Summary
该方案侧重于碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管形成。该方法生成了可重复和可控的角膜疾病模型，以研究病理性血管生成和相关分子机制，并测试新的药物以预防角膜新生血管形成。
Abstract
角膜新生血管形成 （CoNV） 是血管生成的一种病理形式，涉及血液和淋巴管从角膜缘生长到缺血性角膜，并对透明度和视力产生不利影响。碱烧伤是导致CoNV的最常见眼外伤形式之一。在该协议中，使用氢氧化钠溶液以受控方式实验诱导CoNV，以确保可重复性。碱烧伤模型有助于了解 CoNV 的病理学，并且可以扩展到研究一般的血管生成，因为角膜的无血管性、透明度和可及性。在这项工作中，通过在解剖显微镜下直接检查并使用抗 CD31 mAb 对扁平角膜进行免疫染色来分析 CoNV。使用抗 LYVE-1 mAb 进行免疫染色，在扁平角膜上检测到淋巴管生成。角膜水肿使用光学相干断层扫描 （OCT） 进行可视化和量化。总之，该模型将有助于推进现有的新生血管化检测，并发现病理性眼部和眼外血管生成的新治疗策略。
Introduction
角膜是一种无血管组织，通过建立血管生成特权来保持其透明度 1,2。角膜损伤可导致炎症以及血液和淋巴管的发育，以及纤维化3.角膜新生血管形成 （CoNV） 会导致视力障碍，是全球失明的第二大原因4.CoNV 每年影响美国约 140 万人5.CoNV 可由多种因素诱发，包括化学灼伤、感染、炎症和缺氧 3,6。化学烧伤是最常见的眼部急症之一，约占眼外伤的 13.2%，需要立即评估和治疗7.化学烧伤可能是碱烧伤或酸烧伤，但碱烧伤会造成更严重的伤害，因为碱会更深入地渗透到组织中8.
碱烧伤小鼠模型被广泛用于研究CoNV和伤口愈合。与角膜袋血管生成模型 9,10 相比，碱烧伤模型的创建相对简单，也可用于研究角膜炎症、纤维化和上皮增生。这些模型与临床化学烧伤的关系也比血管生成的角膜缝合模型更密切11。碱烧伤时，由于炎症以及抗血管生成和促血管生成因子的不平衡，其他缺血性角膜会形成血管1,2。角膜碱烧伤模型的缺点是难以控制碱烧伤的面积和严重程度、角膜新生血管的变化以及由于碱溶液过量而导致的邻近组织无意烧伤。本研究的目的是描述使用预浸泡在氢氧化钠溶液中的滤纸在小鼠中受控的角膜碱烧伤模型。该模型可用于研究血管生成因子、抗血管生成治疗试剂以及其他可以调节炎症和纤维化的因子和试剂。
Protocol
所有动物工作，包括实验程序和安乐死，均由贝勒医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，协议编号为 AN-8790。
1. 1 N NaOH的制备
- 将 4 mL 无菌去离子水加入 15 mL 离心管中。称出 400 毫克氢氧化钠 （NaOH），小心地加入试管中。
- 通过使用玻璃棒缓慢搅拌溶液来溶解NaOH。通过向试管中加入无菌去离子水，将体积补足至10mL，然后通过轻轻地上下倒置试管再次混合。盖紧盖子，将溶液储存在室温下。
- 每月准备新鲜溶液，因为吸收空气中二氧化碳的溶液可能会降低 NaOH 溶液的浓度。
- 使用前务必轻轻混合 NaOH 溶液。
注意：在化学防护罩内准备溶液，并穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。
2.4%多聚甲醛（PFA）溶液的制备
- 向玻璃烧杯中加入 30 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。称出 4 克多聚甲醛 （PFA），并将其加入烧杯中。
- 搅拌下将烧杯保持在60°C的热板上。滴加1N NaOH溶液以提高pH值，直到溶液澄清。
