Summary
이 프로토콜은 마우스의 알칼리 화상 유발 각막 신생혈관화에 중점을 둡니다. 이 방법은 병리학적 혈관신생 및 관련 분자 메커니즘을 연구하고 각막 신생혈관을 예방하기 위한 새로운 약리학적 제제를 테스트하기 위해 재현 가능하고 제어 가능한 각막 질환 모델을 생성합니다.
Abstract
혈관신생의 병리학적 형태인 각막 신생(CoNV)은 혈액과 림프관이 변두리에서 혈관성 각막으로 성장하는 것을 포함하며 투명도와 시력에 악영향을 미칩니다. 알칼리 화상은 CoNV를 유발하는 가장 흔한 형태의 안구 외상 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 CoNV는 재현성을 보장하기 위해 제어된 방식으로 수산화나트륨 용액을 사용하여 실험적으로 유도됩니다. 알칼리 연소 모델은 CoNV의 병리학을 이해하는 데 유용하며 각막의 무혈성, 투명성 및 접근성으로 인해 일반적으로 혈관신생을 연구하도록 확장할 수 있습니다. 이 연구에서 CoNV는 해부 현미경으로 직접 검사하고 항-CD31 mAb를 사용하여 평판 각막을 면역염색하여 분석했습니다. 림프관 신생은 항-LYVE-1 mAb를 사용한 면역염색을 통해 편평 장착 각막에서 검출되었습니다. 각막 부종은 광간섭단층촬영(OCT)을 사용하여 시각화하고 정량화했습니다. 요약하면, 이 모델은 기존 신생혈관 분석을 발전시키고 병리학적 안구 및 외안구 혈관신생에 대한 새로운 치료 전략을 발견하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
각막은 혈관 생성 특권 1,2을 설정하여 투명성을 유지하는 무혈 조직입니다. 각막이 손상되면 염증이 생기고 혈액과 림프관이 생기며 섬유증이 생길 수 있다3. 각막 신생혈관 형성술(CoNV)은 시각 장애를 유발하며 전 세계적으로 실명의 두 번째 주요 원인입니다4. CoNV는 미국에서 매년 약 140만 명에게 영향을 미칩니다5. CoNV는 화학적 화상, 감염, 염증 및 저산소증을 포함한 다양한 요인에 의해 유발될 수 있습니다 3,6. 화학적 화상은 가장 흔한 안구 응급 상황 중 하나로, 안구 외상의 약 13.2%를 차지하며 즉각적인 평가와 치료가 필요하다7. 화학적 화상은 알칼리 화상일 수도 있고 산성 화상일 수도 있지만, 알칼리 화상은 알칼리가 조직 깊숙이 침투하기 때문에 더 심각한 부상을 입힌다8.
알칼리 화상의 마우스 모델은 CoNV 및 상처 치유를 연구하는 데 널리 사용됩니다. 각막 주머니 혈관 신생 모델 9,10과 비교할 때 알칼리 화상 모델은 비교적 간단하게 만들 수 있으며 각막 염증, 섬유증 및 상피 증식을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 또한 혈관신생의 각막 봉합사 모델보다 임상적 화학적 화상과 더 밀접한 관련이 있다11. 알칼리 화상을 입으면 염증과 항혈관신생 인자와 혈관신생 유발 인자의 불균형으로 인해 혈관이 발달한다 1,2. 각막 알칼리 화상 모델의 단점은 알칼리 화상의 면적과 중증도를 제어하기 어렵고, 각막 신생혈관화의 변화, 과잉 알칼리 용액으로 인한 인접 조직의 의도하지 않은 연소입니다. 이 연구의 목적은 수산화나트륨 용액에 미리 적신 여과지를 사용하여 마우스에서 제어된 각막 알칼리 연소 모델을 설명하는 것입니다. 이 모델은 혈관 신생 인자, 항 혈관 신생 치료 시약 및 염증 및 섬유증을 조절할 수 있는 기타 인자 및 시약을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
실험 절차와 안락사를 포함한 모든 동물 실험은 베일러 의과대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 프로토콜 번호는 AN-8790입니다.
