यह प्रोटोकॉल चूहों में क्षार जलने से प्रेरित कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन पर केंद्रित है। विधि पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस और संबंधित आणविक तंत्र का अध्ययन करने और कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन को रोकने के लिए नए औषधीय एजेंटों का परीक्षण करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और नियंत्रणीय कॉर्नियल रोग मॉडल उत्पन्न करती है।
कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीओएनवी), एंजियोजेनेसिस का एक पैथोलॉजिकल रूप, लिम्बस से एवैस्कुलर कॉर्निया में रक्त और लिम्फ वाहिकाओं की वृद्धि को शामिल करता है और पारदर्शिता और दृष्टि पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है। क्षार जलन ओकुलर आघात के सबसे आम रूपों में से एक है जो सीओएनवी की ओर जाता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित तरीके से सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान का उपयोग करके CoNV को प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित किया जाता है। क्षार बर्न मॉडल CoNV की विकृति को समझने के लिए उपयोगी है और कॉर्निया की संवहनी, पारदर्शिता और पहुंच के कारण सामान्य रूप से एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस काम में, CoNV का विश्लेषण एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्यक्ष परीक्षा द्वारा और एंटी-सीडी 31 एमएबी का उपयोग करके फ्लैट-माउंट कॉर्निया को इम्यूनोस्टेनिंग करके किया गया था। एंटी-एलवाईवीई -1 एमएबी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा फ्लैट-माउंट कॉर्निया पर लिम्फोजियोजेनेसिस का पता लगाया गया था। कॉर्नियल एडिमा को ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) का उपयोग करके कल्पना और मात्रा निर्धारित की गई थी। सारांश में, यह मॉडल मौजूदा नियोवैस्कुलराइजेशन परख को आगे बढ़ाने और पैथोलॉजिकल ओकुलर और एक्स्ट्राओकुलर एंजियोजेनेसिस के लिए नई उपचार रणनीतियों की खोज करने में मदद करेगा।
कॉर्निया एक एवास्कुलर ऊतक है जो एंजियोजेनिक विशेषाधिकार 1,2 स्थापित करके अपनी पारदर्शिता बनाए रखता है। कॉर्निया को नुकसान के परिणामस्वरूप सूजन और रक्त और लिम्फ वाहिकाओं का विकास हो सकता है, साथ ही फाइब्रोसिस3 भी हो सकता है। कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन (CoNV) दृश्य हानि की ओर जाता हैऔर दुनिया भर में अंधापन का दूसरा प्रमुख कारण है। CoNVप्रति वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 1.4 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। CoNV को रासायनिक जलन, संक्रमण, सूजन और हाइपोक्सिया 3,6 सहित विभिन्न कारकों से प्रेरित किया जा सकता है। रासायनिक जलन सबसे आम ओकुलर आपात स्थितियों में से एक है, और वे ओकुलर आघात के लगभग 13.2% के लिए जिम्मेदार हैं और तत्काल मूल्यांकन और उपचार की आवश्यकता होतीहै। रासायनिक जलन क्षार या एसिड जलने हो सकती है, लेकिन क्षार जलने से अधिक गंभीर चोट लगती है, क्योंकि क्षार ऊतक8 में गहराई से प्रवेश करता है।
क्षार जलने के माउस मॉडल व्यापक रूप से CoNV और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कॉर्नियल पॉकेट एंजियोजेनेसिस मॉडल 9,10 की तुलना में, क्षार बर्न मॉडल बनाने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं और इसका उपयोग कॉर्नियल सूजन, फाइब्रोसिस और उपकला प्रसार का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। ये मॉडल एंजियोजेनेसिस11 के कॉर्नियल सीवन मॉडल की तुलना में नैदानिक रासायनिक जलन से अधिक निकटता से संबंधित हैं। क्षार जलने के साथ, अन्यथा एवैस्कुलर कॉर्निया सूजन और एंटी-एंजियोजेनिकऔर प्रो-एंजियोजेनिक कारकों में असंतुलन के कारण रक्त वाहिकाओं को विकसित करता है। कॉर्नियल क्षार बर्न मॉडल की कमियां क्षार जलने के क्षेत्र और गंभीरता को नियंत्रित करने में कठिनाइयां, कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन में भिन्नता और अतिरिक्त क्षार समाधान के कारण आसन्न ऊतकों का अनजाने में जलना है। इस अध्ययन का उद्देश्य सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में पहले से भिगोए गए फिल्टर पेपर का उपयोग करके चूहों में एक नियंत्रित कॉर्नियल क्षार बर्न मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल का उपयोग एंजियोजेनिक कारकों, एंटी-एंजियोजेनिक चिकित्सीय अभिकर्मकों, और अन्य कारकों और अभिकर्मकों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो सूजन और फाइब्रोसिस को संशोधित कर सकते हैं।
