Summary
この研究では、眼底全体の自家蛍光レベルの違いを考慮しながら、個々の関心領域(加齢黄斑変性症[AMD]におけるドルーゼンおよび網膜下ドルセノイド沈着物など)からの自家蛍光レベルを決定して比較するワークフローについて説明します。
Abstract
眼底自家蛍光(FAF)イメージングは、眼底の内因性蛍光色素、特に網膜色素上皮(RPE)の非侵襲的マッピングを可能にし、共焦点走査型レーザー検眼鏡検査ベースの定量的自家蛍光(QAF)の出現により定量化できるようになりました。QAFは、加齢黄斑変性症(AMD)において一般的に後極で減少することが示されています。QAFとさまざまなAMD病変(ドルーゼン、網膜下ドルセノイド沈着物)との関係はまだ不明です。
この論文では、AMDにおける病変特異的QAFを決定するためのワークフローについて説明します。スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)、黄斑体積スキャンおよびQAFを含むがこれらに限定されない、マルチモーダル in vivo イメージングアプローチが使用される。カスタマイズされたFIJIプラグインを使用して、対応するQAF画像をSD-OCTスキャンからの近赤外画像(特徴的なランドマーク、つまり血管の分岐)と位置合わせします。中心窩と視神経乳頭の縁は、分析グリッドの正確な位置決定のために、OCT画像でマークされ(そして登録されたQAF画像に転送されます)。
AMD特異的な病変は、個々のOCT BScanまたはQAF画像自体にマークすることができます。規範的QAFマップは、眼底全体のQAF値の平均と標準偏差の変化を説明するために作成されます(代表的なAMDグループからのQAF画像を平均化して、規範的な標準網膜QAF AMDマップを作成しました)。プラグインは、X座標とY座標、Zスコア(平均からの標準偏差でAFマップの平均に対するQAF値を表す数値測定値)、平均強度値、標準偏差、およびマークされたピクセル数を記録します。また、このツールは、マークされた病変の境界ゾーンからZスコアを決定します。このワークフローと分析ツールは、AMDの病態生理学と臨床AF画像解釈の理解を深めます。
Introduction
眼底自家蛍光(FAF)イメージングは、眼底1の自然および病理学的に発生する蛍光色素の非侵襲的マッピングを提供します。最も一般的な青色(488 nm励起)自家蛍光(AF)は、網膜色素上皮(RPE)のリポフスチンおよびメラノリフシン顆粒を励起します2,3,4。顆粒の分布と増減は、正常な老化や加齢黄斑変性症(AMD)5を含むさまざまな網膜疾患において中心的な役割を果たします。
FAFのさらなる発展である定量的眼底自家蛍光法(QAF)により、地形的に分解された網膜AF強度の正確な測定が可能になりました4,6。FAF撮像素子の光路に基準を組み込むことで、装置間、時間的時点間、被写体間でAF強度を比較することができます。この技術は、長い間、RPE細胞におけるリポフスチンの過剰な蓄積によるものと推測されていたAMDの推定病原性因子に関してパラダイムシフトをもたらしました7。しかし、AFの組織学的および臨床的定量化により、AMDにおけるAFの減少が明らかになりました(自家蛍光リポフスチンおよびメラノリフシン顆粒の再分配と喪失による)、AFの提案された増加8,9,10。
心房細動のモニタリングには臨床的な意味合いがある。Von der Emdeらは、高リスクの中等度AMD眼において、AMDの過程でAFが減少するだけでなく、さらに減少することを示しました8,9。さらに、組織学的研究は、AMDに罹患したほとんどのRPE細胞が、沈み込み、脱落、遊走、または萎縮によるRPE細胞の損失の前に、顆粒の凝集と押し出しを伴う特徴的な挙動を示すことを示唆しています13,14,15,16。これはさらに、心房細動の喪失が差し迫った疾患進行の引き金または代理信号である可能性があることを示しています。
これまでのQAF研究では、プレハブグリッド極座標系(QAF8/Delori Gridなど)を使用して、後極でのAFを全球的に評価しているだけである17。プレハブグリッドを使用してAFを測定すると、被写体の片目あたりの所定の領域に複数のAF値が得られます。この方法でAF値を調べると、病理学的にAFが変化した領域、たとえば、ドルーゼンまたは網膜下ドルセノイド沈着物(SDD)の上または近くのAMDの局所的な変化を見逃す可能性があります。ドルーゼン、およびより高度なSDDは、遅発性AMDおよび視力喪失を発症する高いリスクと関連しています。特にドルーゼンは、長い年月をかけて大きくなる典型的なサイクルがあり、萎縮する前に急速に悪化することがあります。例えば、全体的なAFはAMDにおいて減少するが、これらの特定の疾患関連病変の周囲において増加するか、またはさらに減少することが考えられる。
局所的な心房細動パターンが異なることも、疾患の進行に予後的関連性がある可能性がある。例えば、自家蛍光レベルは、ドルーゼンのサイズが増加しているかどうか、またはすでに萎縮に回帰しているかどうかを評価するために使用できます。地理的萎縮における心房細動の病変周囲パターンの変化は、時間の経過とともに萎縮の進行に大きく影響することがすでに示されています18。さらに、局所的な自家蛍光パターンにより、RPEの健全性に関するさらなる詳細が明らかになる可能性があります。多くの場合、光干渉断層撮影法(OCT)は、RPE層は無傷のように見えますが、絨毛細血管への過反射を示します。局所QAF値とOCTを組み合わせたマルチモーダルアプローチは、RPE破壊と差し迫った萎縮のリスクが高い病変の鑑別に役立つ可能性があります。
