Detta protokoll fokuserar på alkalibrännskadeinducerad hornhinneneovaskularisering hos möss. Metoden genererar en reproducerbar och kontrollerbar modell för hornhinnesjukdom för att studera patologisk angiogenes och tillhörande molekylära mekanismer samt för att testa nya farmakologiska medel för att förhindra kärlnybildning i hornhinnan.
Kärlnybildning av hornhinnan (CoNV), en patologisk form av angiogenes, innebär tillväxt av blod- och lymfkärl in i den avaskulära hornhinnan från limbus och påverkar synen och synen negativt. Alkalibrännskador är en av de vanligaste formerna av okulärt trauma som leder till CoNV. I detta protokoll induceras CoNV experimentellt med användning av natriumhydroxidlösning på ett kontrollerat sätt för att säkerställa reproducerbarhet. Modellen för alkalibränning är användbar för att förstå patologin för CoNV och kan utvidgas till att studera angiogenes i allmänhet på grund av hornhinnans avaskularitet, transparens och tillgänglighet. I detta arbete analyserades CoNV genom direkt undersökning under ett dissektionsmikroskop och genom immunfärgning av flat-mount hornhinnor med anti-CD31 mAb. Lymfangiogenes detekterades på flatmonterade hornhinnor genom immunfärgning med anti-LYVE-1 mAb. Hornhinneödem visualiserades och kvantifierades med hjälp av optisk koherenstomografi (OCT). Sammanfattningsvis kommer denna modell att bidra till att främja befintliga neovaskulariseringsanalyser och upptäcka nya behandlingsstrategier för patologisk okulär och extraokulär angiogenes.
Hornhinnan är en avaskulär vävnad som bibehåller sin genomskinlighet genom att etablera ett angiogent privilegium 1,2. Skador på hornhinnan kan leda till inflammation och utveckling av blod- och lymfkärl samt fibros3. Kärlnybildning av hornhinnan (CoNV) leder till synnedsättning och är den näst vanligaste orsaken till blindhet i världen4. CoNV drabbar cirka 1,4 miljoner människor i USA varje år5. CoNV kan induceras av olika faktorer, inklusive kemiska brännskador, infektioner, inflammation och hypoxi 3,6. Kemiska brännskador är en av de vanligaste nödsituationerna i ögonen, och de står för cirka 13,2 % av ögontrauman och kräver omedelbar bedömning och behandling7. Kemiska brännskador kan vara alkaliska eller sura brännskador, men alkaliska brännskador orsakar allvarligare skador, eftersom alkali tränger djupare in i vävnaden8.
Musmodeller av alkalibrännskador används ofta för att studera CoNV och sårläkning. Jämfört med hornhinnans fickangiogenes modell 9,10 är alkalibrännmodeller relativt enkla att skapa och kan också användas för att studera hornhinneinflammation, fibros och epitelproliferation. Dessa modeller är också närmare besläktade med kliniska kemiska brännskador än hornhinnesuturmodeller för angiogenes11. Vid alkalibrännskador utvecklar den annars avaskulära hornhinnan blodkärl på grund av inflammation och en obalans i antiangiogena och proangiogena faktorer 1,2. Nackdelarna med modeller för alkalibränning av hornhinnan är svårigheterna att kontrollera området och svårighetsgraden av alkalibrännskadan, variationen i hornhinnans kärlnykastning och oavsiktlig bränning av intilliggande vävnader på grund av överskott av alkalilösning. Syftet med denna studie är att beskriva en kontrollerad modell för alkaliförbränning av hornhinnan hos möss med hjälp av filterpapper indränkt i natriumhydroxidlösning. Denna modell kan användas för att studera angiogena faktorer, antiangiogena terapeutiska reagenser och andra faktorer och reagenser som kan modulera inflammation och fibros.
Hornhinnan är en utmärkt vävnad för att studera angiogenes och inflammation eftersom den är tillgänglig och avaskulär, vilket innebär att neovaskularisering enkelt kan detekteras och dokumenteras. Hornhinnebrännskada hos kaniner, råttor och möss har använts för att studera hornhinnans angiogenes, inflammation och opacitet, sårbildning, perforering av hornhinnan och fibros15,16,17. Dessutom är musmodellen av hornhinnebrännskada värdefull för att testa olika terapeutiska strategier för angiogenes och inflammation eftersom möss har ett immunsystem som är nära besläktat med det hos människor18. Tillgången till tekniker för att genetiskt manipulera musens arvsmassa gör också arten till ett utmärkt val för denna typ av studie19. Utmaningen i denna forskning har varit att utveckla en metod för hornhinnebränna som ger konsekvent, reproducerbar patofysiologi.
Modellen med alkaliförbränning är särskilt användbar för farmakologisk screening av läkemedel som modulerar angiogenes, inflammation och fibros. De minimala kraven på reagenser och resurser, enkelheten att utföra alkalibränningen och fördelarna med protokollets korta varaktighet och den direkta observationen av resultaten gör alkalibränning på mushornhinnan till ett primärt val för farmakologisk läkemedelsscreening. Några försiktighetsåtgärder bör dock övervägas när du utför denna procedur för att säkerställa konsekvens och reproducerbarhet. För det första måste filterpapperet placeras i mitten av hornhinnan för att undvika att bränna andra delar av ögat, särskilt limbus, ögonlocken och bindhinnan; För det andra bör volymen och koncentrationen av NaOH vara lämplig för att få konsekventa resultat från alkalibränningen på hornhinnan. Filtret får inte vara droppande vått utan bör ha blötts i NaOH-lösningen. Filterstorleken och filtertypen samt normaliteten och volymen hos lösningen som används i denna metod optimeras för att undvika ett överflöd av NaOH. Användning av ett filterpapper av annan storlek eller en högre eller lägre volym NaOH skulle orsaka inkonsekvenser i neovaskulariseringen. För det tredje är det viktigt att förhindra att NaOH-lösningen absorberar CO2 i rumsluften genom att omedelbart dra åt lösningens tublock efter användning och minska luft/lösningsförhållandet. Försiktighet måste iakttas för att använda färska alkalilösningar för att förhindra inkonsekvenser i neovaskulariseringen och för att undvika sår på hornhinnan. Slutligen är det nödvändigt att tvätta bort all NaOH-lösning från ögat och bindhinnan med koksaltlösning för att förhindra ytterligare skador på hornhinnan och omgivande vävnader i ögat. Noggrann tvättning av hornhinnan och de intilliggande vävnaderna kommer också att förhindra symblepharon.
Protokollet som beskrivs här är en effektiv och tillförlitlig metod för att studera patofysiologin för hornhinneangiogenes. Detta protokoll kan vidare användas för att studera hornhinneinflammation, fibros och sårläkning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520 och ett obegränsat institutionellt bidrag från Research to Prevent Blindness (RPB) till Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine. W.L. stöds av The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.
0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
Forceps | Roboz | RS-4905 | |
Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
PBS | Gibco | 20012-027 | |
Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
Saline | Henry Schein | 1531042 | |
SMZ125 | Nikon Instruments | ||
Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |