Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידות בזמן אמת של פרמטרים של סידן והתכווצות בקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

כאן, מתוארת שיטה מבוססת לביצוע מדידות התכווצות וסידן בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות פלטפורמה מבוססת אופטיקה. פלטפורמה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את השפעת המוטציות ואת התגובה לגירויים שונים באופן מהיר וניתן לשחזור.

Abstract

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מייצגים כלי רב עוצמה לחקר שינויים בתיווך מוטציות בתפקוד קרדיומיוציטים והגדרת ההשפעות של גורמי לחץ והתערבויות תרופתיות. במחקר זה, הוכח כי מערכת מבוססת אופטיקה זו היא כלי רב עוצמה להערכת הפרמטרים הפונקציונליים של hiPSC-CMs בדו-ממד. באמצעות פלטפורמה זו, ניתן לבצע מדידות זוגיות בסביבת טמפרטורה שמורה היטב על פריסות לוחות שונות. יתר על כן, מערכת זו מספקת לחוקרים ניתוח נתונים מיידי.

מאמר זה מתאר שיטה למדידת ההתכווצות של hiPSC-CMs שלא שונו. קינטיקה של התכווצות נמדדת ב-37°C בהתבסס על שינויי מתאם פיקסלים ביחס למסגרת ייחוס שנלקחה בהרפיה בתדירות דגימה של 250 הרץ. בנוסף, ניתן להשיג מדידות סימולטניות של מעברי סידן תוך תאיים על ידי העמסת התא עם פלואורופור רגיש לסידן, כגון Fura-2. באמצעות היפרסוויץ', ניתן לבצע מדידות סידן יחסיות על נקודת הארה בקוטר 50 מיקרומטר, המתאימה לאזור מדידות ההתכווצות.

Introduction

אי ספיקת לב היא סיבת המוות המובילה בעולם. בשנת 2019, מחלות לב וכלי דם גרמו ל -18.6 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המשקף עלייה של 17.1% בעשור האחרון1. למרות מאמצי החוקרים לזהות מטרות תרופתיות למניעה וריפוי של אי ספיקת לב, תוצאות החולים עדיין גרועות2. ההבדל בפתופיזיולוגיה של מודלים של בעלי חיים ביחס לבני אדם יכול להיות אחד הגורמים הבסיסיים להצלחה המוגבלת של אופטימיזציה של טיפול באי ספיקת לב3. מודלים דמויי אדם נוספים נדרשים למדל מחלות ולבדוק את הרעילות והיעילות של תרכובות תרופות חדשות.

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) מייצגים כלי רב עוצמה להגדרת פתומנגנונים תאיים הנגרמים על ידי גורמי לחץ, איסכמיה, חילוף חומרים שונה או וריאנטים של גנים פתוגניים, ואת היעילות והרעילות של התערבויות תרופתיות4. כדי להגדיר השפעות על התכונות הפונקציונליות של hiPSC-CMs, מערכת במהירות גבוהה המודדת את התכונות הסיסטוליות והדיאסטוליות של התכווצויות סלולריות באופן בלתי משוחד וניתן לשחזור. המטרה הכוללת של המחקר הנוכחי היא להראות כי מערכת מבוססת אופטיקה היא כלי רב עוצמה לביצוע ניתוחים בזמן אמת של הפרמטרים הפונקציונליים של hiPSC-CMs.

נכון לעכשיו, ישנן פלטפורמות מרובות להערכת ההתכווצות של hiPSC-CMs. עם זאת, המערכות הנוכחיות מציעות קריאה איטית, או שמספר התאים הנדרש עשוי להוות אתגר. מערכות מדידת וידאו ללא תוויות5,6 מסתמכות על ניתוח פוסט-הוק של סרטונים, הדורש אחסון רב וחסר משוב ישיר במהלך רכישת וידאו. בנוסף, קשה להשיג רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת, והיא עלולה לגרום לתת-דגימה. שיטות אחרות לקביעת תכונות קרדיומיוציטים, כגון חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR)/HiPSC-CMs7 ערוכות Cas9 עם כתבים פלואורסצנטיים עשויות להפריע ליציבות הגנים של התאים ודורשות מומחיות מעבדה מיוחדת.

כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, פותחה והוצגה במחקר זה מערכת מדידה ייחודית מבוססת אופטיקה. פלטפורמה זו מאפשרת מדידות כיווץ על hiPSC-CMs ללא שינוי פשוט על ידי ציפוי מחדש שלהם בכל פורמט צלחת נדרש, ללא כל הגבלה בגודל הצלחת. יתר על כן, מדידות בזמן אמת מאפשרות תצפית ישירה וניתוח של הפרמטרים הפונקציונליים של hiPSC-CMs, ובכך מספקות הגדרה ניסיונית להתאמה מיידית ואופטימיזציה של פרוטוקולים. יתר על כן, המיקום של כל מדידה נשמר, מה שמאפשר מדידות זוגיות על אותה דגימה, ובכך להגדיל את עוצמת הניסויים.

כדי להדגים את המערכת מבוססת האופטיקה, בוצעו מדידות כיווץ בקו בקרה hiPSC-CM. קו hiPSC בקרה זה נוצר מפיברובלסט עורי של תורם זכר בריא עם קריוטיפ8 תקין. קינטיקה של התכווצות נמדדה ב-37 מעלות צלזיוס, בהתבסס על שינויי מתאם פיקסלים ביחס למסגרת ייחוס שנלקחה במהלך הרפיה בתדר דגימה של 250 הרץ. מכיוון שלא תמיד ניתן לקבוע באופן חד משמעי את תחילת ההתכווצות, נקודת הזמן שבה הושגו 20% מגובה השיא (זמן לשיא 20%) נלקחה כנקודת המוצא למדידות של זמן לשיא. בכך נמצאה שונות פחותה לפרמטר זה במדגם אחד. באופן דומה, מכיוון שקשה להעריך את הרגע המדויק שבו האות חוזר לקו הבסיס, הזמן שלקח להגיע ל-80% מהחזרה לקו הבסיס מהשיא (זמן לקו הבסיס 80%) שימש לתיאור זמן הרגיעה.

מדידות ההתכווצות הכלליות כללו תדרי פעימות במנוחה, הזמן משיא של 20% להתכווצות שיא (TP. חסרונות), והזמן משיא ההתכווצות ל-80% מקו הבסיס (שחפת. Con80) (איור 1B). כדי לבדוק את ההשפעה של גורם דחק, התאים הודגרו עם איזופרנלין (ISO). בנוסף, במקרה עם מדידות התכווצות, Ca 2+ transients נמדדו על ידי העמסת התאים עם Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) בתדר דגימה של 250 הרץ. מדידות Ca2+ רציומטריות9 באמצעות היפר-מתג נעשו על שטח הארה בקוטר 50 מיקרומטר, המתאים לאזור מדידות ההתכווצות. נתוני מדידה של Ca 2+ מתוארים כזמן משיא של 20% לשיא במעבר Ca2+ (TP.Ca) והזמן מהשיא ל-80% מקו הבסיס (TB.Ca80) (איור 1C). כלי ניתוח נתונים מהיר ואוטומטי שימש כדי להניב פרמטרים קינטיים של התכווצות וסידן ממוצעים עבור כל אזור.

Protocol

1. הכנת מדיה וריאגנטים של תרבית תאים

  1. הכן מדיה hiPSC-CM על ידי הוספת 1 מ"ל של תוספת B27 (50x) ל 49 מ"ל של RPMI1640.
  2. הכינו את מדיום הציפוי מחדש על ידי הוספה תחילה של 5 מ"ל של החלפת סרום נוקאאוט ל-45 מ"ל של מדיה hiPSC-CM. לאחר מכן, הוסף 22.5 μL של מעכב סלע Y-27632 (דילול 1:2,000; ריכוז במלאי: 10 mM) וערבב היטב.
  3. הכינו צלחות מצופות קרום מרתף כמתואר להלן:
    1. הפשירו בקבוקון של קרום מרתף למשך הלילה במקרר או על קופסת קרח.
    2. דללו את קרום המרתף עם כמות מתאימה של מדיום הנשר של דולבקו / F12 של האם (DMEM/F12). מכיוון שלכל אצווה של קרום מרתף יש ריכוז שונה, חשב את כמות DMEM/F12 הדרושה כדי להגיע לדילול של 1 מ"ג / 1 מ"ל. הפוך 0.5 או 1 מ"ל aliquots לאחסון ב -20 ° C.
      הערה: שלב 1.3.2 צריך להיעשות על קרח בתוך מכסה מנוע זרימה.
    3. הפשיר את aliquot 0.5 מ"ל של קרום מרתף לדלל אותו עם 6 מ"ל של DMEM/F12. מערבבים היטב.
    4. מצפים את הצלחת על ידי פיפטינג 250 μL של קרום מרתף מדולל / באר בצלחת 24 בארות. חישוב בהתבסס על שטח הפנים של כל באר עבור פורמטים שונים של לוחות, לדוגמה, 1 מ"ל / באר בלוח 6 בארות.
    5. לדגור את הצלחת במשך 1 שעה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
  4. הכן Fura-2 AM aliquots על ידי המסת Fura-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), על פי מדריך היצרן להכין 1 mM aliquots. אחסן את aliquots ב -20 °C.

2. טיפוח hiPSC-CMs

  1. הפשירו בקבוקון של hiPSC-CMs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התוכן המופשר של הבקבוקון לצינור של 15 מ"ל. מוסיפים 10 מ"ל של מדיום הציפוי מחדש בצורה טיפתית לתאים.
  2. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 100 × גרם.
  3. מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ"ל של מדיום ציפוי מחדש. מזלפים בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הגלולה ולהסיר את כל גושי התא.
  4. השתמש בהמוציטומטר או מונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים.
  5. הסר את קרום המרתף מהצלחת המודגרת והחלף אותו במדיום הציפוי מחדש.
  6. צלחות את התאים בצפיפות תאים מתאימה על צלחת 6/12/24/48/96 באר המצופה בקרום מרתף (למשל, 250,000 תאים / באר בצלחת של 24 בארות).
    הערה: עבור ניסויים ארעיים Ca2+ , צלחת את התאים על לוחות תחתית זכוכית.
  7. החלף את המדיום במדיום תרבית hiPSC-CM למחרת ולאחר מכן רענן את המדיום פעם ביומיים באמצעות 0.5 מ"ל/באר בצלחת של 24 בארות.
  8. בצע את מדידות ההתכווצות לאחר שה- hiPSC-CMs התאוששו מהפשרה וציפוי מחדש (3-5 ימים לאחר ציפוי מחדש בפרוטוקול זה).
    הערה: במקרה של ציפוי מחדש לא אחיד של תאים, ייתכן שקבוצת תאים אינה באה במגע עם שאר התאים המצופים מחדש ועשויה להציג דפוס פעימות לא סדיר או לא מסונכרן. כדי למנוע אסינכרוניה, מומלץ לקבל התפלגות שווה של תאים מונושכבה מסונכרנת היטב מחובר היטב של hiPSC-CMs בכל באר.

3. מדידות התכווצות

  1. הפעל את מערכת המדידה מבוססת האופטיקה, מקור האור של דיודה פולטת אור במיקרוסקופ (LED) והמחשב (ראה טבלת חומרים).
  2. פתח את התוכנית ופתח קובץ חדש. תחת קובץ בפינה הימנית העליונה של המסך, לחץ על חדש.
  3. לחץ על לאסוף, בחר ניסויים ולאחר מכן בחר "iPSC + סידן".
  4. הפעל את התקן בקרת האקלים. הגדר את הטמפרטורה ל 37 ° C ואת רמת CO2 ל 5%.
  5. החלף את מדיום התרבית hiPSC-CM בתמיסת Tyrode (0.5 מ"ל/באר בצלחת של 24 בארות). החלף את מכסה הצלחת במכסה בקרת האקלים.
    הערה: אם יש צורך לבצע מדידות ארעיות של סידן, טען את התאים עם Fura-2 AM, כמתואר בסעיף 4.
  6. הניחו את הצלחת בתוך מערכת מדידה מבוססת אופטיקה ברגע שמכשיר בקרת האקלים מראה שהטמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: התכווצות נמדדת בתנאי שדה בהיר.
  7. לחץ על פתח מאתר תאים מתחת לסרגל הכלים והמתן למסך חדש שיופיע. בפינה השמאלית העליונה של המסך, בחר את פורמט הצלחת ואת הבאר.
  8. בחר באר אחת, בחר אזור בתוך הבאר כדי לצפות בהתכווצות והרפייה מסונכרנות, לחץ על התחל, לחץ על הוסף מדידה. בחר את משך המדידות בהגדרות (10 שניות לכל אזור). בטל מיד מדידות כיווץ מסונכרנות ובחר אזור חדש.
    הערה: ניתן לראות את זמני ההתכווצות בזמן אמת על הצג. עבור התכווצויות מסונכרנות, ארעי רציף חלק הוא ציין, ואילו עבור התכווצויות מסונכרנות, פסגות קטנות נוספות נצפים.
  9. מדדו מספר אזורים בתוך הבאר בהתאם לגודל הבאר. לדוגמה, כדי לעקוב אחר מחקר זה, למדוד 10 אזורים לכל באר בצלחת 24 בארות. במקרה שיש צורך במדידות בסיסיות בלבד ואין תוכנית לבדוק תרכובת כלשהי, המשך משלב 3.13.
  10. לאחר מדידת האזורים בתוך באר, לחץ על השלם ופתח את מכשיר המדידה מבוסס האופטיקה כדי להוסיף את גורם העקה / התרכובת לבאר (למשל, 500 ננומטר ISO, מומס בטירוד).
  11. בחר את זמן הדגירה בהתאם לדריבית העניין (2 דקות עם ISO בפרוטוקול זה).
  12. לחצו על מדידה אוטומטית כדי לאפשר למכשיר המדידה מבוסס האופטיקה לבצע מדידות באותם אזורים שבהם בוצעו המדידות הבסיסיות, והתוצאה היא מדידות זוגיות בתוך הבאר.
  13. לחץ על השלם לאחר ביצוע כל המדידות בבאר.
  14. בחר את הבאר הבאה בפינה השמאלית העליונה של המסך.
  15. המשך מדידות עבור כל הבארות הנדרשות.
  16. לחץ על עצור לאחר שכל הבארות הדרושות נמדדו ושמור את הקובץ.
    הערה: בקרת האקלים משמשת לשמירה על CO2 יציב. זה מאפשר למדוד את ההשפעה של תרכובות / גורמי עקה על hiPSC-CMs במהירות גבוהה.

