vartegn i hvert billede.
- Juster de to billeder ved at vælge et til tre landemærker pr. billedfartøjsforgreninger eller andre egenskaber, der er placeret på begge modaliteter. Zoom ind (brug tastaturtegnet " +" til at zoome ind og " -" til at zoome ud), før du vælger vartegnet. Sørg for, at de valgte landemærker er spredt ud både lodret og vandret i billedet. Når alle landemærkerne er kommenteret, skal du vælge OK på fanen Landemærker og Annuller ved næste prompt.
- Når der vises et vindue, hvor du bliver spurgt Vil du se resultaterne , skal du vælge Ja for at kontrollere, om billedet er justeret korrekt. Gør dette ved at zoome ind på et lille fartøj og placere markøren ved siden af det, og rul derefter op eller ned for at kontrollere, hvor meget fartøjet bevæger sig i forhold til markøren. Hvis justeringen ikke er præcis, skal du slette filen ".tiff" i OD_QAF mappen og genstarte processen fra starten af trin 2.
BEMÆRK: Da markeringerne på Mark_BScans_OCT skal være præcise, skal justeringen mellem SD-OCT- og QAF-billedet også være meget nøjagtig. Pixel-perfekt justering kan opnås på de fleste billeder, selvom justering i nogle tilfælde er begrænset til en nøjagtighed på tre eller fire pixels.
7. Oprettelse af et gennemsnitligt QAF-billede til sammenligning (plug-in brugt: StandardRetina/BatchStandardRetina)
BEMÆRK: QAF-værdier er stærkt afhængige af retinal placering (f.eks. Central skygge forårsaget af makulært pigment). Derfor bør drusens QAF-værdier sammenlignes med standard QAF-værdier for samme region. Som en forudsætning for analyse opretter StandardRetina et enface-kort over gennemsnitlige QAF-billeder (for eksempel fra en aldersmatchet kontrolkohorte). Det resulterende enface-kort viser et pixel-for-pixel-kort over en gennemsnitlig QAF-værdi for den centrale nethinde.
- Der er to måder at oprette standard nethinden inden for Spectralis-pipelinen: den første, AddToStandardRetina_OCT, tillader en ny sag ad gangen til enface-kortet, mens den anden, BatchStandardRetina, tilføjer flere sager på én gang.
- Hvis du vil tilføje ét billede ad gangen, skal du vælge Plugins | Spektralis | AddToStandardRetina_OCT og afvis åbningsskærmen. Når der vises et vindue, der viser teksten Vælg en mappe, der indeholder en Spectralis OCT XML-eksport, skal du vælge mappen og klikke på Vælg for at åbne BScan.
- Når der vises et nyt vindue, der viser prompten Vælg en mappe, der indeholder registrerede EnFace-billeder:, skal du vælge den relevante mappe og klikke på Vælg.
- Overhold de tre vinduer, der dukker op, et mærket EnFaceStack , der viser de stablede billeder fra den mappe, der blev valgt i det andet trin, det andet mærket Bscan Stack , der viser OCT BScan, og et tredje vindue, der vises i midten mærket Vælg modalitet. Vælg en modalitet fra EnFaceStack.
- Vælg en modalitet, og observer det nye vindue, der dukker op med prompten Vælg en mappe, der indeholder StandardRetina. Hvis der ikke allerede findes en mappe, der indeholder en StandardRetina, skal du vælge en tom mappe for at oprette en ny StandardRetina.
- Undersøg den nye StandardRetina, rul op og ned, og flyt markøren for at få vist middel- og standardafvigelsen for den specifikke placering. Klik på knappen Accepter? For enten at tilføje det nyeste foto til StandardRetina eller kassere det.
- Hvis du vil tilføje flere billeder ad gangen, skal du bruge Batch_QAF_StandardRetina.
