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Biology

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

doi: 10.3791/652 Published: January 25, 2008

Summary

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

Abstract

Microscopia de dois fótons (TPM) nos permite imagem profundamente no timo e documentar os eventos que são importantes para o desenvolvimento timócito. Para acompanhar a migração de indivíduos em uma multidão de timócitos, geramos quimeras neonatal, onde menos de um por cento dos timócitos são derivados de um doador que é transgênico para expressar uma proteína fluorescente ubiquitously. Para gerar estas quimeras parcial hematopoéticas, os destinatários neonatal são injetados com medula óssea entre 3-7 dias de idade. Após 4-6 semanas, o rato é sacrificado e do timo é cuidadosamente dissecado e bissected preservar a arquitetura do tecido que será trabalhada. O timo é colado em uma lamela em preparação para ex vivo de imagens por TPM. Durante a gravação do timo é mantido em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Usando essa abordagem, podemos estudar os eventos necessários para a geração de um repertório diversificado de células T.

Protocol

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Transferência adotiva

Injetar recém-nascidos com 50 100ul de medula óssea usando uma seringa de insulina 2-4 vezes durante os primeiros 3-7 dias de vida, com uma relação de doadores para hospedar-final de 1:1. Apontar para um local da injeção abaixo do esterno e costelas, mas acima do intestino e estômago. Inserir a agulha longe o suficiente para penetrar no peritônio, cuidado para não perfurar o diafragma. Não é incomum para alguns de medula óssea para ser perdido durante a injecção. Você pode reduzir a perda soltando o seu domínio sobre o cachorro como você injetar, de modo a permitir que a pele a se expandir e, em seguida, lentamente, retirar a agulha.

Dissecção da Thymus

Faça uma incisão através da linha média e cortar ou rasgar a pele para revelar a caixa torácica. Segure-se do esterno e cortar o peritônio e diafragma. Cortar os lados da caixa torácica para revelar a cavidade torácica. O timo fica em cima do coração. De forma a preservar a estrutura do timo, segurar o tecido circundante como você dissecar o timo. Lavar o timo com PBS para mantê-lo de secar durante a dissecção. Provocar suavemente o tecido em excesso na superfície da cápsula do timo e bisect os dois lóbulos.

Preparando Tissue for Imaging

Use cola de tecido veterinária para colar o timo não a uma lamela quadrados. Use uma pipetteman para colocar uma fração de um microlitro de adesivo. Espalhe a cola para o comprimento e largura aproximada do timo. Timo a constante contra as lamelas e arrastá-lo no lugar.

Dois Photon Imagens

O tecido é imerso em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Excitação de dois fótons foi obtido utilizando um Spectra-Física Maitai a laser sintonizado com 900nm, e PCP, GFP, YFP e Texas Red emissão de luz foi separada usando um 495, 515, 560 espelhos dicróicos e coletados por meio de detectores de PMT.

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Discussion

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Imagem de dois fótons no timo nos permite examinar em que vivem, órgãos intactos as interações e as migrações que fundamentam eventos de seleção dentro do timo.

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Acknowledgments

Agradecemos a Matt Paul e Jimmy Wu para assistência técnica.

References

  1. Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
  2. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  3. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia
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Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy. J. Vis. Exp. (11), e652, doi:10.3791/652 (2008).More

Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy. J. Vis. Exp. (11), e652, doi:10.3791/652 (2008).

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