कॉर्निया एंजियोजेनेसिस और सूजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट ऊतक है क्योंकि यह सुलभ और संवहनी है, जिसका अर्थ है कि नियोवैस्कुलराइजेशन को आसानी से पता लगाया जा सकता है और प्रलेखित किया जा सकता है। खरगोशों, चूहों और चूहों में कॉर्नियल बर्न का उपयोग कॉर्नियल एंजियोजेनेसिस, सूजन और अस्पष्टता, अल्सर, कॉर्निया के छिद्र और फाइब्रोसिस15,16,17 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, कॉर्नियल बर्न का माउस मॉडल एंजियोजेनेसिस और सूजन के लिए विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए मूल्यवान है क्योंकि चूहों में एक प्रतिरक्षा प्रणाली हैजो मनुष्यों से निकटता से संबंधित है। माउस जीनोम में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए तकनीकों की उपलब्धता भी प्रजातियों को इस प्रकारके अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाती है। इस शोध में चुनौती कॉर्नियल बर्न की एक विधि विकसित करना है जो सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पैथोफिज़ियोलॉजी प्रदान करता है।
क्षार बर्न मॉडल दवाओं की औषधीय स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो एंजियोजेनेसिस, सूजन और फाइब्रोसिस को नियंत्रित करता है। अभिकर्मकों और संसाधनों के लिए न्यूनतम आवश्यकताएं, क्षार जलने की सादगी, और प्रोटोकॉल की छोटी अवधि के लाभ और परिणामों का प्रत्यक्ष अवलोकन माउस कॉर्निया पर क्षार जलने को औषधीय दवा स्क्रीनिंग के लिए एक प्राथमिक विकल्प बनाता है। हालांकि, स्थिरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को करते समय कुछ सावधानियों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, फिल्टर पेपर को आंख के अन्य क्षेत्रों, विशेष रूप से लिम्बस, पलकें और नेत्रश्लेष्मला को जलाने से बचने के लिए कॉर्निया के केंद्र में रखा जाना चाहिए; दूसरे, कॉर्निया पर क्षार जलने से लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए एनएओएच की मात्रा और एकाग्रता उपयुक्त होनी चाहिए। फिल्टर गीला नहीं टपकना चाहिए, लेकिन एनएओएच समाधान में भिगोया जाना चाहिए था। फ़िल्टर आकार और फ़िल्टर प्रकार और इस विधि में उपयोग किए जाने वाले समाधान की सामान्यता और मात्रा को NaOH के अतिप्रवाह से बचने के लिए अनुकूलित किया जाता है। एक अलग आकार के फिल्टर पेपर या एनएओएच की उच्च या कम मात्रा का उपयोग करने से नियोवैस्कुलराइजेशन में विसंगतियां पैदा होंगी। तीसरा, उपयोग के बाद समाधान के ट्यूब कैप को तुरंत कसकर और हवा / समाधान अनुपात को कम करके कमरे की हवा में सीओ2 को अवशोषित करने से एनएओएच समाधान को रोकना महत्वपूर्ण है। नियोवैस्कुलराइजेशन में विसंगतियों को रोकने और कॉर्नियल अल्सरेशन से बचने के लिए ताजा क्षार समाधान का उपयोग करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। अंत में, कॉर्निया और आंख के आसपास के ऊतकों को और नुकसान को रोकने के लिए आंख से सभी एनएओएच समाधान और नमकीन के साथ नेत्रश्लेष्मला की व्यापक धुलाई आवश्यक है। कॉर्निया और आसन्न ऊतकों की पूरी तरह से धोने से सिम्बलेफेरॉन को भी रोका जा सकेगा।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल कॉर्नियल एंजियोजेनेसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय तरीका है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आगे कॉर्नियल सूजन, फाइब्रोसिस और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एसआरबी चैरिटेबल कॉर्पोरेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) P30EY002520 द्वारा समर्थित किया गया था, और नेत्र विज्ञान विभाग, बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन को अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान (आरपीबी) से एक अप्रतिबंधित संस्थागत अनुदान दिया गया था। डब्ल्यूएल को नेत्र विज्ञान में नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन एंडोमेंट द्वारा समर्थित किया गया है।
0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
Forceps | Roboz | RS-4905 | |
Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
PBS | Gibco | 20012-027 | |
Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
Saline | Henry Schein | 1531042 | |
SMZ125 | Nikon Instruments | ||
Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |