Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודל עכבר לניאו-וסקולריזציה של הקרנית על ידי כוויה אלקלית

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65289
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cullen Eye Institute, Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתמקד בניאו-וסקולריזציה של הקרנית הנגרמת על ידי כוויות אלקליות בעכברים. השיטה מייצרת מודל למחלות קרנית הניתנות לשחזור ולשליטה כדי לחקור אנגיוגנזה פתולוגית ואת המנגנונים המולקולריים הקשורים ולבדוק סוכנים פרמקולוגיים חדשים למניעת ניאו-וסקולריזציה של הקרנית.

Abstract

ניאו-וסקולריזציה של הקרנית (CoNV), צורה פתולוגית של אנגיוגנזה, כרוכה בצמיחה של כלי דם ולימפה לתוך הקרנית האווסקולרית מהלימבוס ומשפיעה לרעה על השקיפות והראייה. כוויה אלקלית היא אחת הצורות הנפוצות ביותר של טראומה עינית המובילה ל- CoNV. בפרוטוקול זה, CoNV מושרה באופן ניסיוני באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסידי באופן מבוקר כדי להבטיח יכולת שחזור. מודל הכוויה האלקלי שימושי להבנת הפתולוגיה של CoNV וניתן להרחיב אותו לחקר אנגיוגנזה באופן כללי בגלל האווסקולריות, השקיפות והנגישות של הקרנית. בעבודה זו, CoNV נותח על ידי בדיקה ישירה תחת מיקרוסקופ מנתח ועל ידי immunostaining קרניות שטוחות באמצעות anti-CD31 mAb. Lymphangiogenesis זוהה על קרניות שטוחות על ידי immunostaining באמצעות anti-LYVE-1 mAb. בצקת בקרנית הודגמה וכומתה באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). לסיכום, מודל זה יסייע לקדם בדיקות neovascularization קיימות ולגלות אסטרטגיות טיפול חדשות עבור אנגיוגנזה פתולוגית של העין והחוץ עינית.

Introduction

הקרנית היא רקמה אווסקולרית השומרת על שקיפותה על ידי הקמת פריבילגיה אנגיוגנית 1,2. נזק לקרנית עלול לגרום לדלקת ולהתפתחות כלי דם ולימפה, כמו גם פיברוזיס3. ניאו-וסקולריזציה של הקרנית (CoNV) מובילה לליקוי ראייה והיא הגורם השני המוביל לעיוורון בעולם4. CoNV משפיע על כ -1.4 מיליון אנשים בארצות הברית בשנה5. CoNV יכול להיגרם על ידי גורמים שונים, כולל כוויות כימיות, זיהומים, דלקת, היפוקסיה 3,6. כוויות כימיות הן אחד ממקרי החירום העינים השכיחים ביותר, והן מהוות כ-13.2% מהטראומה העינית ודורשות הערכה וטיפול מיידי7. כוויות כימיות יכולות להיות כוויות אלקליות או חומצתיות, אך כוויות אלקליות גורמות לפציעה חמורה יותר, שכן אלקלי חודר עמוק יותר לתוך הרקמה8.

מודלים עכבריים של כוויה אלקלית נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד CoNV וריפוי פצעים. בהשוואה לאנגיוגנזה של כיס הקרניתמודל 9,10, מודלים של כוויות אלקליות הם פשוטים יחסית ליצירה וניתן להשתמש בהם גם לחקר דלקת בקרנית, פיברוזיס והתפשטות אפיתל. מודלים אלה גם קשורים יותר לכוויות כימיות קליניות מאשר מודלים של תפרי קרנית של אנגיוגנזה11. עם כוויה אלקלית, הקרנית אווסקולרית אחרת מפתחת כלי דם עקב דלקת וחוסר איזון בגורמים אנטי אנגיוגניים ופרו-אנגיוגניים 1,2. החסרונות של מודלים של כוויות אלקליות בקרנית הם הקשיים בשליטה על האזור והחומרה של הכוויה האלקלית, השונות בניאו-וסקולריזציה של הקרנית, וצריבה לא מכוונת של הרקמות הסמוכות עקב עודף תמיסת אלקלי. מטרת מחקר זה היא לתאר מודל מבוקר של כוויה אלקלית בקרנית בעכברים באמצעות נייר סינון שהושרה מראש בתמיסת נתרן הידרוקסידי. מודל זה יכול לשמש לחקר גורמים אנגיוגניים, ריאגנטים טיפוליים אנטי-אנגיוגניים, וגורמים וריאגנטים אחרים שיכולים לווסת דלקת ופיברוזיס.

Protocol

כל עבודת בעלי החיים, כולל הליכי הניסוי והמתת החסד, אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת ביילור לרפואה עם פרוטוקול מספר AN-8790.

1. הכנת 1 N NaOH

  1. הוסף 4 מ"ל של מים סטריליים deionized צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. שוקלים 400 מ"ג נתרן הידרוקסידי (NaOH), ומוסיפים לצינור בזהירות.
  2. ממיסים את ה-NaOH על ידי ערבוב איטי של התמיסה באמצעות מוט זכוכית. הגדילו את הנפח ל-10 מ"ל על ידי הוספת מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה לצינור, וערבבו שוב על ידי היפוך עדין של הצינור מעלה ומטה. סגרו היטב את המכסה ואחסנו את התמיסה בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו את התמיסה הטרייה מדי חודש מכיוון שריכוז תמיסת NaOH עשוי להיות מופחת על ידי ספיגת פחמן דו חמצני באוויר.
  4. יש לערבב תמיד בעדינות את תמיסת NaOH לפני השימוש.
    אזהרה: יש להכין את התמיסה בתוך מכסה מנוע כימי וללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים.

2. הכנת תמיסת פרפורמלדהיד 4% (PFA)

  1. הוסף 30 מ"ל של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) לכוס זכוכית. שקלו 4 גרם של פרפורמלדהיד (PFA), והוסיפו אותו לכד.
  2. שומרים את הכד על צלחת חמה בטמפרטורה של 60°C עם ערבוב. הוסף את תמיסת 1 N NaOH טיפה כדי להעלות את ה- pH עד שהתמיסה מתבהרת.
  3. בדוק והתאם את ה- pH ל- 7.4 באמצעות 1 N חומצה הידרוכלורית (HCl). כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 50 מ"ל עם PBS אחד.
  4. מצננים ומסננים את הפתרון. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
    אזהרה: יש להכין את התמיסה במכסה אדים תוך לבישת ציוד הגנה אישי מתאים.

3. הכנת קוקטייל קטמין/קסילזין

  1. הכינו את קוקטייל הקטמין/קסילזין על ידי הוספת 0.8 מ"ל קטמין (ריכוז במלאי: 100 מ"ג/מ"ל) ו-0.16 מ"ל קסילזין (ריכוז במלאי: 100 מ"ג/מ"ל) ל-9.4 מ"ל מי מלח.
  2. אחסנו את הקוקטייל בבקבוקי הזרקה סטריליים בטמפרטורת החדר (RT).

4. שריפה אלקלית על קרנית העכבר

  1. יש להזריק מלוקסיקאם (4-6 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת עורית 30 דקות לפני ההליך לשיכוך כאבים. מרדימים את העכברים (C57BL/6J, גיל 6-8 שבועות, זכר) באמצעות הזרקת i.p. של קוקטייל קטמין/קסילזין (קטמין 80 מ"ג/ק"ג וקסילזין 16 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  2. בדוק את תגובת הרפלקס (משיכת הדוושה) על ידי צביטת אצבעות העכבר, ואשר את היעדר הרפלקס. יש למרוח טיפה אחת של חומר הרדמה מקומי, 0.5% פרופרקאין, על פני הקרנית של עין אחת, וטיפת דמעות מלאכותיות על העין השנייה.
  3. באמצעות ניקוב ביופסיה 2 מ"מ, ניקוב החוצה דיסקים נייר סינון Whatman.
  4. הוסיפו 2 μL של 1N NaOH לצלחת פטרי נקייה. הניחו את דיסק נייר הסינון בקוטר 2 מ"מ על טיפת 1 N NaOH והניחו לו להשרות למשך 15 שניות.
  5. הרימו את נייר הסינון עם מלקחיים, ומרחו את נייר הסינון על העין שטופלה בפרופרקאין במרכז הקרנית למשך 30 שניות.
    הערה: נייר הסינון חייב לגעת רק במרכז הקרנית, ויש להקפיד להימנע מתזוזה של נייר הסינון לאחר הנחתו, שכן הזזת נייר הסינון עלולה לגרום לכוויות ברקמות הסמוכות.
  6. לשטוף את העין על ידי שטיפה עם 20 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית מזרק סטרילי.
    הערה: יש להקפיד על כך שהקרנית, יחד עם שק הלחמית, נשטפים ביסודיות כדי להבטיח שלא ייגרם נזק נוסף לקרנית או לרקמה שמסביב. שטיפת שק הלחמית תמנע עוד יותר את הסימבלפרון.
  7. נגבו את עודפי המלח בעדינות מהעיניים ומהסביבה באמצעות מגבונים רכים חד פעמיים. לאחר מכן, החזיקו את העכברים בכלוב התאוששות על כרית חימום חמה עד לאמבולטורי.
    הערה: עכברים מנוטרים מדי יום לאחר כוויה אלקלית במשך 3 ימים. אם הסימפטומים של כאב או מתח נצפים, meloxicam (4-6 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף) מנוהל תת עורית.

5. בדיקה והערכה של neovascularization ואטימות

  1. בעכברים מורדמים, בדקו את העיניים תחת מיקרוסקופ דיסקציה ביום ה-10 לאחר הכוויה, וקבלו תמונות באמצעות מצלמה המחוברת לטווח הדיסקציה כדי לסקור את האטימות והניאו-וסקולריזציה.
    הערה: היקף דיסקציה רגיל עם מצלמה מחוברת מספיק.
  2. בעת התבוננות בקרנית דרך מיקרוסקופ דיסקציה, דרגו את האטימות לאחר הכוויה בהתבסס על סולם12 הבא:
    0 = ללא אטימות; קרנית שקופה
    1 = אטימות קלה; ערפול קל באזורי הקשתית והאישון; איריס ואישון גלויים בקלות
    2 = אטימות מתונה; איריס ואישון בקושי נראים
    3 = אטימות חמורה; קשתית או אישון אינם גלויים
    4 = קרנית אטומה; איריס והאישון אינם גלויים
  3. בעת התבוננות בקרנית דרך מיקרוסקופ דיסקציה, ציון CoNV מבוסס על סולםהבא 12:
    0 = ללא ניאו-וסקולריזציה; אין כלי שיט חדשים מהלימבוס
    1 = neovascularization קל; כלי שיט חדשים שמקורם בלימבוס
    2 = neovascularization מתון; כלי הדם מקורם בלימבוס וצומחים לכיוון מרכז הקרנית
    3 = neovascularization חמור; כלי דם שמקורם בלימבוס ומגיעים ו/או חוצים את מרכז הקרנית
  4. השתמש במבחן t של תלמיד כדי להשוות סטטיסטית את ציוני האטימות והניאו-וסקולריזציה בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות.
  5. הרדימו את העכברים ביום ה-10 על ידי חשיפה לאיזופלורן ב-5% עד דקה לאחר הפסקת הנשימה, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם, ואספו את הקרניות לצורך הדמיה שטוחה.

6. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) הדמיה

  1. צלם תמונות OCT של החלק הקדמי של העיניים בעכברים מורדמים ביום 10 לאחר הכוויה. בצע רכישת תמונת OCT כסריקת אמצעי אחסון באמצעות מצב IR + OCT עם שדה ראייה של 30° ועוצמת IR של 100%.
  2. כמת את עובי הקרניות באמצעות תוכנת ImageJ.
  3. למדידת העובי, השתמשו בכלי בחירת קו בתוכנת ImageJ ליצירת קו ישר בין המשטחים הקדמיים והאחוריים במרכז הקרנית.
  4. לחץ על Analyze > Measure בכלי התוכנה כדי להעביר את הערכים לחלון הנתונים.
  5. העתק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני, והשווה סטטיסטית את עובי הקרנית בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות באמצעות מבחן t של סטודנט.
    הערה: עובי הקרנית הוא המרחק מנקודה על פני הקרנית הקדמית לנקודה הקרובה ביותר על פני הקרנית האחורית במרכז הקרנית.

