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Chemistry

प्लाज्मोनिक डीएनए ओरिगामी नैनोएंटेना द्वारा सक्षम एकल-अणु सतह-एन्हांस्ड रमन प्रकीर्णन माप

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65310
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Chemistry, University of Potsdam

Summary

यह प्रोटोकॉल डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) का उपयोग करके एकल-अणु सतह-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) माप को प्रदर्शित करता है, जो कोलोकाइज्ड परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन माप के साथ संयुक्त है।

Abstract

सरफेस-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) में एकल अणुओं का पता लगाने की क्षमता होती है जिसके लिए उच्च क्षेत्र वृद्धि की आवश्यकता होती है। एकल-अणु (एसएम) एसईआरएस व्यक्तिगत अणुओं के बारे में अणु-विशिष्ट स्पेक्ट्रोस्कोपिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है और इसलिए अन्य एसएम पहचान तकनीकों की तुलना में अधिक विस्तृत रासायनिक जानकारी देता है। साथ ही, एसएम माप से जानकारी को उजागर करने की क्षमता है जो थोक सामग्री के रमन माप में छिपी हुई है। यह प्रोटोकॉल परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के संयोजन में डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) का उपयोग करके एसएम एसईआरएस माप को रेखांकित करता है। एक डीएनए ओरिगेमी फोर्क संरचना और दो सोने के नैनोकणों को डीओएनए बनाने के लिए जोड़ा जाता है, जिनके बीच 1.2-2.0 एनएम का अंतर होता है। यह 1011 गुना एसईआरएस सिग्नल वृद्धि की अनुमति देता है, जिससे एकल अणुओं के माप को सक्षम किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आगे एसईआरएस हॉट स्पॉट में एक एकल विश्लेषण अणु के प्लेसमेंट, एएफएम इमेजिंग की प्रक्रिया और बाद में एक एकल डीओएनए में एक विश्लेषण को मापने के लिए रमन इमेजिंग के ओवरलेइंग को प्रदर्शित करता है।

Introduction

डीएनए ओरिगेमी एक नैनो टेक्नोलॉजी तकनीक है जिसमें डीएनए स्ट्रैंड को विशिष्ट आकार और पैटर्न में मोड़ना शामिल है। नैनोस्केल पर सटीक नियंत्रण के साथ संरचनाओं को बनाने की क्षमता डीएनए ओरिगेमी1 के प्रमुख लाभों में से एक है। इतने छोटे पैमाने पर पदार्थ में हेरफेर करने की क्षमता में चिकित्सा, इलेक्ट्रॉनिक्स और सामग्री विज्ञानसहित क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में क्रांति लाने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, डीएनए ओरिगेमी संरचनाओं का उपयोग कैंसर कोशिकाओं 3,4 को सीधे दवाओं को वितरित करने के लिए किया गया है, बीमारियों का पता लगाने के लिए नैनोस्केल सेंसर5,6, और सामग्री 6,7 की सतहों पर जटिल पैटर्न बनाते हैं। इसके अलावा, जटिल नैनोस्केल संरचनाओं को बनाने के लिए डीएनए ओरिगेमी का उपयोग करने की क्षमता ने नैनोस्केल8 में मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नए अवसर पैदा किए हैं।

सरफेस एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) एक मजबूत विश्लेषणात्मक तकनीक है जो बेहदकम सांद्रता पर अणुओं का पता लगाती है और उनकी पहचान करती है। यह रमन प्रभाव पर आधारित है, जो बिखरे हुए प्रकाश10 की तरंग दैर्ध्य में परिवर्तन है। एसईआरएस को एक प्लाज्मोनिक धातु सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है ताकि उस पर अधिशोषित अणुओं के रमन संकेत को बढ़ाया जा सके। यह वृद्धि पारंपरिक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापे गए एक ही अणु से प्राप्त संकेत की तुलना में 1011 गुना अधिक हो सकती है, जिससे एसईआरएसपदार्थों की ट्रेस मात्रा का विश्लेषण करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि बन जाती है।