- 使用 1 N 盐酸 （HCl） 检查并将 pH 值调节至 7.4。用 1x PBS 将最终体积调节至 50 mL。
- 冷却并过滤溶液。将溶液储存在4°C。
注意： 在通风橱中准备溶液，同时穿着适当的个人防护装备。
3. 准备氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒
- 通过将 0.8 mL 氯胺酮（原液浓度：100 mg/mL）和 0.16 mL 甲苯噻嗪（原液浓度：100 mg/mL）加入 9.4 mL 生理盐水中来制备氯胺酮/甲苯噻嗪混合物。
- 在室温 （RT） 下将混合物储存在无菌注射瓶中。
4.碱烧伤小鼠角膜
- 在手术前 30 分钟皮下注射美洛昔康（4-6 mg/kg 体重）以缓解疼痛。使用腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（氯胺酮80mg / kg和甲苯噻嗪16mg / kg体重）麻醉小鼠（C57BL / 6J，6-8周龄，雄性）。
- 通过捏住鼠标的脚趾来检查反射反应（踏板退出），并确认没有反射。在一只眼睛的角膜表面滴一滴局部麻醉剂，0.5%的丙美卡因，在另一只眼睛上滴一滴人工泪液。
- 使用 2 毫米活检打孔器，打出 Whatman 滤纸盘。
- 将 2 μL 1N NaOH 加入干净的培养皿中。将 2 mm 滤纸盘放在 1 N NaOH 液滴上，并使其浸泡 15 秒。
- 用镊子拿起滤纸，将滤纸涂在角膜中心的丙美卡因处理的眼睛上30秒。
注意： 滤纸必须仅接触角膜中心，并且必须注意避免滤纸在放置后移动，因为移动滤纸会导致邻近组织灼伤。 - 在无菌注射器中用 20 mL 无菌盐水溶液冲洗眼睛。
注意：必须注意确保彻底清洗角膜和结膜囊，以确保不会对角膜或周围组织造成进一步损害。清洗结膜囊将进一步预防眼睑。 - 使用一次性软湿巾轻轻擦拭眼睛和周围区域多余的盐水。之后，将小鼠保持在温暖的加热垫上的恢复笼中，直到可以走动。
注：碱烧伤3天后每天监测小鼠。如果观察到疼痛或压力症状，则皮下注射美洛昔康（4-6mg / kg体重）。
5.新生血管渗入和混浊的检查和评估
- 在麻醉小鼠中，在烧伤后第10天在解剖显微镜下检查眼睛，并使用连接到解剖镜的相机获得图像以对混浊和新生血管进行评分。
注意：带有摄像头的常规解剖镜就足够了。 - 在通过解剖显微镜观察角膜的同时，根据以下等级12 对烧伤后的不透明度进行评分：
0 = 无不透明度;透明角膜
1 = 轻度混浊;虹膜和瞳孔区域有轻微的朦胧感;虹膜和瞳孔清晰可见
2 = 中度不透明度;虹膜和瞳孔几乎看不见
3 = 严重混浊;虹膜或瞳孔不可见
4 = 不透明角膜;虹膜和瞳孔不可见 - 在通过解剖显微镜观察角膜时，根据以下等级12 对 CoNV 进行评分：
0 = 无新生血管形成;没有来自角膜缘的新血管
1 = 轻度新生血管形成;源自角膜缘的新血管
2 = 中度新生血管形成;血管起源于角膜缘，向角膜中心生长
3 = 严重新生血管形成;起源于角膜缘并到达和/或穿过角膜中心的血管 - 使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的混浊和新生血管形成评分进行统计比较。
- 在第10天通过5%的异氟醚暴露对小鼠实施安乐死，直到呼吸停止后1分钟，然后进行颈椎脱位，并收集角膜进行平坦成像。
6. 光学相干断层扫描（OCT）成像
- 在烧伤后第10天拍摄麻醉小鼠眼睛前段的OCT图像。使用 IR + OCT 模式以 30° 视场和 100% IR 强度的 IR + OCT 模式以体积扫描形式执行 OCT 图像采集。
- 使用 ImageJ 软件量化角膜的厚度。
- 要测量厚度，请使用 ImageJ 软件中的 线选择 工具在中央角膜的前表面和后表面之间创建一条直线。