- Først skal du forberede en "manifest.txt"-fil i samme mappe som sags-id'erne og sikre, at den viser den relative sti fra placeringen af .txt-filen til OLT og EnFaceStack. Adskil de to med et tabulatorområde , og sørg for, at der ikke er yderligere mellemrum foran og bag navnene. Filen skal ligne denne opsætning:
pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OKT>001/OD-QAF
pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OKT>002/OD-QAF - Opret filen i regnearkssoftware og gem den som en txt-fil. Sørg for, at alle stierne indeholder udsnittet (tegnbogstaver) QAF , for at manifestfilen kan fungere korrekt. Plug-ins er placeret under rullemenuen Plugins | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina.
- Luk åbningsskærmen, og vent på, at et nyt vindue åbnes, der viser prompten Vælg den oprindelige Standard Retina. Vælg enten en mappe med en allerede eksisterende StandardRetina, eller vælg en tom mappe for at oprette en ny StandardRetina.
- Se efter en prompt mærket Vælg modalitet, der skal vises; standardværdien er QAF. Sørg for, at filnavnet på den respektive modalitet nøjagtigt matcher filnavnet for et udsnit i hver EnFaceStack, der er navngivet i manifestfilen. Når der åbnes et vindue, hvor brugeren bliver bedt om at vælge en manifestfil (beskrevet tidligere), skal du klikke på Annuller, hvis der ikke skal føjes nogen anden manifestfil til denne StandardRetina, eller vælge en anden manifestfil. Undersøg den nye StandardRetina i et nyt vindue med navnet Accepter?, og beslut, om du vil føje den seneste batch til StandardRetina eller kassere den seneste batch.
BEMÆRK: Processen med at kombinere alle QAF'er til en StandardRetina kan tage et stykke tid.
- Først skal du forberede en "manifest.txt"-fil i samme mappe som sags-id'erne og sikre, at den viser den relative sti fra placeringen af .txt-filen til OLT og EnFaceStack. Adskil de to med et tabulatorområde , og sørg for, at der ikke er yderligere mellemrum foran og bag navnene. Filen skal ligne denne opsætning:
8. Annotering af regioner af interesse for analyse (plug-in brugt: Mark_BScans_OCT)
- For at markere læsioner (såsom drusen) skal du åbne Plugins | Spektralis | Mark_BScans_OCT og afvis åbningsprompten. Se efter et nyt vindue mærket Vælg en mappe, der indeholder en Spectralis OCT XML-eksport, der skal vises. Vælg den mappe, der har den ønskede OCT, og klik på OK.
- Når FIJI har indlæst OLT, skal du observere det nye vindue med etiketten Vælg en mappe, der indeholder registrerede ansigtsbilleder , der skal vises. Vælg den mappe, der indeholder EnFaceStack , og klik på Vælg.
- Tre nye vinduer vises nu, et mærket EnFaceStack, et mærket BscanStack og et navngivet brugerparametre.
- Vinduet Brugerparametre beder brugeren om at indtaste følgende parametre: Case ID, som derefter vises i navnet på output-csv-filen, båndbredde i mm, enface-linjebredden, BScan-linjebredden og områdemaskens opacitet.
- Parameterbåndbredden i mm bestemmer bredden af hvert isoskrog i millimeter (mm). Brug Enface-linjebredde til at ændre linjebredden for markerede læsioner i vinduet mærket EnFaceStack.
- BScan-linjebredden bestemmer linjebredden på vinduet Bscan Stack. Bemærk, at indstilling af denne parameter til 1 er den bedste indstilling for linjebredde i de fleste tilfælde.
- Vælg mellem en ansigtsmaske eller et afstandskort , der vises i et separat vindue for at beslutte, om indvendige bånd skal farvelægges ind. Klik derefter på udført i vinduet Marker i BScan i plug-in'et.
- Når du derefter bliver bedt om at vælge en allerede eksisterende StandardRetina, skal du vælge den mappe, der indeholder StandardRetina, og klikke på Vælg. Bemærk, at hvis der vælges en StandardRetina, vælger output-Mark_BScans_OCT tilstanden z-score (for en målt QAF-værdi sammenlignet med StandardRetina). Hvis den rå QAF-værdi foretrækkes, skal du klikke på Annuller og vente på et nyt vindue mærket Meddelelse, der advarer om, at resultaterne vil være rå værdier, ikke z-score.