नैनोकणों की रमन सिग्नल वृद्धि ज्यादातर स्थानीय सतह प्लास्मोन अनुनाद (एलएसपीआर) 12 के उत्तेजना के आधार पर विद्युत चुम्बकीय वृद्धि के कारण होती है। इस घटना में, धातु नैनोपार्टिकल के भीतर इलेक्ट्रॉन प्रकाश की घटना के दौरान धातु नैनोपार्टिकल की सतह के चारों ओर सामूहिक रूप से घूमते हैं। इसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रॉनों की एक स्थायी लहर का निर्माण होता है जिसे सतह प्लास्मोन के रूप में जाना जाता है, जो घटना प्रकाश के साथ प्रतिध्वनित हो सकता है। एलएसपीआर कण की सतह के पास विद्युत क्षेत्र को बहुत बढ़ाता है, और कण का ऑप्टिकल अवशोषण प्लास्मोन अनुनाद आवृत्ति पर अधिकतम होता है। सतह प्लास्मोन की ऊर्जा धातु नैनोपार्टिकल के आकार और आकार के साथ-साथ आसपास के माध्यम13 के गुणों पर निर्भर करती है। प्लाज्मोनिक युग्मन द्वारा एक उच्च वृद्धि प्राप्त की जा सकती है, जैसे कि जब दो नैनोकण व्यास की लंबाई से लगभग 2.5 गुना याकम 14 की दूरी पर एक दूसरे के करीब होते हैं। निकटता दोनों नैनोकणों के एलएसपीआर को एक दूसरे के साथ बातचीत करने का कारण बनती है, जिससे कणों के बीच के अंतर में विद्युत क्षेत्र को परिमाण के कई आदेशों से बढ़ाया जाता है, जो एकल नैनोपार्टिकल15,16,17 की वृद्धि से कहीं अधिक है। वृद्धि का परिमाण नैनोकणों के बीच की दूरी के व्युत्क्रमानुपाती है; जैसे-जैसे दूरी कम होती है, एक महत्वपूर्ण बिंदु दिखाई देता है जहां वृद्धि एकल अणुओं (एसएम) 18 का पता लगाने के लिए पर्याप्त है।

डीएनए ओरिगेमी एक प्रमुख तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है जो प्लाज्मोनिक युग्मन19 का फायदा उठाने और अनुकूलित करने के लिए प्लाज्मोनिक नैनोकणों को कुशलतापूर्वक व्यवस्थित कर सकता है। इसी समय, रुचि के अणुओं को उस स्थान पर ठीक से रखा जा सकता है जहां ऑप्टिकल डिटेक्शन सबसे कुशल है। यह प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए डीएनए ओरिगेमी-आधारित प्लाज्मोनिक नैनोएंटेना के साथ प्रदर्शित किया गयाहै। फ्लोरोसेंट लेबल का पता लगाने के विपरीत, एसईआरएस एक अणु के प्रत्यक्ष रासायनिक फिंगरप्रिंट का पता लगाने की संभावना प्रदान करता है, जिससे एकल-अणु एसईआरएस संवेदन के साथ-साथ रासायनिक प्रतिक्रियाओं और यांत्रिक अध्ययनों की निगरानी के लिए बहुत आकर्षक हो जाता है। डीएनए ओरिगेमी का उपयोग अच्छी तरह से परिभाषित आकृतियों21 के साथ प्लाज्मोनिक नैनोस्ट्रक्चर बनाने के लिए एक मुखौटा के रूप में भी किया जा सकता है, हालांकि लक्ष्य अणुओं को गर्म स्थान में सटीक रूप से रखने की संभावना खो जाती है।