- 单击软件工具中的 “分析>测量 ”，将值传输到数据窗口。
- 将这些值复制到电子表格文件中，并使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的角膜厚度进行统计比较。
注意：角膜的厚度是从角膜前表面的一点到角膜中心角膜后表面最近点的距离。
7. 扁平角膜上CoNV的免疫染色
- 在碱烧伤后第10天对小鼠实施安乐死，并通过钝性解剖摘除眼睛。
- 用拇指和食指拉开眼睑，将镊子放在眼球下方。关闭镊子，轻轻地将眼球从眼眶上拉开。
- 将眼球放入1x PBS中。对于每个眼球，首先在角膜缘区域下方用 30 G 针切开一个切口，从眼球上取下角膜。
- 用角膜微剪刀在角膜缘周围剪开，以切口为起点，慢慢将角膜和角膜缘与眼球分开。
- 使用细画笔轻轻清洁角膜以去除虹膜。将角膜固定在4%多聚甲醛中1小时。
- 在室温（RT）下在1x PBS中洗涤角膜三次，每次20分钟。
- 在室温下在封闭缓冲液（补充有0.1%Triton-X 100和5%牛血清白蛋白[BSA]的1x PBS）中孵育1小时。
- 将角膜转移到含有一抗的抗体溶液中。在补充有 1% BSA、0.1% Triton-X 100、Dylight550 偶联的抗 CD31 mAb （1：100） 和 Alexa Fluor488 偶联的抗 LYVE-1 mAb （1：100） 的 1x PBS 中制备抗体溶液。
- 在4°C孵育3天。 在1x PBS中洗涤角膜3次，每次20分钟。
- 在黑暗中使用Hoechst染色溶液（1：1,000）染色细胞核5分钟。
- 用径向切口压平角膜，并使用安装介质和盖玻片将它们安装在预先清洁的载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片，并在黑暗中干燥载玻片过夜，然后通过共聚焦显微镜进行分析。
- 通过拼接单个 Z 堆栈图像，使用共聚焦显微镜对平坦的角膜进行成像;在非共振振流扫描仪上使用 10 倍物镜、488 nm 和 561 nm 激光器，每层分辨率为 512 像素 x 512 像素。
- 使用 ImageJ 软件量化 CD31+ 血液和 LYVE-1+ 淋巴管的密度。
- 要确定血管密度，请将共聚焦图像转换为 8 位图像。
- 从插件中选择血管密度。
- 选择图像上的感兴趣区域，然后单击 “确定”。测量值将在新的数据窗口中打开。
- 将这些值复制到电子表格文件中，并使用学生 t 检验对碱烧伤和健康眼组之间的血管密度进行统计比较。
注：CD31，也称为血小板内皮细胞粘附分子-1 （PECAM-1），是一种参与血管生成的细胞粘附分子，在早期和成熟血管的内皮细胞中高度表达13。LYVE-1（淋巴管内皮透明质酸受体-1）是淋巴内皮细胞上的细胞表面标志物，可用作淋巴管生成标志物14。
Representative Results
本研究描述了一种通过碱烧诱导小鼠眼角膜血管生成的方法。解剖显微镜（图1A，B）显示碱烧伤组角膜新生血管形成和混浊评分显著升高（P < 0.05;图1C，D）。在第 10 天收集的角膜分别用血管抗 CD31 mAb 和淋巴管抗 LYVE-1 mAb 进一步免疫染色（图 2A-I）。碱烧伤组10 d后血液和淋巴管密度显著升高（P < 0.001和P < 0.05;图2J，K）。使用OCT成像和量化的角膜厚度（图3A，B）观察到碱烧伤组的角膜厚度显着更高（P < 0.01;图3C）。