研究で空間的に解決された解析が実行されていない理由の 1 つは、最も一般的に使用されているメーカーのソフトウェアがこれらのタイプの解析用のツールを提供していないためです。AMDの病期に依存するさまざまな病変のAF特性は、AMDの病因をさらに説明できる可能性があります。したがって、局所的な病変特異的な心房細動を測定するツールが望ましいでしょう。網膜全体に位置する病変を正確に比較するために、ワークフローには、ヒト眼底におけるさまざまな程度の心房細動を説明する方法が必要です19。最も中央的には、黄斑色素の影の効果と顆粒数の違いにより、AFは特徴的に低くなります20,21。
AFは~9°(全方向の中心窩までの距離)でピークに達し、末梢で大きく減少します4。したがって、ソフトドルーゼン(低AF領域の中心窩および傍中心窩に位置する)とSDD(高AF領域の傍中心に位置する)のAFレベルの絶対値を比較すると、結果は比較可能ではない22。Pfauらの研究と、眼底制御視野測定の感度喪失(健常対照群の視力の丘[中心窩までの距離による網膜感度の低下]についてAMDで測定された感度を補正する)の概念に触発されて、AFは黄斑全体の標準化されたAF値と比較されます23,24。結果は、Z スコア (関心領域の値と平均の関係の数値計測値) として報告されます。
この研究の目的は、AMD患者のさまざまなタイプの病変における局所QAFレベルを測定するための新しいツールの使用を評価することです。このツールは、OCTスキャンで特定された病変の自家蛍光レベルを測定するように設計されています。これにより、ソフトドルーゼンやSDDなどの病変における局所的な自家蛍光レベルの評価が可能になり、病変からのAFの変化を経時的に追跡することができます。このツールの潜在的な有用性は、RPEの健全性を推定し、調査された病変の予後的価値を持つ可能性のある新しい構造バイオマーカーを可能にすることです。
Protocol
この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、ボン大学の倫理委員会(プロトコルコード305/21)によって承認されました。書面によるインフォームドコンセントは、研究に関与したすべての被験者から得られました。動画の参加者全員に、オンライン動画の作成に肖像や個人情報を使用する許可を与える同意書に署名するよう求めました。
1. 定量的自家蛍光(QAF)画像取得
- QAFデバイスで正確な画像を取得するには、参加者がデバイスの前に快適に座っていることを確認してください。参加者に顎と額を顎とヘッドレストに押し付けてもらいます。外側のまぶたの角度が赤いマーキングと同じ高さになるまで、あご当ての高さを調整します。
- 小さな血管に焦点が合うまで記録デバイスのホイールを回転させて、画像が近赤外線モードに焦点を合わせていることを確認します。画像の角が均等に照らされるまでカメラを前方に動かして、目を拡大します。経験則として、フォーカスを球面に相当するものに調整します。青色QAFは波長が短いため、QAF撮像前のピントを1〜2ジオプター下げ、QAFデバイスのモードを近赤外モードからQAFモードに切り替えます。
- 照明を再調整してアップスケールし、中心窩に最も近い小さな血管に焦点が合い、画像が赤い点なしで明るく照らされるまで、画像の焦点を微調整します(過照明を示します)。画像取得前にQAFモードで少なくとも30秒待ってフォトピグメントを漂白し、継続的な青色光励起がカメラ設定の視野内の感光体色素を漂白できるようにします。
- 画像をキャプチャするには、イメージングデバイスのタッチパッドで 画像取得 を押します。撮影中にまばたきや急な眼球運動が発生した場合に備えて、必ず複数のQAF画像を撮影してください。
注:このワークフローには、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)画像も必要です。OCT画像取得は、臨床現場で広く使用されているため、別の場所で説明されています25。
2.画像のエクスポート
- この分析パイプラインでは、QAF イメージと OCT イメージが Extensible Markup Language (XML) ファイル形式であることを確認します。 HEYEXビューアで、目的のQAF/OCT画像を右クリックし、ドロップダウンメニューから Export | as XML を選択します。
3. QAF分析用のオープンソースプラグイン - パイプラインのインストール
注:提示されたQAFソフトウェアは、オープンソースソフトウェアImageJ(FIJI拡張)26用に作成された「Spectralis pipeline」という名前のオープンソースプラグインです。
- プラグインにアクセスするには、FIJIを開き、ドロップダウンメニューから「ヘルプ」→「アップデート」を選択し、「アップデートサイトの管理」をクリックして、既存のアップデートサイトにCreative Computation Update Site「https://sites.imagej.net/CreativeComputation/」を追加します。