कोलोकाइज्ड एटॉमिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन माप का उपयोग करके, हम एक एकल डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) से रमन स्पेक्ट्रा प्राप्त कर सकते हैं और संभवतः एक एकल अणु को उच्चतम सिग्नल वृद्धि की स्थिति में रखा जा सकता है। डीओएनए में एक डीएनए ओरिगेमी फोर्क और दो सटीक रूप से स्थित नैनोकण शामिल हैं, जो पूरी तरह से डीएनए ओरिगेमी से जुड़े विस्तारित स्टेपल स्ट्रैंड के पूरक डीएनए के साथ लेपित हैं। डीएनए संकरण पर, नैनोकणों को नैनोपार्टिकल सतहोंके बीच 1.2-2.0 एनएम अंतर के साथ डीएनए ओरिगेमी फोर्क से बांधा जाता है। इस तरह की असेंबली नैनोकणों के बीच एक गर्म स्थान बनाती है, जिसमें 1011 गुना तक की सिग्नल वृद्धि होती है, जैसा कि परिमित अंतर समय डोमेन (एफडीटीडी) सिमुलेशन22 से गणना की जाती है, इस प्रकार एसएम एसईआरएस माप की अनुमति मिलती है। हालांकि, उच्चतम वृद्धि की मात्रा छोटी है (1-10 एनएम3 रेंज में), और परिणामस्वरूप लक्ष्य अणुओं को इस गर्म स्थान में ठीक से तैनात करने की आवश्यकता है। डीएनए ओरिगेमी कांटा डीएनए फोर्क ब्रिज और उपयुक्त युग्मन रसायन विज्ञान का उपयोग करके दो नैनोकणों के बीच एक एकल अणु की स्थिति की अनुमति देता है। फिर भी, रमन स्पेक्ट्रा में ऐसे एसएम का अवलोकन करनाबहुत चुनौतीपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, नैनोकणों को लक्ष्य अणु के साथ पूरी तरह से लेपित किया जा सकता है, जैसे कि टैमरा डाई, उच्च एसईआरएस तीव्रता21 के साथ एकल डीओएनए माप की अनुमति देने के लिए। इस मामले में, टीएएमआरए डीएनए कोटिंग स्ट्रैंड (चित्रा 1) से सहसंयोजक रूप से जुड़ा हुआ है।

Protocol

1. डीएनए ओरिगेमी फोर्क असेंबली

  1. एक बर्तन में डीएनए ओरिगेमी संरचना को स्वयं इकट्ठा करें। सबसे पहले, 1x TAE (tris[हाइड्रॉक्सीमिथाइल]एमिनोमेथेन [ट्रिस], एसिटिक एसिड, एथिलीनडायमाइन एसिटिक एसिड [EDTA]) में 2.5 nM गोलाकार मचान स्ट्रैंड M13mp18 (7,249 न्यूक्लियोटाइड, सामग्री की तालिका देखें) और 201 लघु ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (तालिका 1) के 100 एनएम को 15 एमएम एमजीसीएल2 बफर के साथ पूरक करें। फिर, अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके कुल मात्रा को 100 μL में समायोजित करें।
  2. घोल को बाद में एक थर्मोसाइकलर में तापमान ढाल द्वारा नष्ट करें, पहले तेजी से 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके, फिर 1 डिग्री सेल्सियस / 12 मिनट पर 80 डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके, फिर 1 डिग्री सेल्सियस / 6 मिनट पर 20 डिग्री सेल्सियस से 16 डिग्री सेल्सियस तक, इसके बाद 16 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस तक तेजी से ठंडा करें।
  3. अतिरिक्त स्टेपल से मिश्रण को शुद्ध करने के लिए 100 केडीए आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) एमिकॉन फिल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    1. एमीकॉन फिल्टर में डीएनए ओरिगेमी समाधान के 100 μL, साथ ही 400 μL अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें, फिर कमरे के तापमान (RT) पर 8 मिनट के लिए 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सिंक में वॉश-आउट को हटाने के लिए फिल्टर को हटाकर और ट्यूब को फ्लिप करके छानना छोड़ दें, फिर फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज में 400 μL अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें। इस चरण को एक बार और दोहराएं।
    3. शुद्ध नैनोस्ट्रक्चर समाधान एकत्र करने के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए फ़िल्टर को एक नई ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज (1,000 x g, 2 मिनट, RT) में उल्टा पलटें ( सामग्री की तालिका देखें)। इस घोल को फ्रिज में 8 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: एमिकॉन फिल्टर शुद्धिकरण चरण के लिए अल्ट्राप्योर पानी के बजाय 1x TAE बफर या 1x TAE को 15 mM MgCl2 बफर के साथ पूरक करें, क्योंकि पानी स्थिरता को कम करता है और प्राप्त डीएनए ओरिगेमी फोर्क की एकाग्रता को कम करता है। एकल डाई अणु माप के लिए, डीएनए स्टेपल स्ट्रैंड मिश्रण को एक संशोधित स्ट्रैंड मिश्रण के साथ बदल दिया जाता है जिसमें 5 'अंत पर एक टैमरा डाई होता है। यह संशोधित स्ट्रैंड नैनोफोर्क ब्रिज (तालिका 2) के बीच में है।

2. गोल्ड नैनोपार्टिकल (एयूएनपी) कोटिंग

नोट: एयूएनपी को कोट करने के लिए लियू एट अल .23 प्रोटोकॉल के एक संशोधित संस्करण का उपयोग किया गया था, और कोटिंग प्रक्रिया में एयूएनपी-डीएनए समाधान को फ्रीज करना शामिल था।

  1. सेंट्रीफ्यूज (3,500 x g, 5 मिनट, RT) 60 nm व्यास AUNP समाधान के 400 μL (व्यावसायिक रूप से प्राप्त; सामग्री की तालिका देखें), और एक पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। फिर, 25 μL अल्ट्राप्योर पानी में गोली को फिर से घुलनशील करें। एयूएनपी की अंतिम एकाग्रता ~ 0.3 एनएम है।
  2. थिओल-संशोधित डीएनए के 4 μL (निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए 100 μM; सामग्री की तालिका देखें) में 100 mM tris-(2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन (TCEP) घोल का 1 μL जोड़ें और RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन बाद, 5 μL मिश्रण को केंद्रित AUNP समाधान (चरण 2.1), 5 s के लिए भंवर में जोड़ें, और -20 °C पर कम से कम 2 घंटे के लिए फ्रीज करें।
  4. आरटी पर पिघलने के बाद, सेंट्रीफ्यूज (3,500 x g, 5 मिनट, RT) मिश्रण को अत्यधिक जोड़े गए कोटिंग डीएनए को हटाने के लिए। एक पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और गोली को 10 μL पानी में फिर से सोलें।
    नोट: नैनोफोर्क पर एयूएनपी में से प्रत्येक के लिए दो कोटिंग किस्में हैं (तालिका 2)। डीएनए कोटिंग स्ट्रैंड के अनुक्रम को छोड़कर चरण समान हैं। एक बार जब कणों को लेपित किया जाता है, तो वे बहुत स्थिर होते हैं; वे फ्रिज में महीनों तक रह सकते हैं और यहां तक कि जमे हुए भी हो सकते हैं। पूरी तरह से लेपित डाई एयूएनपी के लिए, कोटिंग डीएनए स्ट्रैंड में एक आंतरिक टैमरा डाई होती है।

3. डोना असेंबली

  1. 1.5: 1 के एकाग्रता दाढ़ अनुपात के साथ, नैनोफोर्क समाधान में लेपित एयूएनपी समाधान जोड़ें।
  2. 50 mM MgCl 2 स्टॉक समाधान का उपयोग करके 4 mM की अंतिम एकाग्रता में MgCl2 जोड़ें। अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके अंतिम मात्रा को 20 μL में समायोजित करें।
  3. थर्मोसाइकलर में तापमान ढाल का उपयोग करके डीओएनए को हाइब्रिड करें। सबसे पहले, तेजी से 40 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, फिर 1 डिग्री सेल्सियस / 10 मिनट पर 40 डिग्री सेल्सियस से 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, और फिर 20 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस तक तेजी से ठंडा करें।

4. जेल वैद्युतकणसंचलन

नोट: डोना समाधान में अनबाउंड नैनोकणों को एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हटा दिया जाता है।

  1. 1% एगारोस जेल तैयार करें। इसके लिए, 1x TAE के 80 mL में 0.8 ग्राम Agarose को 5 mM MgCl2 के साथ पूरक करें।
  2. चरण 3.2 में 4 mM से 5 mM MgCl 2 की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए DONA समाधान के 18 μL में लोडिंग बफर (30% ग्लिसरॉल, 13 mM MgCl2; सामग्री की तालिका देखें) के2.25 μL जोड़ें। लोडिंग बफर यह भी सुनिश्चित करता है कि नमूना जेल की जेब के अंदर रहता है।
  3. बर्फ के पानी के स्नान में 70 वी पर 60 मिनट के लिए जेल चलाएं। रनिंग बफर 1x TAE है जो 5 mM MgCl 2 के साथ पूरक है।
  4. रुचि के बैंड को काट लें और इसे पैराफिन प्लास्टिक फिल्म-लपेटी माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर रखें, और फिर एक दूसरे पैराफिन प्लास्टिक फिल्म-लपेटे हुए माइक्रोस्कोपी स्लाइड का उपयोग करके समाधान को निचोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके, निचोड़ा हुआ तरल को 500 μL ट्यूब में इकट्ठा करें।

5. एएफएम और रमन माप का सह-स्थानीयकरण।

  1. प्लाज्मा 10 मिनट के लिए एक सिलिकॉन चिप ( सामग्री की तालिका देखें) का इलाज करें, फिर शुद्ध डीओएनए समाधान के 10 μL और 3 घंटे के लिए चिप पर 100 mM MgCl2 के 10 μL को इनक्यूबेट करें। फिर, चिप को इथेनॉल और पानी के 1: 1 मिश्रण (मात्रा के अनुसार) के साथ दो बार धोएं और संपीड़ित हवा के साथ ब्लो-ड्राई करें। फिर, चिप को चुंबकीय डिस्क पर टेप करें और इसे इमेजिंग के लिए उपकरण में डालें।
    नोट: माप शुरू करने से पहले, रमन उत्तेजना लेजर की स्थिति एएफएम जांच टिप के शीर्ष पर समायोजित की जाती है। वर्तमान कार्य में एक HORIBA LabRAM HR Evolution रमन माइक्रोस्कोप एक HORIBA Omegascope AFM के साथ युग्मित किया जाता है। उपकरण सॉफ्टवेयर लैबस्पेक और एआईएसटी का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है।
  2. एएफएम माप के लिए, एक्सेस-एनसी-ए (अनुनाद आवृत्ति: 300 kHz; स्प्रिंग स्थिरांक: 45 N / m) युक्तियों24 के साथ टैपिंग मोड (AC मोड) का उपयोग करें। एसी मोड स्वचालित रूप से स्कैन दर को छोड़कर सभी मापदंडों को नियंत्रित करता है, जो 1 हर्ट्ज पर सेट है।
    नोट: एएफएम इमेजिंग के बाद, एएफएम टिप को वापस ले लिया जाता है ताकि यह रमन लेजर के रास्ते में न हो। यह सिस्टम में प्रोग्राम किए गए मैक्रो फ़ंक्शन, "प्रोब अवे" का उपयोग करके किया जाता है। इस तरह, एएफएम छवि में किसी भी चुने हुए बिंदु के लिए, एएफएम की तुलना में लेजर बिना किसी ऑफसेट के उसी स्थिति में होगा।
  3. रमन माप के लिए वांछित लेजर तरंग दैर्ध्य, शक्ति और संचय समय चुनें, क्योंकि ये सभी पैरामीटर मापा नमूने पर निर्भर करते हैं।
    1. पूरी तरह से लेपित TAMRA AUNP माप के लिए उल्लिखित मापदंडों का उपयोग करें: 633 एनएम लेजर, 100 μW शक्ति, और 1 s एकीकरण समय।
    2. एकल TAMRA माप के लिए उल्लिखित मापदंडों का उपयोग करें: 633 एनएम लेजर, 400 μW शक्ति, और 4 s एकीकरण समय।
  4. मापदंडों को समायोजित करने के बाद, कर्सर को एएफएम छवि में वांछित डोना के शीर्ष पर रखें; सॉफ्टवेयर में "मूव कर्सर" फ़ंक्शन ऐसा करता है। फिर, रमन माप शुरू करें।
    नोट: स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए अलग-अलग मोड हैं: एकल बिंदु माप-एक-आयाम समय मानचित्रण-जहां एक बिंदु को समय25 पर मापा जाता है; और दो-आयाम एक्सवाई क्षेत्र मानचित्रण, जहां एक्सवाई ग्रिड26 में बिंदुओं की एक सरणी से स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए लेजर के नीचे एक मोटरचालित चरण को स्थानांतरित किया जाता है।