图 1：碱烧伤引起的角膜新生血管形成和混浊。 （甲，乙）角膜新生血管从角膜缘血管向角膜中心萌发，在受伤后 10 天，碱烧伤的小鼠眼 （A） 但不是健康的眼睛。（C，D）图 A 和 B 中 （C） 角膜新生血管和 （D） 混浊的量化（± SEM;t 检验;*P < 0.05;n = 3 只眼睛，1 只眼睛/小鼠）。红色箭头表示角膜缘，黄色箭头表示萌发的新血管。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：碱烧伤引起的角膜新生血管形成和淋巴管生成。 免疫组化分别使用抗 CD31 和抗 LYVE-1 mAb 显示 （A、D、G） 血液和 （B、E、H） 淋巴管。（空调）健康的小鼠角膜。（D-I）碱烧伤角膜 受伤后 10 天。（C，F，I）CD31 和 LYVE-1 信号的叠加图像。（G-I）面板 D-F 的放大图像。比例尺 = （A-F） 200 μm 和 （G-I） 500 μm。 （J，K） 如图所示，图 A-F 中血液和淋巴管密度的量化（± SEM;t 检验;*P < 0.05;***P < 0.001;n = 3 只眼睛，1 只眼睛/只小鼠）。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：碱烧伤引起的角膜厚度增加 。 （A） 健康小鼠眼睛的 OCT 图像。（B） 碱烧伤后 10 天小鼠角膜的 OCT 图像。（C） 在角膜中心测量的图 A 和 B 中角膜厚度的量化（± SEM;t 检验;**P < 0.01;n = 3 只眼睛，1 只眼睛/只小鼠）。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
角膜是研究血管生成和炎症的极好组织，因为它是可触及的和无血管的，这意味着可以方便地检测和记录新生血管形成。兔子、大鼠和小鼠的角膜烧伤已被用于研究角膜血管生成、炎症和混浊、溃疡、角膜穿孔和纤维化15,16,17。此外，角膜烧伤小鼠模型对于测试血管生成和炎症的各种治疗策略很有价值，因为小鼠的免疫系统与人类密切相关18。基因操纵小鼠基因组的技术的可用性也使该物种成为此类研究的绝佳选择19。这项研究的挑战是开发一种角膜烧伤方法，以提供一致、可重复的病理生理学。
碱烧伤模型对于调节血管生成、炎症和纤维化的药物的药理学筛选特别有用。对试剂和资源的最低要求，进行碱烧伤的简单性，以及方案持续时间短和结果的直接观察的好处，使碱烧伤在小鼠角膜上成为药物筛选的首选。但是，在执行此程序时应考虑一些预防措施，以确保一致性和可重复性。首先，滤纸必须放置在角膜中央，以免灼伤眼睛的其他区域，尤其是角膜缘、眼睑和结膜;其次，NaOH的体积和浓度应适当，以便从角膜上的碱烧伤中获得一致的结果。过滤器不得滴湿，而应浸泡在 NaOH 溶液中。该方法中使用的过滤器尺寸和过滤器类型以及溶液的正态性和体积经过优化，以避免 NaOH 溢出。使用不同尺寸的滤纸或更高或更低体积的 NaOH 会导致新生血管形成不一致。第三，重要的是防止 NaOH 溶液吸收室内空气中的 CO2 ，方法是在使用后立即拧紧溶液的管帽并降低空气/溶液比。必须注意使用新鲜的碱溶液，以防止新生血管形成不一致并避免角膜溃疡。最后，必须用生理盐水从眼睛和结膜中广泛清洗所有NaOH溶液，以防止对角膜和眼睛周围组织的进一步损害。彻底清洗角膜和邻近组织也将防止眼睑。
这里描述的方案是研究角膜血管生成的病理生理学的有效和可靠的方法。该方案可进一步用于研究角膜炎症、纤维化和伤口愈合。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了SRB慈善公司，美国国立卫生研究院（NIH）P30EY002520的支持，以及预防失明研究（RPB）对贝勒医学院眼科的无限制机构资助。W.L.得到了圣殿骑士团眼科基金会眼科基金会基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
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