7. צביעת חיסון עבור CoNV על קרניות שטוחות

  1. הרדימו את העכברים ביום ה-10 לאחר הכוויה האלקלית, ולחנך את העיניים על ידי דיסקציה קהה.
  2. פרקו את העפעפיים בעזרת האגודל והאצבע המורה, והניחו מלקחיים מתחת לגלובוס העין. סגור את המלקחיים, ומשוך בעדינות את גלגל העין מהמסלול.
  3. מניחים את גלגלי העיניים ב-1x PBS. עבור כל גלגל עין, להסיר את הקרנית מגלובוס העין על ידי ביצוע חתך תחילה באמצעות מחט 30 G מתחת לאזור הלימבוס.
  4. חותכים סביב אזור הלימבוס באמצעות מספריים מיקרו של הקרנית, עם החתך כנקודת ההתחלה, ומפרידים לאט לאט את הקרנית והלימבוס מהגלובוס.
  5. נקו את הקרניות בעדינות בעזרת מברשת צבע עדינה להסרת הקשתית. תקן את הקרניות ב 4% paraformaldehyde במשך 1 שעות.
  6. שטפו את הקרניות שלוש פעמים במשך 20 דקות כל אחת ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT).
  7. יש לדגור במאגר חוסם (1x PBS בתוספת 0.1% Triton-X 100 ו-5% אלבומין בסרום בקר [BSA]) למשך שעה אחת ב-RT.
  8. מעבירים את הקרניות לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים ראשוניים. הכינו את תמיסת הנוגדנים ב-1x PBS בתוספת 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-conjugated anti-CD31 mAb (1:100) ו-Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb (1:100).
  9. לדגור במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F). לשטוף את הקרניות ב 1x PBS שלוש פעמים במשך 20 דקות כל אחד.
  10. הכתימו את הגרעינים באמצעות תמיסת כתמים Hoechst (1:1,000) למשך 5 דקות בחושך.
  11. משטחים את הקרניות בחתכים רדיאליים, ומרכיבים אותן על מגלשת זכוכית מנוקה מראש באמצעות אמצעי הרכבה וכיסויים. אטמו את הכיסויים בלק שקוף, וייבשו את המגלשות למשך הלילה בחושך לפני הניתוח במיקרוסקופ קונפוקלי.
  12. דמיינו את הקרניות השטוחות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי על ידי תפירת תמונות בודדות של ערימת Z; השתמש בלייזר אובייקטיבי של 10x, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, ורזולוציה של 512 פיקסלים x 512 פיקסלים לפרוסה בסורקי Galvano שאינם בעלי תהודה.
  13. כמת את צפיפות כלי הדם CD31+ וכלי הלימפה LYVE-1+ באמצעות תוכנת ImageJ.
  14. לקביעת צפיפות כלי הדם, המירו את התמונות הקונפוקליות לתמונה של 8 סיביות.
  15. בחר צפיפות כלי דם מהתוספים.
  16. בחר את אזור העניין בתמונה ולחץ על אישור. המדידות ייפתחו בחלון נתונים חדש.
  17. העתק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני, והשווה סטטיסטית את צפיפות כלי הדם בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות באמצעות מבחן t של סטודנט.
    הערה: CD31, המכונה גם מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1 (PECAM-1), היא מולקולת היצמדות תאים המעורבת באנגיוגנזה ומתבטאת מאוד בתאי אנדותל של כלי דם מוקדמים ובשלים13. LYVE-1 (Lymphatic vessel endothelial hyaluthelial hyaluronan receptor-1) הוא סמן פני התא על תאי אנדותל לימפטיים ויכול לשמש כסמן לימפנגיוגנזה14.

Representative Results

מחקר זה מתאר שיטה לגרימת אנגיוגנזה בקרנית בעין העכבר על ידי כוויה אלקלית. התמונות שהתקבלו במיקרוסקופ דיסקציה (איור 1A,B) הדגימו ציוני ניאו-וסקולריזציה ואטימות גבוהים משמעותית בקרניות בקבוצת הכוויות האלקליות (P <-0.05; איור 1C,D). הקרניות שנאספו ביום ה-10 עברו חיסון נוסף עם anti-CD31 mAb עבור כלי דם ו-anti-LYVE-1 mAb עבור כלי לימפה, בהתאמה (איור 2A-I). קבוצת הכוויות האלקליות הראתה צפיפות גבוהה משמעותית של כלי דם ולימפה לאחר 10 ימים (P < 0.001 ו- P < 0.05, בהתאמה; איור 2J,K). עובי הקרנית, כפי שצולם וכומת באמצעות OCT (איור 3A,B), נצפה גבוה משמעותית בקבוצה עם כוויה אלקלית (P < 0.01; איור 3C).