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि डीएनए ओरिगेमी फोर्क सही ढंग से इकट्ठा किया गया है; कांटे की संरचना की जांच करने के लिए पसंदीदा तरीका एएफएम इमेजिंग है। अधिकांश कांटे ठोस होने की उम्मीद है, जिसमें कोई टूटी हुई भुजाएं नहीं हैं। दूसरी ओर, भुजाओं के बीच के पुल को इसके छोटे व्यास और उच्च लचीलेपन के कारण चित्रित करना मुश्किल है; इसके लिए एक बहुत तेज एएफएम टिप (चित्रा 2) की भी आवश्यकता होती है।

एयूएनपी कोटिंग प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में समाधान रंग परिवर्तन इंगित करता है कि सब कुछ सही तरीके से काम करता है। रंग सिर्फ एयूएनपी के साथ गहरे लाल रंग से शुरू होता है, लेकिन जैसे ही डीएनए जोड़ा जाता है, यह गहरे-बैंगनी लाल रंग में बदल जाता है। ठंड रंग को बैंगनी में बदल देती है और, पिघलने के बाद, इसे गहरे लाल रंग में लौटा देती है (चित्रा 3 ए)। चित्रा 3 बी नंगे एयूएनपी और डीएनए-लेपित एयूएनपी के अवशोषण स्पेक्ट्रा को दर्शाता है।

उसके बाद, डोना असेंबली चरणों में, रंग पूरी प्रक्रिया में गहरा लाल रहता है। एगारोस जेल शुद्धिकरण के दौरान, एक डिमर बैंड मुक्त एयूएनपी बैंड के ऊपर दिखाई देता है, जो नमूने में सबसे तेजी से चलने वाला बैंड है। यह डिमर बैंड डीओएनए से मेल खाता है और बाद में नमूना निकालने के लिए काट दिया जाता है और निचोड़ा जाता है (चित्रा 4)।

अंत में, कोलोकलाइजेशन माप के लिए, नमूने की एएफएम इमेजिंग डीओएनए (चित्रा 5) की खोज में की जाती है। उसके बाद, एकल डीओएनए से रमन स्पेक्ट्रा एकत्र किया जाता है और यह सुनिश्चित करने के लिए तुलना की जाती है कि प्राप्त स्पेक्ट्रा टैमरा अणुओं से हैं (चित्रा 6)।