- プラグインをダウンロードし、FIJIを再起動します。これで、Spectralis Pipelineがインストールされました。さまざまな Spectralis プラグインは、ドロップダウンメニューの Plugins |Spectralis または プラグイン |SpectralisBatchです。
4. セットアップ - データストレージ
注: シームレスなワークフローを可能にするには、 次のようにフォルダ構造を設定する ことをお勧めします。まず、研究対象ごとにフォルダを設定します。Oculus dexter(OD)と oculus sinister(OS)は、それぞれ右目と左目を指し、これらの略語はこのワークフロー全体で使用されます。
- 各被験者の検査眼ごとに、OCT 用に 1 つのフォルダーを 1 つ設定し、それぞれ OD_OCT と OS_OCT という名前を付けます。Spectralis パイプラインは、「Mark_BScans_OCT」プラグインからの出力をタブ区切りの値としてこれらのフォルダーに自動的に保存します。
- QAF イメージの場合は、 OD_QAF と OS_QAF という名前の 2 つのフォルダーを作成します。
- 他のマルチモーダルイメージングモダリティを使用する場合は、追加のフォルダーを作成します。結果のフォルダー構造が、次の構造になっていることを確認します。
CASE_ID
OD_OCT
OD_QAF
OD_other_imaging_modality
OS_OCT
OS_QAF
OS_other_imaging_modality
5. QAF XMLファイルのQAF画像化(使用プラグイン:QAF_xml_reader)
- Spectralis QAF XML Exportファイルは、赤-緑-青(RGB)形式で保存され、0〜255(測定されたAF値を表す)のスケールに制限され、「標準」および「黒」のキャリブレーション領域が含まれます。「QAF_xml_reader」プラグインはQAF画像を生成します。このためには、 プラグイン のドロップダウンメニューを開き、 Spectralis |QAF_XML_Readerし、開始画面を破棄します。
- 新しいウィンドウが開き、「 Choose a directory containing a Spectralis XML QAF Export:」 というプロンプトが表示されます。 ディレクトリ を選択し、「 選択」をクリックします。
- QAF装置の基準校正係数(RCF)(QAF画像の画像情報に含まれる)と、画像撮影時の 患者の年齢 を入力します。
- 次のウィンドウは「QAF パラメーター (QAF Parameters)」と呼ばれます。画像取得時に患者が 偽水晶体 の場合は、代わりに 20歳 を選択します(これには年齢補正を適用しない効果があります)。 OKをクリックすると、 8ビットにマップ というラベルのポップアップが表示されたら、色分けされたQAF画像の最小QAF(qafMin)値と最大QAF(qafMax)値を入力します。qafMin と qafMax が不明な場合は、デフォルト設定を使用して「 OK」をクリックし、表示される [Raw QAF Data] というラベルの付いた元の画像と、32 ビットの QAF と 8 ビットの色分けされた QAF 画像を確認します。
注:色分けされたQAF画像は、説明のみを目的として使用されています。実際のQAF値を含む32ビットQAF画像は、さらなる分析に利用されます。
6. OCT画像にQAF画像を登録する(使用プラグイン:Register_OCT_2)
注:このステップは、OCT画像とQAF画像を正確に位置合わせし、QAF画像とOCT BScanの病変を位置合わせするために必要です。
- ドロップダウンメニューからプラグインにアクセスし ます プラグイン |Spectralis、または使用するさまざまなプラグインにアクセスするためのホットキーを作成します。これを実現するには Register_OCT_2 、[ プラグイン] |ショートカット |ショートカットを追加 目的の ホットキーを選択します。
- プラグインを開いた後、最初に表示されるウィンドウで[ OK ]をクリックします。次に、「 Choose a directory containing the Spectralis OCT XML export:」 というプロンプトを含むウィンドウが ImageJ のメインウィンドウに表示されます。 Spectralis OCT XML Export を含むフォルダを選択し、[ 開く]をクリックします。
注 : OCT が読み込まれますが、使用しているコンピュータの処理能力によっては、最大で 2 分かかる場合があります。 - 次に、「 登録した画像の保存先: 」というプロンプトを含むウィンドウがポップアップするのを待ちます。 EnFaceStack (アライメントされた画像ファイル)を保存するディレクトリを選択し、[ 開く]をクリックします。
- 「EnFaceStackに追加する画像を選択してください:」というプロンプトを含むポップアップウィンドウが表示されるのを待ち、32ビットQAF画像を選択して画像をSD-OCTに合わせ、「開く」をクリックします。この EnFaceStack に必要な画像がすべて含まれている場合は、[キャンセル]を選択します。