Figure 1
איור 1: ניאו-וסקולריזציה ואטימות של הקרנית כתוצאה מכוויה אלקלית. (א,ב) הניאו-וסקולריזציה של הקרנית נבטה מכלי הלימבוס לכיוון מרכז הקרנית בעין העכבר (B) שנכוותה אלקלית (A) אך לא בעין בריאה 10 ימים לאחר הפציעה. (ג,ד) כימות של (C) ניאו-וסקולריזציה של הקרנית ו-(D) אטימות בלוחות A ו-B (± SEM; t-test; *P < 0.05; n = 3 עיניים, עין אחת / עכבר). החצים האדומים מייצגים את הלימבוס, והחץ הצהוב מציין את הכלים החדשים הנובטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניאו-וסקולריזציה של הקרנית ולימפנגיוגנזה הנגרמת על-ידי כוויה אלקלית. אימונוהיסטוכימיה חשפה (A,D,G) דם וכלי לימפה (B,E,H) באמצעות anti-CD31 ו- anti-LYVE-1 mAbs, בהתאמה. (א-ג) קרנית העכבר הבריאה. (ד-י) הקרנית שנכוותה אלקלית 10 ימים לאחר הפציעה. (ג,ו,ט) על גבי תמונות של אותות CD31 ו-LYVE-1. (ז-י) תמונות מוגדלות לחלוניות D-F. פסי קנה מידה = (A-F) 200 מיקרומטר ו- (G-I) 500 מיקרומטר. (J,K) כימות צפיפות הדם וכלי הלימפה בלוחות A-F, כפי שמצוין (± SEM; t-test; *P < 0.05; ***P < 0.001; n = 3 עיניים, עין אחת / עכבר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עלייה בעובי הקרנית הנגרמת על-ידי כוויה אלקלית . (A) תמונת OCT של עין עכבר בריאה. (B) תמונת OCT של קרנית העכבר 10 ימים לאחר הכוויה האלקלית. (C) כימות עובי הקרנית בלוחות A ו-B, כפי שנמדד במרכז הקרנית (± SEM; t-test; **P < 0.01; n = 3 עיניים, עין אחת / עכבר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הקרנית היא רקמה מצוינת לחקר אנגיוגנזה ודלקת מכיוון שהיא נגישה ואווסקולרית, כלומר ניתן לזהות ולתעד ניאו-וסקולריזציה בצורה נוחה. כוויות בקרנית בארנבות, חולדות ועכברים שימשו לחקר אנגיוגנזה של הקרנית, דלקת ואטימות, כיב, ניקוב הקרנית ופיברוזיס15,16,17. יתר על כן, מודל העכבר של כוויות הקרנית הוא בעל ערך לבדיקת אסטרטגיות טיפוליות שונות עבור אנגיוגנזה ודלקת מכיוון שלעכברים יש מערכת חיסונית הקשורה קשר הדוק לזו של בני אדם18. הזמינות של טכניקות למניפולציה גנטית של גנום העכבר גם עושה את המין בחירה מצוינת עבור סוג זה של מחקר19. האתגר במחקר זה היה לפתח שיטה לצריבת קרנית המספקת פתופיזיולוגיה עקבית וניתנת לשחזור.