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए ओरिगेमी फोर्क और पूरी तरह से इकट्ठे डीओएनए का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) 90 न्यूक्लियोटाइड लंबे पुल के साथ डीएनए ओरिगेमी फोर्क के आयाम। (बी) एक इकट्ठे डीओएनए का योजनाबद्ध साइड-व्यू, जिसमें दो एयूएनपी और बीच में डीएनए ओरिगेमी कांटा होता है। (सी) पुल के बीच में एसएम की प्लेसमेंट स्थिति को दर्शाते हुए इकट्ठे डीओएनए का योजनाबद्ध टॉप-व्यू। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: असेंबली के बाद डीएनए ओरिगेमी फोर्क्स की एएफएम छवि। कांटे अच्छी तरह से बनते हैं, कुछ कांटे में पुल दिखाई देता है। कांटे की ऊंचाई 1.5-2 एनएम के बीच होती है। स्केल बार = 500 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: AUNPs का रंग विकास और अवशोषण स्पेक्ट्रा . (A) ट्यूब विभिन्न चरणों में AUNP समाधान का रंग दिखाते हैं. (1) नंगे एयूएनपी समाधान का गहरा लाल रंग। (2) एयूएनपी में कोटिंग डीएनए को जोड़ने के बाद गहरे-बैंगनी लाल। (3) कोटिंग डीएनए-एयूएनपी मिश्रण को फ्रीज करने के बाद बैंगनी रंग। (4) मिश्रण के पिघलने के बाद रंग गहरे लाल रंग में वापस आ जाता है। (बी) 60 एनएम एयूएनपी का अवशोषण स्पेक्ट्रा, नंगे एयूएनपी (ट्यूब 1) से डीएनए-लेपित एयूएनपी (ट्यूब 4) में अवशोषण शिखर में बदलाव को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डोना समाधान का अगारोस जेल। दोनों लेन में एक ही नमूना है, और डिमर बैंड (डोना) और मुक्त एयूएनपी बैंड दोनों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: डोना की एएफएम छवि। (ए) छवि कई डीओएनए संरचनाओं को दिखाती है; इस एएफएम छवि का उपयोग कोलोकलाइजेशन माप के लिए किया जाता है। (बी) डोना के सर्कल ्ड डोना और वर्टिकल क्रॉस-सेक्शन की ज़ूम-इन छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पूरी तरह से लेपित टैमरा एयूएनपी और एक एकल टैमरा अणु से लैस डीओएनए के एसईआरएस स्पेक्ट्रा। ऊर्ध्वाधर ग्रिडलाइन मुख्य TAMRA चोटियों को इंगित करती हैं। मुख्य ताम्रा चोटियां पूरी तरह से लेपित तामरा एयूएनपी में दिखाई देती हैं। हालांकि एसएम टीएएमआरए स्पेक्ट्रा के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम है, मुख्य चोटियां पहचान योग्य हैं: 1,360 सेमी -1: सी-सी स्ट्रेचिंग; 1,509 सेमी -1: सी = सी स्ट्रेचिंग; 1,536 सेमी -1: सी = सी स्ट्रेचिंग; 1,654 सेमी -1: सी = ओ स्ट्रेचिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: डीएनए ओरिगेमी फोर्क स्टेपल की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: संशोधित डीएनए किस्में की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

एसएम एसईआरएस एक शक्तिशाली उपकरण है जो शोधकर्ताओं को एक नमूना1 के भीतर व्यक्तिगत अणुओं के व्यवहार और बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इस तरह की तकनीक संवेदनशीलता के एक अभूतपूर्व स्तर पर सिस्टम के विश्लेषण की अनुमति देती है, एकल अणुओं के मौलिक व्यवहार और अणुओं के एक समूह पर रासायनिक या भौतिक गुणों के वितरण में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, और रासायनिक प्रक्रियाओं में प्रासंगिक मध्यवर्ती की पहचान करने में मदद करती है। हालांकि, हॉट स्पॉट में एक एकल अणु को रखना जबकि यह भी सुनिश्चित करना कि हॉट स्पॉट में पर्याप्त सतह वृद्धि है,काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित डीओएनए दो सोने के नैनोकणों के बीच गर्म स्थान में एक एकल अणु को ठीक से रख सकता है, जबकि यह सुनिश्चित करता है कि 1011 गुना सतह वृद्धि हो गई है।

एसएम एसईआरएस अध्ययनों के लिए आवश्यक सतह वृद्धि तक पहुंचने के लिए डीओएनए असेंबली के लिए नैनोकणों के बीच का अंतर महत्वपूर्ण है। डीओएनए को 60 और 80 एनएम के बीच आकार के गोलाकार नैनोकणों के लिए अनुकूलित किया गया है। इसके अलावा, नैनोकणों की गुणवत्ता डीएनए ओरिगेमी फोर्क्स के साथ नैनोकणों के संकरण को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकती है; जब कोटिंग चरण में उपयोग किए जाने वाले नैनोकणों 6 महीने से अधिक पुराने होते हैं, तो संकरण की दक्षता में गिरावट शुरू हो जाती है।