- Vinduet Brugerparametre beder brugeren om at indtaste følgende parametre: Case ID, som derefter vises i navnet på output-csv-filen, båndbredde i mm, enface-linjebredden, BScan-linjebredden og områdemaskens opacitet.
- Se efter et nyt vindue for at dukke op, spørger: Vælg en mappe, der indeholder den gemte tilstand med de gemte data. Hvis der findes en gemt fil, skal du klikke på den mappe, der indeholder udsnittene | Vælg. Hvis status ikke skal gemmes, skal du vælge annuller. Se efter et nyt vindue mærket Mark i BScan, og vælg Gem, ignorer, udført og markér i en rullemenu.
- Tegn: Begynd at kommentere de interessante områder i BScan med lignende kommandoer som i plug-in'et "Register_OCT_2", der er forklaret ovenfor. For at markere et område skal du vælge start ved at højreklikke og trække musemarkøren til slutningen af læsionen, sørg for, at mærke er valgt i vinduet Marker i B-Sscan, og klik på OK. Interesseområdet er nu markeret i denne BScan.
- Ignorere: Vælg Ignorer i vinduet Marker i BScan , og klik på OK for at ignorere markeringen.
- Spare: Vælg Gem i vinduet Marker i BScan , og klik på OK for at få vist et nyt vindue, der indeholder prompten vælg en mappe, der skal gemmes tilstand. Vælg en allerede eksisterende mappe, eller opret en ny. Åbn allerede eksisterende filer ved at starte "Mark_BScans_OCT", og vælg den mappe, der indeholder lagringstilstanden, når vinduet Vælg en mappe, der indeholder den gemte tilstand vises.
BEMÆRK: Flere lagringstilstande kan ikke gemmes i en mappe; gemme stater fra en lokalitet til en anden kan ikke let skiftes (f.eks. TYSK til USA). - Gjort: Vælg udført i vinduet Marker i BScan , og klik på OK for at få et nyt vindue med etiketten til at vælge modalitet vises.
- Når en prompt mærket bring den korrekte modalitet oven på enface-stakken vises, skal du bringe modaliteten kaldet QAF ovenpå, som blev justeret ved hjælp af "Register_OCT_2". Gør dette enten ved at rulle gennem EnFaceStack, vælge vinduet En face Stack eller klikke på venstre eller højre pil. Bemærk, at navnet på modaliteten vises i øverste venstre hjørne.
- For bedre at inspicere og markere læsionerne skal du zoome ind i Bscan-vinduet. Klik på vinduet B-Scan , peg musen i retning for at zoome ind, og tryk på + -tasten; For at zoome ud skal du trykke på - -tasten.
- Rul gennem BScan-stakken ved at rulle op eller ned på musen, trække bjælken nederst til venstre eller højre for at bevæge dig gennem scanningen eller ved at vælge B-Scan-rammen og klikke på venstre og højre piletast på tastaturet. Bemærk, at en oversigt over det aktuelle område i BScan-stakken leveres af den røde linje i EnFaceStack-vinduet og øverst til venstre i BScan-vinduet, hvor BScan-nummeret (f.eks. 31/120) vises.
- Klik på OK for at oprette en ny .tsv-fil i den tilsvarende mappe "OD_OCT" eller "OS_OCT". Bemærk, at .tsv-filnavnet består af "Mark_Bscans_OCT" plus det sags-id, der blev indtastet, lateraliteten og den modalitet, der blev valgt i det sidste trin i Mark_Bscans_OCT. Derudover vises drusens farvekodede "iso-skrog" nu i EnFaceStack.