מודל הכוויה האלקלית שימושי במיוחד לסינון תרופתי של תרופות המווסתות אנגיוגנזה, דלקת ופיברוזיס. הדרישות המינימליות לריאגנטים ומשאבים, הפשטות של ביצוע הכוויה האלקלית והיתרונות של משך הזמן הקצר של הפרוטוקול והתצפית הישירה על התוצאות הופכים את הצריבה האלקלית בקרנית העכבר לבחירה העיקרית לבדיקת תרופות פרמקולוגיות. עם זאת, יש לשקול מספר אמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה כדי להבטיח עקביות ויכולת שחזור. ראשית, יש למקם את נייר הסינון במרכז הקרנית כדי למנוע צריבה באזורים אחרים של העין, במיוחד הלימבוס, העפעפיים והלחמית; שנית, נפח וריכוז NaOH צריך להיות מתאים כדי לקבל תוצאות עקביות מן הכוויה אלקלית על הקרנית. אסור שהמסנן יטפטף רטוב אלא היה צריך להיות ספוג בתמיסת NaOH. גודל המסנן וסוג המסנן והנורמליות והנפח של התמיסה המשמשת בשיטה זו ממוטבים כדי למנוע הצפה של NaOH. שימוש בנייר סינון בגודל שונה או נפח גבוה או נמוך יותר של NaOH יגרום לחוסר עקביות בניאו-וסקולריזציה. שלישית, חשוב למנוע מתמיסת NaOH לספוגCO2 באוויר החדר על ידי הידוק מיידי של מכסה הצינור של התמיסה לאחר השימוש והפחתת יחס האוויר/תמיסה. יש להקפיד להשתמש בתמיסות אלקליות טריות כדי למנוע חוסר עקביות ב neovascularization וכדי למנוע כיב הקרנית. לבסוף, יש צורך בשטיפה נרחבת של כל תמיסת NaOH מהעין והלחמית במי מלח כדי למנוע נזק נוסף לקרנית ולרקמות הסובבות את העין. שטיפה יסודית של הקרנית והרקמות הסמוכות תמנע גם היא סימבלפרון.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה יעילה ואמינה לחקר הפתופיזיולוגיה של אנגיוגנזה בקרנית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לחקר דלקת הקרנית, פיברוזיס וריפוי פצעים.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תאגיד הצדקה SRB, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) P30EY002520, ומענק מוסדי בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון (RPB) למחלקה לרפואת עיניים, מכללת ביילור לרפואה. W.L. נתמך על ידי קרן אבירי הטמפלרים לרפואת עיניים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection Hospira KL-7302
30 G Needle McKesson 16-N3005
A1R Confocal Nikon Instruments
Anti-CD31 Novus Biologicals NB100-1642R
Anti-LYVE-1 Life technologies 53-0443-82
ASM Module Heidelberg Engineering Anterior segment objective
Biopsy Punch McKesson 16-1309
BSA Thermoscientific 9048-46-8
Coverslip VWR International 22X22-1-601640G
Dissection Microscope AmScope SM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Forceps Fine Science Tools 15000-02
Forceps Fine Science Tools 11049-10
Forceps Fisherbrand 12-000-157
Forceps  Roboz RS-4905
Gonak Hypromellose  Akorn 17478006412
GraphPad Prism 9 GraphPad Sotware, Inc
Heating pad K&H Pet Products 100213018
Hoescht Life Technologies 62249
HRA + OCT Spectralis Heidelberg Engineering
Insulin Syringe Mckesson 102-SN310C31516P
Kimwipe Kimberly Clark Professional 34155
Micro Cover Glass VWR 48366-067
Microscissors Roboz RS-5110
Microscopic Slide Fisherbrand 12-550-15
NaOH Sigma Aldrich 55881-500G
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone  Bausch & Lomb 24208-0795-35
Normal Serum Jackson Immuno 008-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127-500G
PBS Gibco 20012-027
Proparacaine HCl Bausch & Lomb 24208073006
Saline Henry Schein 1531042
SMZ125 Nikon Instruments
Syringe 10 mL McKesson 16-S10C
Triton X-100 Sigma Aldrich TX1568-1
Whatmann Filter Paper Cytiva WHA1003323

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellenberg, D., et al. Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).
  2. Azar, D. T. Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).
  3. Rolfsen, M. L., et al. Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies. Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).
  4. Skobe, M., Dana, R. Blocking the path of lymphatic vessels. Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).
  5. Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. Ocular neovascularization: An epidemiologic review. Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).
  6. Su, W., et al. Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).
  7. Lasagni Vitar, R. M., et al. Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study. Frontiers in Medicine. 8, 733538 (2021).
  8. Said, D. G., Dua, H. S. Chemical burns acid or alkali, what's the difference. Eye. 34, 1299-1300 (2020).
  9. Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).
  10. Kenyon, B. M., et al. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).
  11. Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation. Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).
  12. Yoeruek, E., et al. penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  13. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  14. Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  15. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  16. Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound. Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).
  17. Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. Corneal neovascularization. Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).
  18. Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity. Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021 (2019).
  19. vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism. Genome Biology. 12 (6), 224 (2011).

Tags

מודל עכבר neovascularization הקרנית כוויה אלקלית אנגיוגנזה תמיסת נתרן הידרוקסיד פתולוגיה שחזור כלי דם שקיפות נגישות בדיקה ישירה מיקרוסקופ נתיחה immunostaining CD31 MAb LYVE-1 MAb בצקת הקרנית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) בדיקות neovascularization אסטרטגיות טיפול
מודל עכבר לניאו-וסקולריזציה של הקרנית על ידי כוויה אלקלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ammassam Veettil, R., Li, W.,… More

Ammassam Veettil, R., Li, W., Pflugfelder, S. C., Koch, D. D. A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn. J. Vis. Exp. (196), e65289, doi:10.3791/65289 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter