Мы представляем шаг за шагом инструкции для поколения новорожденных химерами, а также вскрытие и подготовка тимуса для бывших естественных изображений на 2-Фотон микроскопии.
Abstract
Двухфотонное микроскопия (TPM) позволяет нам образ глубоко в вилочковой железе и документировать события, которые имеют важное значение для развития тимоцитов. Для выполнения миграции физических лиц в толпе тимоцитов, мы генерируем новорожденных химерами, где менее чем один процент тимоцитов являются производными от донора, для трансгенных повсеместно выражают флуоресцентного белка. Для создания этих частичных кроветворения химеры, неонатальной получателей вводят костного мозга от 3-7 дней от роду. После 4-6 недель, мыши приносится в жертву и тимуса тщательно расчленены и bissected сохраняя архитектуру ткани, которая будет в образ. Тимус наклеиваются на покровное в рамках подготовки к бывшим естественных изображений по TPM. Во время визуализации тимус хранится в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Используя этот подход, мы можем изучать события, необходимые для генерации разнообразный репертуар Т-клеток.
Protocol
Приемные Трансфер Inject новорожденных с 50-100 мкл костного мозга использованием инсулиновый шприц 2-4 раза в течение первых 3-7 дней жизни, с окончательным донор-хост соотношении 1:1. Стремитесь к инъекции ниже грудины и грудной клетки, но, прежде кишки и желудка. Вставьте иглу достаточно да…
Discussion
Двухфотонное изображений в тимуса позволяет рассматривать в живых, неповрежденных органов взаимодействия и миграции, которые лежат в основе выбора события в тимусе.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мэтта Павел и Джимми Ву для оказания технической помощи.