In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie
Summary
We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.
Abstract
Twee-foton microscopie (TPM) stelt ons in staat om de afbeelding diep in de thymus en document de gebeurtenissen die belangrijk zijn voor thymocyt ontwikkeling. Het volgen van de migratie van individuen in een menigte van thymocyten, genereren we neonatale hersenschimmen, waar minder dan een procent van de thymocyten zijn afgeleid van een donor die transgeen voor een rode draad te drukken fluorescerend eiwit. Voor het genereren van deze gedeeltelijke hematopoëtische hersenschimmen, zijn neonatale ontvangers geïnjecteerd met beenmerg tussen de 3-7 dagen oud zijn. Na 4-6 weken, wordt de muis gedood en de thymus wordt zorgvuldig ontleed en bissected het behoud van de architectuur van het weefsel dat zal worden afgebeeld. De thymus is gelijmd op een dekglaasje aan ter voorbereiding van ex vivo beeldvorming van TPM. Tijdens beeldvorming van de thymus wordt gehouden in DMEM zonder fenol rood dat is geperfuseerd met 95% zuurstof en 5% kooldioxide en verwarmd tot 37 ° C. Met deze aanpak kunnen we bestuderen de gebeurtenissen die nodig zijn voor het genereren van een divers T-cel repertoire.
Protocol
Discussion
Twee-foton beeldvorming in de thymus stelt ons in staat om na te gaan in het leven, intacte organen de interacties en migraties die selectie ten grondslag liggen aan gebeurtenissen in de thymus.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Matt Paul en Jimmy Wu voor technische bijstand.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