- 次のウィンドウで、 EnFaceStackのラベルを選択するようにユーザーに求められたら、事前に作成された QAF ラベルを選択します。または、「その他」(Other) ボックスにモダリティの名前を入力します。[ OK ] を選択してイメージを登録します。
注: [ その他 ] フィールドには、スペースやその他の句読点を含めないでください。 - ポップアップする 3 つのウィンドウを観察します。1つ目は Localizer というラベルが付いており、SD-OCTを 左目(OS) 画像として表示します。2 番目のウィンドウには、QAF または元の左目 (OS) または右目 (OD) として以前に選択した他のモダリティの 1 つという名前が付けられます。最後のウィンドウは [ランドマーク] と呼ばれ、各画像で 1 つから 3 つのランドマーク を選択するように求められます。
- 画像ごとに1〜3つのランドマークを選択して、2つの画像を位置合わせします-血管分岐または両方のモダリティにあるその他の特性。ランドマークを選択する前に、ズームインします(ズームインするには「+」キーボード文字を使用し、ズームアウトするには「-」を使用します)。選択したランドマークが画像内で垂直方向と水平方向の両方に広がっていることを確認します。すべてのランドマークに注釈を付けたら、[ランドマーク] タブで [OK] を選択し、次のプロンプトで [キャンセル] を選択します。
- 「結果を表示しますか」というウィンドウが表示されたら、[はい]を選択して、画像が正しく整列されているかどうかを確認します。これを行うには、小さな船を拡大してカーソルを横に置き、上下にスクロールして、カーソルに対して船がどれだけ動くかを確認します。アライメントが正確でない場合は、OD_QAFディレクトリの「.tiff」ファイルを削除し、手順2の最初からプロセスを再開します。
注:Mark_BScans_OCTのマーキングは正確でなければならないため、SD-OCTとQAF画像の間のアライメントも非常に正確でなければなりません。ピクセルパーフェクトなアライメントは、ほとんどの画像で実現できますが、アライメントが3〜4ピクセルの精度に制限される場合もあります。
7. 比較用の平均QAF画像作成(使用プラグイン:StandardRetina/BatchStandardRetina)
注:QAF値は網膜の位置に強く依存します(例:黄斑色素によって引き起こされる中心シャドーイング)。したがって、ドルーゼンのQAF値は、同じ領域の標準QAF値と比較する必要があります。解析の前提条件として、 StandardRetina は平均化されたQAF画像(例えば、年齢を合わせた対照コホートから)のenfaceマップを作成します。結果のenfaceマップは、中心網膜の平均QAF値のピクセルごとのマップを示しています。
- Spectralis パイプライン内で標準網膜を作成する方法は 2 つあり、1 つ目の AddToStandardRetina_OCT では一度に 1 つの新しい症例を enface マップに追加でき、2 つ目の BatchStandardRetina では複数の症例を一度に追加できます。
- 一度に 1 つの画像を追加するには、[ プラグイン] |スペクトル | AddToStandardRetina_OCT をクリックし、開始画面を閉じます。ウィンドウがポップアップし、「 Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export」というテキストが表示されたら、 フォルダ を選択し、「 選択 」をクリックしてBScanを開きます。
- 新しいウィンドウが表示され、「 Choose a directory containing registered EnFace images:」というプロンプトが表示されたら、 適切なフォルダ を選択して 「選択」をクリックします。
- ポップアップする3つのウィンドウ、1つは2番目のステップで選択したフォルダのスタック画像を表示する EnFaceStack 、OCT BScanを表示する Bscan スタックというラベルの付いた2番目のウィンドウ、そして中央に表示される3番目のウィンドウはモ ダリティの選択です。 EnFaceStackからモダリティを選択します。
- モダリティを選択し、プロンプト「Choose a directory containing the StandardRetina」でポップアップする新しいウィンドウを確認します。StandardRetina を含むディレクトリがまだ存在しない場合は、空のフォルダを選択して新しい StandardRetina を作成します。
- 新しい StandardRetina を調べ、上下にスクロールし、カーソルを移動して、その特定の場所の平均と標準偏差を表示します。ボタンをクリックします 同意しますか?StandardRetinaに最新の写真を追加するか、破棄します。
- 一度に複数の画像を追加するには、 Batch_QAF_StandardRetinaを使用します。