1. 1N NaOH의 제조
- 15mL 원심분리기 튜브에 4mL의 멸균 탈이온수를 추가합니다. 수산화나트륨(NaOH) 400mg의 무게를 측정하고 튜브에 조심스럽게 추가합니다.
- 유리 막대를 사용하여 용액을 천천히 저어 NaOH를 녹입니다. 튜브에 멸균 탈이온수를 추가하여 부피를 10mL로 만들고 튜브를 위아래로 부드럽게 뒤집어 다시 혼합합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 용액을 실온에 보관하십시오.
- 공기 중의 이산화탄소를 흡수하는 용액에 의해 NaOH 용액의 농도가 감소할 수 있으므로 매월 신선한 용액을 준비하십시오.
- 사용하기 전에 항상 NaOH 용액을 부드럽게 혼합하십시오.
주의 : 화학 후드 안에 용액을 준비하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액의 제조
- 유리 비커에 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 30mL를 추가합니다. 파라포름알데히드(PFA) 4g의 무게를 측정하여 비커에 넣습니다.
- 비커를 60°C의 열판에 놓고 저어줍니다. 1N NaOH 용액을 적가하여 용액이 맑아질 때까지 pH를 높입니다.
- 7.4N 염산(HCl)을 사용하여 pH를 확인하고 1로 조정합니다. 1x PBS를 사용하여 최종 용량을 50mL로 조정합니다.
- 용액을 식히고 여과하십시오. 용액을 4°C에서 보관합니다.
주의 : 적절한 PPE를 착용한 상태에서 흄 후드에 용액을 준비하십시오.
3. 케타민/자일라진 칵테일 준비
- 식염수 9.4mL에 케타민 0.8mL(원액 농도: 100mg/mL)와 자일라진 0.16mL(원액 농도: 100mg/mL)를 첨가하여 케타민/자일라진 칵테일을 준비합니다.
- 칵테일을 멸균 주입 병에 담아 실온(RT)에 보관합니다.
4. 쥐 각막에 알칼리 화상
- 통증 완화를 위해 시술 30분 전에 멜록시캠(체중 4-6mg/kg)을 피하 주사합니다. 케타민/자일라진 칵테일(케타민 80mg/kg 및 자일라진 16mg/kg)의 i.p. 주사를 사용하여 마우스(C57BL/6J, 생후 6-8주, 수컷)를 마취합니다.
- 마우스의 발가락을 꼬집어 반사 반응(페달 철수)을 확인하고 반사가 없는지 확인합니다. 한쪽 눈의 각막 표면에 국소 마취제인 0.5% 프로파라카인을 한 방울 떨어뜨리고 다른 쪽 눈에는 인공 눈물 한 방울을 바릅니다.
- 2mm 생검 펀치를 사용하여 Whatman 여과지 디스크를 펀칭합니다.
- 깨끗한 페트리 접시에 2μL의 1N NaOH를 추가합니다. 2mm 여과지 디스크를 1N NaOH 방울에 놓고 15초 동안 담가둡니다.
- 집게로 여과지를 집어 들고 각막 중앙의 프로파라카인 처리된 눈에 30초 동안 여과지를 바릅니다.
알림: 여과지는 각막의 중앙에만 닿아야 하며, 여과지를 움직이면 인접 조직에 화상을 입을 수 있으므로 일단 놓은 여과지가 움직이지 않도록 주의해야 합니다. - 멸균 주사기에 멸균 식염수 20mL로 씻어내어 눈을 씻습니다.
알림: 각막이나 주변 조직이 더 이상 손상되지 않도록 결막낭과 함께 각막을 철저히 씻어야 합니다. 결막낭을 씻으면 결막낭을 더 예방할 수 있습니다. - 일회용 물티슈를 사용하여 눈과 주변 부위의 과도한 식염수를 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 보행이 가능할 때까지 따뜻한 가열 패드의 회복 케이지에 쥐를 보관하십시오.
알림: 마우스는 알칼리 연소 후 3일 동안 매일 모니터링됩니다. 통증이나 스트레스 증상이 관찰되면 멜록시캠(체중 4-6mg/kg)을 피하 투여합니다.
5. 신생혈관 형성 및 불투명도의 검사 및 평가
- 마취된 마우스의 경우 화상 후 10일째에 해부 현미경으로 눈을 검사하고 해부 스코프에 부착된 카메라를 사용하여 이미지를 획득하여 불투명도 및 신생혈관 형성을 채점합니다.