प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू यह है कि जिन चरणों के लिए घटकों के बीच सटीक अनुपात की आवश्यकता होती है, उनका ठीक से पालन किया जाना चाहिए, या डीओएनए सही ढंग से नहीं बनेंगे। डीएनए ओरिगेमी कांटा तापमान रैंपिंग प्रोटोकॉल के प्रति बेहद संवेदनशील है, जिसमें संरचना की अखंडता को प्रभावित करने वाले परिवर्तन होते हैं या कांटे बनने से रोकते हैं।

एसईआरएस माप के दौरान अनाकार कार्बन उत्पादन एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि इसकी चोटियां आमतौर पर कई अणुओं (1,200-1,700 सेमी -1) के लिए फिंगरप्रिंट क्षेत्र के समान सीमा में होती हैं। जबकि गठन अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है, यह आमतौर पर उच्च लेजर शक्ति या लंबे एकीकरण समय28 से जुड़ा होता है। एहतियात के रूप में, सबसे कम लेजर शक्ति और सबसे कम एकीकरण समय संभव का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि, यह आसानी से पूरा नहीं होता है क्योंकि वांछित एसईआरएस सिग्नल प्राप्त करने और अनाकार कार्बन की पीढ़ी से बचने के बीच संतुलन प्राप्त किया जाना चाहिए।

डीओएनए नैनोकणों के विभिन्न प्रकारों और आकारों के बारे में एसएम प्रणाली के रूप में बहुत बहुमुखी हैं, जिनका उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि चांदी के गोले, सोने के फूल या सितारे। इसके अतिरिक्त, जांच के तहत अणु को आसानी से पुल के बीच में केवल डीएनए स्ट्रैंड को बदलकर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, प्रक्रिया में कोई बदलाव नहीं होता है। साइटोक्रोम सी जैसे प्रोटीन पर स्विच करना पुल में एक पाइरिडिन-संशोधित डीएनए कैप्चर स्ट्रैंड होने से किया जा सकता है, जो साइटोक्रोम सी को बांध देगा और यह सुनिश्चित करेगा कि यह एसएम एसईआरएस माप22 के लिए गर्म स्थान पर है। यह विकिरण के लिए लेजर को लचीले ढंग से चुनने का भी अनुवाद करता है, संभावित रूप से एक लेजर का उपयोग करके जो अधिकतम वृद्धि देता है।

सारांश में, यह विधि डोना संरचनाओं को इकट्ठा करने और एकल-अणु सतह-वर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए उनका उपयोग करने के लिए विश्वसनीय है।

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी; समेकित अनुदान संख्या 772752) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL Merck UFC5100BK
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) SIGMA Aldrich T9650
60 nm goldspheres, bare (citrate) NanoComposix AUCN60
ACCESS-NC-A AFM probes SCHAEFER-TEC
Agarose powder SIGMA Aldrich 9012-36-6
AuNP DNA coating strands IDT
AuNP DNA coating strands (TAMRA) SIGMA Aldrich
Glycerol SIGMA Aldrich 56-81-5
Heraeus Fresco 17 centrifuge Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution HORIBA
Magnesium chloride SIGMA Aldrich 7786-30-3
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) Metabion
Nanofork DNA staple strands SIGMA Aldrich
ParafilmM Carl Roth CNP8.1
Primus 25 Thermocycler Peqlab/VWR
Silicon wafer Siegert wafer BW14076
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) Tilibit nanosystems
TCEP solution SIGMA Aldrich 51805-45-9

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रसायन विज्ञान अंक 197
प्लाज्मोनिक डीएनए ओरिगामी नैनोएंटेना द्वारा सक्षम एकल-अणु सतह-एन्हांस्ड रमन प्रकीर्णन माप
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Mostafa, A., Kanehira, Y., Dutta, A., Kogikoski Jr., S., Bald, I. Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas. J. Vis. Exp. (197), e65310, doi:10.3791/65310 (2023).

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