- まず、ケース ID と同じフォルダーに "manifest.txt" ファイルを用意し、.txt ファイルの場所から OCT および EnFaceStack への相対パスがリストされていることを確認します。この 2 つをタブ スペースで区切り、名前の前後に余分な空白がないことを確認します。ファイルは次の設定のようになります。
pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF - 表計算ソフトでファイルを作成し、 txtファイルとして保存します。マニフェストファイルが正しく機能するために、すべてのパスにスライス (文字) QAF が含まれていることを確認します。プラグインは、ドロップダウンメニューの [プラグイン] |SpectralisBatch-バッチ | QAF_StandardRetina。
- 開始画面を閉じ、新しいウィンドウが開くのを待ち、プロンプトが表示されます 最初の標準 Retina を選択します。既存の StandardRetina を含むフォルダーを選択するか、空のフォルダーを選択して新しい StandardRetina を作成します。
- 「モダリティの選択」というラベルの付いたプロンプトが表示されます。デフォルトは QAF です。それぞれのモダリティのファイル名が、マニフェストファイルで指定されているすべてのEnFaceStackのスライスのファイル名と完全に一致していることを確認します。次に、マニフェスト ファイルの選択を求めるウィンドウが開いたら (前述)、この StandardRetina に他のマニフェスト ファイルを追加しない場合は [キャンセル] をクリックするか、別のマニフェスト ファイルを選択します。[Accept?] というラベルの付いた新しいウィンドウで新しい StandardRetina を確認し、最新のバッチを StandardRetina に追加するか、最新のバッチを破棄するかを決定します。
注:すべてのQAFを StandardRetina に結合するプロセスには、しばらく時間がかかる場合があります。
- まず、ケース ID と同じフォルダーに "manifest.txt" ファイルを用意し、.txt ファイルの場所から OCT および EnFaceStack への相対パスがリストされていることを確認します。この 2 つをタブ スペースで区切り、名前の前後に余分な空白がないことを確認します。ファイルは次の設定のようになります。
8. 分析のために関心領域に注釈を付ける(使用プラグイン:Mark_BScans_OCT)
- 病変(ドルーゼンなど)をマークするには、 プラグイン |スペクトル |Mark_BScans_OCT して、開始プロンプトを閉じます。[ Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export ] というラベルの付いた新しいウィンドウを探します。目的のOCTがあるフォルダを選択し、「 OK」をクリックします。
- フィジーがOCTをロードした後、ラベルが付いた新しいウィンドウを観察します 登録 済みの顔画像を含むディレクトリ を選択してください が表示されます。 EnFaceStack を含むディレクトリを選択し、[ 選択]をクリックします。
- 3 つの新しいウィンドウが表示され、1 つは EnFaceStack、1 つは BscanStack、もう 1 つは User Parameters という名前です。
- [User Parameters] ウィンドウでは、出力 csv ファイルの名前に表示されるケース ID、mm 単位の帯域幅、enface 線幅、BScan 線幅、および領域マスクの不透明度のいずれかのパラメーターを入力するように求められます。
- パラメータ帯域幅(mm)は、各等角ハルの幅をミリメートル (mm) 単位で決定します。 Enfaceの線幅 を使用して、 EnFaceStackというラベルの付いたウィンドウ上のマークされた病変の線幅を変更します。
- BScan の線幅は、ウィンドウの Bscan スタックの線幅を決定します。このパラメータを 1 に設定することが、ほとんどの場合に最適な線幅設定であることに注意してください。
- 別のウィンドウに表示される En Face Mask または Distance Map のいずれかを選択して、バンドの内側に色を付けるかどうかを決定します。その後、プラグインの[BScanでマーク]ウィンドウで[完了]をクリックします。
- 次に、既存の StandardRetina を選択するように求められたら、StandardRetina を含むフォルダーを選択して [選択] をクリックします。 StandardRetinaが選択されている場合、出力Mark_BScans_OCTはモードZスコア(StandardRetinaと比較した測定されたQAF値)を選択することに注意してください。生のQAF値が望ましい場合は、[キャンセル]をクリックし、結果がzスコアではなく生の値になることを警告するメッセージというラベルの付いた新しいウィンドウを待ちます。
- [User Parameters] ウィンドウでは、出力 csv ファイルの名前に表示されるケース ID、mm 単位の帯域幅、enface 線幅、BScan 線幅、および領域マスクの不透明度のいずれかのパラメーターを入力するように求められます。