알림: 카메라가 부착된 일반 해부 스코프로 충분합니다. - 박리 현미경을 통해 각막을 관찰하면서 다음 척도12를 기준으로 화상 후 불투명도를 채점합니다.
0 = 불투명도 없음; 투명 각막
1 = 약한 불투명도; 홍채와 동공 부위에 약간의 흐릿함이 있음; 홍채와 동공을 쉽게 볼 수 있습니다.
2 = 보통 불투명도; 홍채와 눈동자가 거의 보이지 않음
3 = 심한 불투명도; 홍채 또는 동공이 보이지 않음
4 = 불투명 각막; 홍채와 동공이 보이지 않음 - 해부 현미경을 통해 각막을 관찰하면서 다음 척도12를 기준으로 CoNV를 채점합니다.
0 = 신생혈관 형성 없음; 림버스에서 새로운 선박이 없습니다.
1 = 경미한 신생혈관 형성; 림버스(Limbus)에서 출발하는 새로운 선박
2 = 중등도의 신생혈관 형성; 혈관은 림버스(limbus)에서 시작되어 각막의 중앙을 향해 자랍니다
3 = 심한 신생혈관 형성; 림버스(limbus)에서 시작되어 각막의 중심에 도달하거나 교차하는 혈관 - 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상과 건강한 안구 간의 불투명도 및 신생혈관 형성 점수를 통계적으로 비교합니다.
- 호흡이 멈춘 후 1분까지 1%의 이소플루란에 노출된 후 자궁경부 탈구가 뒤따를 때까지 10일째에 쥐를 안락사시키고 평탄한 마운트 이미징을 위해 각막을 채취합니다.
6. 광간섭 단층촬영(OCT) 영상
- 화상 후 10일째에 마취된 쥐에서 눈의 앞쪽 부분의 OCT 이미지를 촬영합니다. 30° 시야각과 100% IR 강도의 IR + OCT 모드를 사용하여 볼륨 스캔으로 OCT 이미지 획득을 수행합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각막의 두께를 정량화합니다.
- 두께를 측정하려면 ImageJ 소프트웨어의 선 선택 도구를 사용하여 중앙 각막의 전방 표면과 후방 표면 사이에 직선을 만듭니다.
- 소프트웨어 도구에서 Analyze > Measure 를 클릭하여 값을 데이터 창으로 전송합니다.
- 값을 스프레드시트 파일에 복사하고 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상과 건강한 안구 그룹 간의 각막 두께를 통계적으로 비교합니다.
참고: 각막의 두께는 전방 각막 표면의 한 지점에서 각막 중심의 후방 각막 표면에서 가장 가까운 지점까지의 거리입니다.
7. 편평한 거치형 각막의 CoNV에 대한 면역염색
- 알칼리 화상 후 10일째에 쥐를 안락사시키고 둔기 해부로 눈을 적출시킵니다.
- 엄지와 검지를 사용하여 눈꺼풀을 벌리고 눈 구슬 아래에 집게를 놓습니다. 집게를 닫고 안구를 안와에서 부드럽게 잡아당깁니다.
- 안구를 1x PBS에 배치합니다. 각 안구에 대해 먼저 연정 부위 아래 30G 바늘을 사용하여 절개하여 안구에서 각막을 제거합니다.
- 절개를 시작점으로 각막 마이크로 가위를 사용하여 변막 부위를 자르고 각막과 변두리를 구체에서 천천히 분리합니다.
- 가는 붓을 사용하여 각막을 부드럽게 청소하여 홍채를 제거합니다. 각막을 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정합니다.
- 실온(RT)에서 1x PBS에서 각각 20분 동안 각막을 세 번 세척합니다.
- 차단 완충액(0.1% Triton-X 100 및 5% 소 혈청 알부민[BSA]이 보충된 PBS 1개)에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 각막을 1차 항체가 포함된 항체 용액으로 옮깁니다. 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-conjugated anti-CD31 mAb(1:100) 및 Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb(1:100)가 보충된 1x PBS에서 항체 용액을 준비합니다.
- 4 °C에서 3일 동안 배양합니다. 각막을 1x PBS에서 각각 20분 동안 세 번 세척합니다.
- 어둠 속에서 Hoechst 염색 용액(1:1,000)을 사용하여 5분 동안 핵을 염색합니다.
- 방사형 절단으로 각막을 평평하게 하고 장착 매체와 커버슬립을 사용하여 미리 청소된 유리 슬라이드에 장착합니다. 투명한 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하고 컨포칼 현미경으로 분석하기 전에 어두운 곳에서 슬라이드를 밤새 건조시킵니다.
- 개별 Z 스택 이미지를 스티칭하여 컨포칼 현미경을 사용하여 편평하게 장착된 각막을 이미지화합니다. 10x 대물렌즈, 488nm 및 561nm 레이저, 슬라이스당 512픽셀 x 512픽셀의 해상도를 비공진 Galvano 스캐너에서 사용할 수 있습니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 CD31+ 혈액 및 LYVE-1+ 림프관의 밀도를 정량화합니다.
- 혈관 밀도를 확인하려면 컨포칼 영상을 8비트 영상으로 변환하십시오.
- 플러그인(Plugins) 에서 혈관 밀도(Vascular Density) 를 선택합니다.
- 이미지에서 관심 영역을 선택하고 확인을 클릭합니다. 측정값이 새 데이터 창에서 열립니다.
- 값을 스프레드시트 파일에 복사하고 스튜던트 t-검정을 사용하여 알칼리 화상군과 건강한 안구 그룹 간의 혈관 밀도를 통계적으로 비교합니다.
참고: 혈소판 내피 세포 접착 분자-1(PECAM-1)이라고도 하는 CD31은 혈관 신생에 관여하는 세포 접착 분자이며 초기 및 성숙 혈관의 내피 세포에서 많이 발현됩니다13. LYVE-1(림프관 내피 히알루로난 수용체-1)은 림프관 내피 세포의 세포 표면 마커이며 림프관 형성 마커로 사용할 수 있다14.
Representative Results
본 연구는 알칼리 화상에 의해 쥐 눈의 각막 혈관신생을 유도하는 방법을 설명한다. 해부 현미경으로 얻은 이미지(그림 1A,B)는 알칼리 화상 그룹의 각막에서 상당히 높은 혈관 형성 및 불투명도 점수를 보여주었습니다(P < 0.05; 그림 1C,D). 10일째에 채취한 각막은 각각 혈관에 대한 항-CD31 mAb와 림프관에 대한 항-LYVE-1 mAb로 추가로 면역염색되었습니다(그림 2A-I). 알칼리 연소군은 10일 후 혈액 및 림프관의 밀도가 유의하게 높아진 것으로 나타났다(각각 P < 0.001 및 P < 0.05; 그림 2J,K). OCT를 사용하여 이미지화하고 정량화한 각막의 두께(그림 3A,B)는 알칼리 연소가 있는 그룹에서 유의하게 더 높은 것으로 관찰되었습니다(P < 0.01; 그림 3C).
그림 1: 알칼리 화상으로 인한 각막 신생혈관 형성 및 불투명도. (ᅡ,ᄂ) 각막 신생혈관 형성은 (B) 알칼리 화상을 입은 쥐 눈(A)의 각막 중심을 향해 변막 혈관에서 싹을 틔웠지만 손상 후 10일 동안 건강한 눈은 아니었습니다. (씨,디) 패널 A 및 B에서 (C) 각막 신생혈관 형성 및 (D) 불투명도의 정량화(± SEM; t-검정; *P < 0.05; n = 3개의 눈, 1개의 눈/마우스). 빨간색 화살표는 림버스(limbus)를 나타내고 노란색 화살표는 싹이 트는 새 용기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 알칼리 화상으로 인한 각막 신생혈관 형성 및 림프관 신생. 면역조직화학은 각각 항-CD31 및 항-LYVE-1 mAb를 사용하여 (A,D,G) 혈액 및 (B,E,H) 림프관을 밝혔습니다. (A-C) 건강한 쥐 각막. (디-아이) 부상 후 10일 동안 알칼리로 연소된 각막. (씨, 에프, 나) CD31 및 LYVE-1 신호의 중첩 이미지. (지-I) 패널 D-F의 확대 이미지. 스케일 바 = (AF) 200 μm 및 (G-I) 500 μm. (J,K) 표시된 패널 A-F의 혈액 및 림프관 밀도 정량화(± SEM; t-검정; *P < 0.05; ***P < 0.001; n = 눈 3개, 눈/마우스 1개). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 알칼리 화상으로 인한 각막 두께 증가 . (A) 건강한 쥐 눈의 OCT 이미지. (B) 알칼리 화상 후 10일 후의 쥐 각막의 OCT 이미지. (C) 각막 중앙에서 측정한 패널 A 및 B의 각막 두께 정량화(± SEM; t-검정; **P < 0.01; n = 3개의 눈, 1개의 눈/마우스). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
각막은 혈관신생과 염증을 연구하는 데 탁월한 조직인데, 이는 혈관신생과 염증이 관찰되기 쉽기 때문이며, 이는 신생혈관 형성을 편리하게 감지하고 문서화할 수 있다는 것을 의미합니다. 토끼, 쥐 및 생쥐의 각막 화상은 각막 혈관 신생, 염증 및 불투명, 궤양, 각막 천공 및 섬유증을 연구하는 데 사용되었습니다15,16,17. 더욱이, 각막 화상의 마우스 모델은 혈관신생 및 염증에 대한 다양한 치료 전략을 테스트하는 데 유용한데, 이는 마우스가 인간과 밀접한 관련이 있는 면역 체계를 가지고 있기 때문이다18. 쥐 게놈을 유전적으로 조작하는 기술의 가용성은 또한 종을 이러한 유형의 연구에 탁월한 선택으로 만든다19. 이 연구의 과제는 일관되고 재현 가능한 병태생리학을 제공하는 각막 연소 방법을 개발하는 것이었습니다.
알칼리 연소 모델은 혈관신생, 염증 및 섬유증을 조절하는 약물의 약리학적 스크리닝에 특히 유용합니다. 시약 및 자원에 대한 최소 요구 사항, 알칼리 연소 수행의 단순성, 프로토콜의 짧은 기간 및 결과의 직접 관찰의 이점으로 인해 마우스 각막의 알칼리 연소는 약리학적 약물 스크리닝을 위한 주요 선택입니다. 그러나 일관성과 재현성을 보장하기 위해 이 절차를 수행할 때 몇 가지 예방 조치를 고려해야 합니다. 첫째, 여과지는 눈의 다른 부위, 특히 변연, 눈꺼풀 및 결막에 화상을 입지 않도록 각막 중앙에 놓아야 합니다. 둘째, NaOH의 부피와 농도는 각막의 알칼리 화상으로부터 일관된 결과를 얻기에 적절해야 합니다. 필터는 젖지 않아야 하지만 NaOH 용액에 담가야 합니다. 이 방법에 사용된 용액의 필터 크기 및 필터 유형, 정규성 및 부피는 NaOH의 오버플로를 방지하도록 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 여과지를 사용하거나 더 높거나 더 적은 양의 NaOH를 사용하면 신생혈관 형성에 불일치가 발생할 수 있습니다. 셋째, 사용 후 용액의 튜브 캡을 즉시 조이고 공기/용액 비율을 줄여 NaOH 용액이 실내 공기에서CO2 를 흡수하는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 신생혈관 형성의 불일치를 방지하고 각막 궤양을 피하기 위해 신선한 알칼리 용액을 사용하는 데 주의를 기울여야 합니다. 마지막으로, 눈과 결막에서 나오는 모든 NaOH 용액을 식염수로 광범위하게 씻어내야 각막과 눈 주변 조직의 추가 손상을 방지할 수 있습니다. 각막과 인접 조직을 철저히 씻는 것도 심블파론을 예방할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 각막 혈관신생의 병태생리학을 연구하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 프로토콜은 각막 염증, 섬유증 및 상처 치유를 연구하는 데 추가로 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 SRB 자선 법인, NIH(National Institutes of Health) P30EY002520 및 실명 예방 연구(RPB)에서 Baylor College of Medicine의 안과에 대한 무제한 기관 보조금의 지원을 받았습니다. WL은 Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
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