Representative Results
Visning af output
For tilstrækkeligt at analysere og drage konklusioner fra resultaterne er det vigtigt at forstå outputfilen for Mark_Bscans_OCT. De første tre kolonner er mærket efter sags-id'et, filens lateralitet og den valgte billedbehandlingsmodalitet. Den fjerde kolonne henvises til efter tilstand og er mærket z-score. Bemærk, at Mark BScans fra skrivning af denne tekst kun kan beregne alle læsioner på én gang; Rækkerne henviser til iso-skrog, hvis afstande fra læsionens ydre kant er angivet i regnearkets nedre og øverste kolonner. Iso-skrog måler AF i z-scores (i tilfælde af QAF) i en specificeret omkreds omkring læsionen. Bemærk, at minimumsværdien af en pixel i et iso-skrog kan findes i kolonnerne mærket min, kolonnerne mærket median, max, mean og stdev indeholder henholdsvis median, maksimum, middelværdi og standardafvigelse for middelværdien af pixelværdierne i etiso-skrog. Kolonnen n indeholder det samlede antal pixels i et iso-skrog. Figur 1 viser en enkelt markeret blød drusen hos en 84-årig mandlig patient med mellemliggende aldersrelateret makuladegeneration (iAMD).
Figur 2 viser venstre øje hos en repræsentativ patient med SDD'er markeret med QAF-Workflow-værktøjet (figur 3). SDD'er hos denne patient var forbundet med reduceret AF (z-score = -0,4 ± 0,2). Tilsvarende viste iso-skrogene omkring SDD reduceret AF (f.eks. nærmeste iso-skrog = -0,3 ± 0,3) sammenlignet med StandardRetina. En plausibel forklaring på dette fænomen kan være skyggevirkninger (reduceret translucens) af SDD-læsioner på RPE. Brugen af SDD'er var eksemplarisk. Værktøjet muliggør også vurdering af lokale AF-niveauer i andre læsioner, såsom drusen. Desuden giver værktøjet mulighed for at spore AF-ændringer fra læsioner over tid.
Figur 1: En enkelt markeret blød drusen af en 84-årig mandlig patient med mellemliggende aldersrelateret makuladegeneration (iAMD). (A) QAF-billedet af et venstre øje med den markerede drusen. (B) Nærbillede af drusenen: brunt centrum, der repræsenterer de markerede drusenbånd, og farvede bånd, der repræsenterer de omgivende iso-skrog. Tabellen nedenfor viser outputfilen. QAF drusen-værdier sammenlignes med tilsvarende QAF-værdier for den tilsvarende excentricitet fra StandardRetina. Dette resulterer i z-scorer, der repræsenterer afvigelse fra gennemsnittet af upåvirkede områder. Den blå boks viser fra venstre mod højre: sags-id, øjets lateralitet, anvendt modalitet og det ønskede output (i dette tilfælde z-scores). Kolonner i den orange boks viser grænserne for det målte område i millimeter (nedre = nedre grænse, øvre = øvre grænse). Den grønne boks mærker kolonnerne, der viser QAF-målingerne. Fra venstre mod højre indeholder disse minimum, median, maksimum, antal pixels, middelværdi og standardafvigelse for middelværdien. Hver række repræsenterer et iso-skrog, rækker i den blå boks repræsenterer værdier inden for læsionen, og rækker i den lilla boks viser iso-skrogene omkring hver læsion (fra top til bund med stigende afstand til læsionen). Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Markerede SDD'er i et QAF-billede af en 80-årig kvindelig patient med tidlig AMD. (A) SDD'er kan ses på QAF-billedet. Det samme QAF-billede vises med påtrykte anmærkninger af SDD'er. (B) Omkring hver markeret læsion er iso-skrogene afbildet med farvekodning (lysegrøn, mørkegrøn og rød). (C) En forstørret version af det blå rektangel. Den ydre kant af hvert SDD er markeret med blåt. Forkortelser: QAF = kvantitativ autofluorescens; AMD = aldersrelateret makuladegeneration; SDD = subretinal drusenoid depositum. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Arbejdsproces til bestemmelse af AF læsioner. Denne figur visualiserer de software-plug-ins, der er nødvendige for at bestemme læsionsspecifik AF. (A) Billedet viser et farvekodet QAF-billede, der kan bruges til at visualisere fordelingen af QAF-værdier, men bør ikke bruges til yderligere analyse. (B) Der vises et QAF-billede i forgrunden med det infrarøde billede fra SD-OCT-scanningen i baggrunden. Dette formodes at visualisere justeringen ved hjælp af fartøjsforgreninger. Dette kan gøres ved hjælp af Register_OCT_2 plug-in. (C) En StandardRetina, der bruges til at måle z-score-værdierne for læsioner. StandardRetinas kan oprettes ved hjælp af StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) En BScan med blå pile, der peger på SDD'er, som er fremhævet med gule linjer (bemærk: læsioner er altid markeret under RPE uafhængigt af placeringen i z-retningen) er afbildet. (E) Alle markerede læsioner ses præget på et QAF-billede (se figur 1). De sidste to trin udføres ved hjælp af Mark_BScans_OCT-plug-in'et. Forkortelser: AF = autofluorescens; QAF = kvantitativ autofluorescens SDD = subretinal drusenoid depositum; IR = infrarød; RPE = retinal pigmentepitel; SD-OCT = spektraldomæne optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne arbejdsgang indeholder en trinvis vejledning til brug af open source FIJI-plug-in-værktøjer til at bestemme og sammenligne AF af AMD-specifikke læsioner. Plug-ins giver brugervenlige skabeloner, der ikke kræver nogen kodningskendskab, og kan anvendes af læger uden teknisk support27. Så vidt vi ved, er disse værktøjer enestående til læsionsspecifik AF-kvantificering.
QAF-værdier varierer naturligt over nethinden, hvor værdierne er højere i periferien og lavere i makulaen på grund af ujævn lipofuscin- og melanolipofuscinfordeling i nethinden, karrets lave AF og ujævn makuladepigmentfordeling. På grund af den store variation af naturligt forekommende QAF-niveauer i nethinden er det ikke en lovende tilgang at analysere absolutte QAF-værdier af læsioner direkte. For eksempel kan en hypoautofluorescerende læsion i periferien stadig have højere absolutte QAF-værdier end fysiologiske fluorescensniveauer af makulaen. Brugen af en StandardRetina og brugen af z-scores til at måle fluorescensniveauerne af drusen korrigerer for denne naturligt forekommende varians af QAF-værdier.
En z-score er en numerisk måling af et område med interesseværdiens forhold til middelværdien i StandardRetina. Det beregnes ved at trække middelværdien fra et individ fra gennemsnittet fra StandardRetina på samme sted og derefter dividere resultatet med standardafvigelsen. Denne standardisering giver mulighed for sammenligning af forskellige QAF-billeder, da z-scoren angiver, hvor mange standardafvigelser en værdi adskiller sig fra gennemsnittet. En positiv z-score angiver, at værdien er over middelværdien, mens en negativ z-score angiver, at den er under middelværdien.
Det er vigtigt at bemærke, at der kan være potentielle faldgruber, der bør overvejes. Selvom denne metode tegner sig for den varierende mængde AF-niveauer i hele fundus, er det muligvis stadig ikke den mest nøjagtige måde at måle og sammenligne en RPE's AF. Individer har forskellige niveauer og topografi af makulært lutealpigment, og læsioner kan også påvirke gennemskinneligheden af den overliggende nethinden28,29. Det er derfor plausibelt, at den målte reducerede AF i områder med SDD'er (se repræsentative resultater) er en konsekvens af skyggeeffekter snarere end nedsat fluorofor i RPE30,31,32.
Vi arbejder i øjeblikket på en arbejdsgang for at tage højde for retinal reflektionsevne, tykkelse og kvantificeret makulært pigment (ved hjælp af grøn og blå AF) med lineære blandede modeller. Derudover bruger QAF indtil videre en aldersafhængig korrektionsfaktor til at tage højde for lentikulær opacifikation, der ser bort fra interindividuelle forskelle i den lentikulære opakificering af deltagere i en lignende alder33. Vi arbejder derfor i øjeblikket på en arbejdsgang for en personlig korrektionsfaktor for lentikulær autofluorescens og opacifikation. For pålideligt at udtrække information om AF fra små læsioner er der behov for tilstrækkelig test-retest-pålidelighed af QAF-billeder. For yderligere at differentiere de QAF-billeder, hvor mere detaljeret analyse er levedygtig, undersøger vi "QAF-billedpålidelighedsindekser", der kan forudsige test-retest-pålideligheden af QAF-billeder. På nuværende tidspunkt er den forsigtige tilgang at erhverve duplikatbilleder og undersøge pålideligheden af læsionsspecifik AF.
Den præsenterede metode til yderligere analyse af iso-skrog af læsioner var teknisk vanskelig at implementere, da iso-skrog af nærliggende læsioner smelter sammen. Områder med fusionerede isoskrog kan karakteriseres tydeligt afhængigt af hvilken læsion der overvejes. Vores løsning var at betragte alle læsioner af én type som én læsion og analysere deres periferi som et fælles iso-skrog. Denne metode reducerer imidlertid drastisk evnen til at måle iso-skrog af individuelle drusen og kan betragtes som en yderligere faldgrube ved denne teknik. Mere teknisk sofistikerede metoder til at tage højde for fusionerede isoskrog eller suspenderet rapportering af AF i områder med fusionerede isoskrog kunne lette analysen af AF i omkredsen af læsioner i fremtiden.
Vi brugte AMD som en modelsygdom til denne undersøgelse. Arbejdsgangen kan også tilpasses til at studere læsioner i andre sygdomme. Indtil videre er QAF blevet brugt i mange chorioretinale sygdomme, herunder recessiv Stargardt sygdom, Bestrophin-1 associerede sygdomme, forskellige former for retinitis pigmentosa, akut zonal okkult ydre retinopati, pseudoxanthoma elasticum og andre 17,33,34,35,36,37. Da denne arbejdsgang bruger open source-software, opfordrer vi andre til at duplikere dette arbejde ved bestemmelse af læsionsspecifik AF og udvide vores viden om retinale lidelser. Sammenfattende præsenterer vi en arbejdsgang for at bestemme og sammenligne AF-niveauer af forskellige retinale læsioner i hele makulaen. Denne arbejdsgang baner vejen for mere dybdegående analyse af AF og kan lette udviklingen af nye biomarkører i AMD og videre.
Disclosures
Leon von der Emde rapporterer at modtage betalinger fra Heidelberg Engineering. Merten Mallwitz rapporterer ingen finansielle oplysninger. Kenneth R. Sloan rapporterer heller ingen finansielle oplysninger. Frank G. Holz rapporterer rådgivning / personlige betalinger for Acucela, Alcon (C), Gyroskop Allergan Apellis, Bayer Bioeq / Formycon, CenterVue, Roche / Genentech, Geuder, Ivericbio, NightStarX, Novartis, Optos, Oxurion, Pixium Vision, Stealth BioTherapeutics, Zeiss og GRADE Reading center. Thomas Ach rapporterer rådgivning/personlige betalinger for Bayer, Apellis, Roche og Novartis.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af det tyske oftalmologiske selskabs (DOG) tilskud til ph.d.-studerende (MW) og NIH / NEI 1R01EY027948 (TA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BatchStandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| FIJI (Image J) | n.a. | n.a. | n.a. |
| Mark_Bscans_OCT plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Microspft office | Microsoft | n.a. | n.a. |
| QAF_xml_reader plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Register_OCT_2 plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Spectralis | Heidelberg Engineering | n.a. | QAF extension |
| StandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
References
- Schmitz-Valckenberg, S., et al.
- Bermond, K., et al. Autofluorescent granules of the human retinal pigment epithelium: phenotypes, intracellular distribution, and age-related topography. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (5), 35 (2020).
- Bermond, K., et al. Autofluorescent organelles within the retinal pigment epithelium in human donor eyes with and without age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 63 (1), 23 (2022).
- Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (13), 9379-9390 (2011).
- Fleckenstein, M., et al.
- Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (8), 5684-5693 (2013).
- Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
- vonder Emde, L., et al. Natural history of quantitative autofluorescence in intermediate age-related macular degeneration. Retina. 41 (4), 694-700 (2021).
- Reiter, G. S., et al. Longitudinal changes in quantitative autofluorescence during progression from intermediate to late age-related macular degeneration. Retina. 41 (6), 1236-1241 (2021).
- Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in early and intermediate age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
- Hussain, R. M., Gregori, N. Z., Ciulla, T. A., Lam, B. L. Pharmacotherapy of retinal disease with visual cycle modulators. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 19 (5), 471-481 (2018).
- Ammar, M. J., Hsu, J., Chiang, A., Ho, A. C., Regillo, C. D. Age-related macular degeneration therapy: a review. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 215-221 (2020).
- Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
- Zanzottera, E. C., Messinger, J. D., Ach, T., Smith, R. T., Curcio, C. A. Subducted and melanotic cells in advanced age-related macular degeneration are derived from retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3269-3278 (2015).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
- Zanzottera, E. C., et al. The Project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3253-3268 (2015).
- Sparrow, J. R., Duncker, T., Schuerch, K., Paavo, M., de Carvalho, dR. L. Lessons learned from quantitative fundus autofluorescence. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100774 (2020).
- Schmitz-Valckenberg, S., et al. Correlation between the area of increased autofluorescence surrounding geographic atrophy and disease progression in patients with AMD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (6), 2648-2654 (2006).
- Ach, T., Bermond, K. Autofluorescence of the human retinal pigment epithelium in normal aging and in age-related macular degeneration: histology and clinical correlation. Klinische Monatsblatter Fur Augenheilkunde. 236 (5), 672-681 (2017).
- Pollreisz, A., et al. Visualizing melanosomes, lipofuscin, and melanolipofuscin in human retinal pigment epithelium using serial block face scanning electron microscopy. Experimental Eye Research. 166, 131-139 (2018).
- Bernstein, P. S., et al. meso-zeaxanthin: The basic and clinical science underlying carotenoid-based nutritional interventions against ocular disease. Progress in Retinal and Eye Research. 50, 34-66 (2016).
- Göbel, A. P., Fleckenstein, M., Heeren, T. F. C., Holz, F. G., Schmitz-Valckenberg, S. In-vivo mapping of drusen by fundus autofluorescence and spectral-domain optical coherence tomography imaging. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (1), 59-67 (2016).
- Pfau, M., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in geographic atrophy secondary to age-related macular degeneration. Retina. 40 (1), 169-180 (2020).
- vonder Emde, L., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (1), 7 (2018).
- Aumann, S., Donner, S., Fischer, J., Müller, F. Optical coherence tomography (OCT): principle and technical realization. High Resolution Imaging in Microscopy and Ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Cham (CH), Springer. 59-85 (2019).
- Schindelin, J., et al. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kleefeldt, N., et al. Quantitative fundus autofluorescence: advanced analysis tools. Translational Vision Science and Technology. 9 (8), 2 (2020).
- Hong, I. H., Jung, W. H., Lee, J. H., Chang, I. B. Macular pigment optical density in the Korean population: a cross sectional study. Journal of Korean Medical Science. 35 (5), e30 (2020).
- Putnam, C. M. Clinical imaging of macular pigment optical density and spatial distribution. Clinical and Experimental Optometry. 100 (4), 333-340 (2017).
- Zweifel, S. A., Spaide, R. F., Curcio, C. A., Malek, G., Imamura, Y. Reticular pseudodrusen are subretinal drusenoid deposits. Ophthalmology. 117 (2), 303-312 (2010).
- Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
- Spaide, R. F. Outer retinal atrophy after regression of subretinal drusenoid deposits as a newly recognized form of late age-related macular degeneration. Retina. 33 (9), 1800-1808 (2013).
- Reiter, G. S. Influence of lens opacities and cataract severity on quantitative fundus autofluorescence as a secondary outcome of a randomized clinical trial. Scientific Reports. 11 (1), 12685 (2021).
- Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in pseudoxanthoma elasticum. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (14), 6159-6165 (2017).
- Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2841-2852 (2014).
- Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. Quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases. Journal of Visualized Experiments. (109), 53577 (2016).
- Pröbster, C., et al. Quantitative fundus autofluorescence in the developing and maturing healthy eye. Translational Vision Science and Technology. 10 (2), 15 (2021).
- Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in PRPH2/RDS- and ABCA4-associated disease exhibiting phenotypic overlap. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3159-3170 (2015).