- 新しいウィンドウを探して、保存されたデータを含む 保存された状態を含むディレクトリを選択する ように促します。保存ファイルが存在する場合は、 スライスを含むディレクトリをクリックします |[選択] をクリックします。進行状況を保存しない場合は、[ キャンセル] を選択します。[ Mark in BScan] というラベルの付いた新しいウィンドウを探し、ドロップダウン メニューから [save]、[ ignore]、[done]、[ mark] を選択します。
- 印：BScanの関心領域に、上記で説明した「Register_OCT_2」プラグインと同様のコマンドを使用して注釈を付け始めます。領域をマークするには、右クリックしてマウスカーソルを病変の最後までドラッグして開始を選択し、B-スキャンでマークウィンドウがマークが選択されていることを確認して、OKをクリックします。関心領域は、このBScanでマークされています。
- 不問に付す：[Mark in BScan]ウィンドウで[Ignore]を選択し、[OK]をクリックしてマーキングを無視します。
- セーブ：[Mark in BScan]ウィンドウで[保存]を選択し、[OK]をクリックして新しいウィンドウを表示し、状態を保存するディレクトリを選択するプロンプトを表示します。既存のフォルダを選択するか、新しいフォルダを作成します。「Mark_BScans_OCT」を起動して既存のファイルを開き、保存状態を含むディレクトリを選択するウィンドウが表示されたら、保存状態を含むディレクトリを選択します。
注: 複数の保存状態を 1 つのディレクトリに保存することはできません。あるロケールから別のロケールへの保存状態は簡単に切り替えられません(例:GERMANからUSA)。 - 完成です：[BScanでマーク]ウィンドウで[完了]を選択し、[OK]をクリックして、選択モダリティというラベルの付いた新しいウィンドウを表示します。
- 「bring the correct modality on top of the enface stack」というラベルのプロンプトが表示されたら、「Register_OCT_2」を使用してアライメントされたQAFというモダリティを先頭に持ってきます。これを行うには、EnFaceStackをスクロールするか、[En face Stack]ウィンドウを選択するか、左矢印または右矢印をクリックします。モダリティの名前が左上隅に表示されることに注意してください。
- 病変をより適切に検査してマーキングするには、Bscanウィンドウを拡大します。 B-スキャン ウィンドウをクリックし、ズームインする方向にマウスを向けて、 + キーを押します。ズームアウトするには、- キーを押します。
- BScanスタックをスクロールするには、マウスを上下にスクロールするか、下部のバーを左または右にドラッグしてスキャン内を移動するか、B-スキャンフレームを選択してキーボードの左右の矢印キーをクリックします。BScanスタックの現在の領域の概要は、EnFaceStackウィンドウの赤い線と、BScan番号(31/120など)が表示されるBScanウィンドウの左上に表示されます。
- [ OK ]をクリックして、対応する「OD_OCT」または「OS_OCT」フォルダに新しい.tsvファイルを作成します。.tsv ファイル名は、「Mark_Bscans_OCT」と、入力されたケース ID、横方向、およびMark_Bscans_OCTの最後のステップで選択したモダリティで構成されます。 さらに、ドルーゼンの色分けされた「iso-hulls」が EnFaceStackに表示されるようになりました。
Representative Results
出力の表示
結果を適切に分析し、結論を導き出すには、Mark_Bscans_OCTの出力ファイルを理解することが重要です。最初の 3 つの列には、ケース ID、ファイルの横方向、および選択したイメージング モダリティの後にラベルが付けられます。4 番目の列は最頻値で参照され、Z スコアというラベルが付けられます。このテキストを書いている時点では、Mark BScansはすべての病変を一度にしか計算できないことに注意してください。行は等角ハルを参照し、その病変の外縁からの距離はスプレッドシートの下段と上段の列で指定されています。アイソハルは、病変を囲む特定の円周のZスコア(QAFの場合)でAFを測定します。アイソハルのピクセルの最小値は、minとラベル付けされた列にあり、中央値、max、mean、stdevとラベル付けされた列には、それぞれiso-hullのピクセル値の平均の中央値、最大値、平均値、標準偏差が含まれていることに注意してください。列 n には、アイソハルのピクセルの総数が含まれます。図1は、中等度の加齢黄斑変性症(iAMD)の84歳の男性患者の特異なマークされたソフトドルーゼンを示しています。
図2は、QAF-WorkflowツールでマークされたSDDを持つ代表的な患者の左眼を示しています(図3)。この患者のSDDはAFの低下と関連していた(zスコア= -0.4 ± 0.2)。同様に、SDD周辺のアイソハルは、StandardRetinaと比較してAFの低下を示しました(例:最も近いアイソハル= -0.3 ± 0.3)。この現象のもっともらしい説明は、RPEに対するSDD病変の影の効果(半透明の低下)である可能性があります。SDDの使用は模範的でした。このツールは、ドルーゼンなどの他の病変における局所的なAFレベルの評価も可能にします。さらに、このツールでは、病変からのAFの変化を経時的に追跡することができます。
図1:中等度の加齢黄斑変性症(iAMD)の84歳男性患者の特異なマークされたソフトドルーゼン 。 (A)マークされたドルーゼンを持つ左目のQAF画像。(B)ドルーゼンのクローズアップ:茶色の中央はマークされたドルーゼンを表し、色付きの帯は周囲のアイソハルを表しています。次の表に、出力ファイルを示します。QAF ドルーゼン値は、StandardRetina の対応する偏心の対応する QAF 値と比較されます。この結果、影響を受けていない領域の平均からの偏差を表す Z スコアが得られます。青いボックスは左から右に、症例ID、眼球の側性、使用されたモダリティ、および目的の出力(この場合はzスコア)を示しています。オレンジ色のボックス内の列は、測定領域の境界をミリメートル単位で示しています(下限=下限、上限=上限)。緑色のボックスは、QAF測定値を示す列にラベルを付けます。左から右に、平均の最小値、中央値、最大値、ピクセル数、平均値、標準偏差が含まれます。各行は等値ハルを表し、青色のボックス内の行は病変内の値を表し、紫色のボックス内の行は各病変を囲む等値ハルを示します(上から下へ、病変までの距離が長くなります)。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:早期AMDの80歳女性患者のQAF画像にマークされたSDD 。 (A)QAF画像にSDDが見える。同じQAF画像にSDDの注釈が刻印されて表示されます。 (B)マークされた各病変の周囲に、等圧包が色分け(薄緑、濃い緑、赤)で描かれています。(C)青い長方形の拡大版。各 SDD の外側のエッジは青色でマークされています。略語:QAF =定量的自家蛍光;AMD = 加齢黄斑変性症;SDD = 網膜下ドルセノイド沈着物。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:病変の心房細動を判定するワークフロー。 この図は、病変特異的AFを決定するために必要なソフトウェアプラグインを視覚化したものです。(A)画像は、QAF値の分布を可視化するために使用できる色分けされたQAF画像を示していますが、それ以上の分析には使用しないでください。 (B)手前がQAF画像、背景がSD-OCTスキャンの赤外線画像。これは、血管の分岐を使用してアライメントを視覚化することになっています。これは、Register_OCT_2 プラグインを使用して実行できます。(C)病変のzスコア値を測定するために使用されるStandardRetina。StandardRetina は、StandardRetina / BatchStandardRetina を使用して作成できます。(D)黄色の線で強調表示されたSDDを指す青い矢印のBScanが描かれています(注:病変は、z方向の位置とは無関係に、常にRPEの下にマークされます)。(E)マークされたすべての病変がQAF画像に刷り込まれているのが見られます( 図1を参照)。最後の 2 つのステップは、Mark_BScans_OCT プラグインを使用して行います。略語:AF =自家蛍光;QAF = 定量的自家蛍光;SDD = 網膜下ドルセノイド沈着物;IR = 赤外線;RPE = 網膜色素上皮;SD-OCT = スペクトル領域光干渉断層撮影法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
このワークフローでは、オープンソースのFIJIプラグインツールを使用して、AMD特異的病変の心房細動を判定および比較するためのステップバイステップガイドを提供します。プラグインは、コーディングの知識を必要とせず、技術サポートなしで医師が適用できる使いやすいテンプレートを提供します27。私たちの知る限り、これらのツールは病変特異的なAF定量化のための他に類を見ないものです。
QAF値は網膜全体で自然に変化し、網膜内のリポフスチンとメラノリフシンの分布が不均一であること、血管のAFが低いこと、黄斑色素の分布が不均一であるため、末梢で値が高くなり、黄斑で低くなります。網膜に自然に発生するQAFレベルの変動が大きいため、病変の絶対QAF値を直接分析することは有望なアプローチではありません。例えば、末梢の低自家蛍光病変は、黄斑の生理学的蛍光レベルよりも高い絶対QAF値を有する可能性がある。StandardRetinaの使用とzスコアの使用によるドルーゼンの蛍光レベル測定は、この自然に発生するQAF値の変動を補正します。
Z スコアは、関心領域の値と StandardRetina の平均との関係を数値で測定したものです。これは、同じ場所の StandardRetina の平均から個人の平均を減算し、その結果を標準偏差で割ることによって計算されます。この標準化により、Zスコアは値が平均と異なる標準偏差の数を示すため、異なるQAF画像の比較が可能になります。正の Z スコアは値が平均を上回っていることを示し、負の Z スコアは平均を下回っていることを示します。
考慮すべき潜在的な落とし穴がある可能性があることに注意することが重要です。この方法は、眼底全体のAFレベルのさまざまな量を考慮していますが、RPEのAFを測定および比較するための最も正確な方法ではない可能性があります。黄斑黄体色素のレベルとトポグラフィーは個人によって異なり、病変は上にある網膜の半透明にも影響を与える可能性があります28,29。したがって、SDDの領域で測定されたAFの低下(代表的な結果を参照)は、RPE30,31,32の蛍光色素の減少ではなく、シャドウイング効果の結果であると考えられます。
現在、網膜の反射率、厚さ、および定量化された黄斑色素(緑と青のAFを使用)を線形混合モデルで説明するワークフローに取り組んでいます。さらに、これまでのところ、QAF は年齢依存の補正係数を使用して、同様の年齢の参加者のレンチキュラー混濁の個人間差を無視したレンチキュラー混濁を考慮しています。そのため、現在、レンチキュラー自家蛍光と混濁の個別化補正因子のワークフローに取り組んでいます。小さな病変から心房細動の情報を確実に抽出するためには、QAF画像の十分な検査・再検査の信頼性が必要である。より詳細な解析が可能なQAF画像をさらに差別化するために、QAF画像のテスト-再テストの信頼性を予測できる「QAF画像信頼性指標」を検討しています。現段階では、重複画像を取得し、病変特異的AFの再検査信頼性を調査することが賢明なアプローチです。
病変の等圧包を追加解析する提示方法は、隣接する病変の等圧包が融合するため、技術的に実装が困難であった。融合した等殻の領域は、どの病変が考慮されるかに応じて明確に特徴付けることができます。私たちの解決策は、1つのタイプのすべての病変を1つの病変と見なし、それらの周辺を関節アイソハルとして分析することでした。しかし、この方法では、個々のドルーゼンのアイソハルを測定する能力が大幅に低下し、この手法のさらなる落とし穴と見なされる可能性があります。融合したアイソハルを説明するためのより技術的に洗練された方法、または融合したアイソハルの領域における心房細動の報告の中断は、将来、病変の周囲における心房細動の分析を容易にする可能性がある。
この研究のモデル疾患としてAMDを使用しました。このワークフローは、他の疾患の病変の研究にも適用できます。これまでのところ、QAFは劣性スターガルト病、ベストロフィン-1関連疾患、さまざまな形態の網膜色素変性症、急性帯状潜伏性外網膜症、弾性偽黄色腫など、多くの脈絡網膜疾患で使用されています17,33,34,35,36,37.このワークフローはオープンソースソフトウェアを使用しているため、病変特異的AFの決定においてこの作業を複製し、網膜障害に関する知識を広げることをお勧めします。要約すると、黄斑全体のさまざまな網膜病変のAFレベルを決定して比較するためのワークフローを提示します。このワークフローは、心房細動のより詳細な分析への道を開き、AMDおよびそれ以降の新しいバイオマーカーの開発を促進する可能性があります。
Disclosures
レオン・フォン・デア・エムデは、ハイデルベルク・エンジニアリングから支払いを受けたと報告しています。Merten Mallwitzは財務情報開示を報告していません。ケネス・R・スローンも財務情報開示を報告していない。Frank G. Holzは、Acucela、Alcon(C)、Gyroscope Allergan Apellis、Bayer Bioeq/Formycon、CenterVue、Roche/Genentech、Geuder、Ivericbio、NightStarX、Novartis、Optos、Oxurion、Pixium Vision、Stealth BioTherapeutics、Zeiss、GRADE Reading centerのコンサルティング/個人支払いについて報告しています。Thomas Achは、バイエル、アペリス、ロシュ、ノバルティスのコンサルティング/個人支払いを報告しています。
Acknowledgments
この研究は、ドイツ眼科学会(DOG)の博士課程学生への助成金(MW)およびNIH/NEI 1R01EY027948(TA)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BatchStandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| FIJI (Image J) | n.a. | n.a. | n.a. |
| Mark_Bscans_OCT plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Microspft office | Microsoft | n.a. | n.a. |
| QAF_xml_reader plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Register_OCT_2 plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Spectralis | Heidelberg Engineering | n.a. | QAF extension |
| StandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
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