4. מדידות ארעיות של סידן

  1. הכינו תמיסת טירוד בטמפרטורה של 37°C.
  2. להמיס את aliquots Fura-2 AM בתמיסת Tyrode כך ריכוז סופי של 1 μM Fura-2 AM יתווסף לתאים.
    הערה: בעת השימוש ב- Fura-2 AM, ודא שהאורות במכסה המנוע כבויים כדי למזער את החשיפה לאור.
  3. שאפו את המדיום והחליפו אותו בתמיסת Tyrode המכילה Fura-2 AM.
  4. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור או במערכת מדידה מבוססת אופטיקה.
  5. הסר את תמיסת Tyrode המכילה Fura-2 AM, ולאחר מכן לשטוף 2x עם תמיסת Tyrode טרי. לבסוף, לדגור על התאים בתמיסת Tyrode במשך 5 דקות נוספות ב 37 ° C כדי לאפשר de-esterification של Fura-2 AM.
  6. הניחו את הלוחית בתוך מערכת המדידה מבוססת האופטיקה והתחילו את המדידות, כמתואר בסעיף 3.
    הערה: בשלב 4.6. על ידי התחלת המדידות בו זמנית עם מדידות ההתכווצות, נרשם מעבר סידן יחסי: עירור ב 340 ננומטר ו 385 ננומטר במקום 100 מיקרומטר; פליטה שנאספה ב 510 ± 40 ננומטר. בנוסף לעקבות ההתכווצות, יופיעו על המסך מעברי סידן יחסיים בזמן אמת.

5. ניתוח נתונים

  1. כדי לנתח את הנתונים, לחץ על CytoSolver בשולחן העבודה.
  2. לחץ על ייבוא ובחר את הקבצים לניתוח.
  3. לאחר שהתוכנית ביצעה את הניתוח, התבוננו בארעיים המקובלים (כחולים) והדחויים (אדומים) המופיעים על המסך (איור 1A).
    הערה: כאן, נעשה שימוש בקריטריוני הדחייה הבאים המוגדרים כברירת מחדל, המוגדרים על-ידי יחס אות לרעש (SNR) והתאמה טובה (R 2): R 2 > 0.9 ו-SNR > 4 עבור מעברי התכווצות, ו-R2 > 0.5 ו-SNR >-3 עבור מעברי סידן. קריטריוני דחייה אלה יכולים להיות מותאמים על ידי המשתמש בהתאם לאיכות המדידות, איכות התאים והתוצאה העיקרית עבור החוקר. לדוגמה, אם העניין של החוקר הוא בעיקר קינטיקה הרפיה, ניתן להוריד את הקריטריונים לזמן למשתני שיא. אם מתקבלים מעברי סידן חזקים מאוד, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ה- SNR כדי לא לכלול נתונים רועשים יותר.
  4. לחץ על ייצוא וסמן את הנתונים הארעיים הממוצעים. בדוק את הנתונים המנותחים המוצגים בגיליון אלקטרוני.
  5. כבה את המחשב ואת כל המכשירים האחרים.

Representative Results

בעקבות פרוטוקול זה, בוצעו מדידות של התכווצות, Ca2+ transients, ותגובה לתרכובת ב- hiPSC-CMs. על ידי שימוש במערכת מדידה מבוססת אופטיקה זו, ניתן היה פשוט לצפות מחדש hiPSC-CMs על הלוחות הנדרשים, וניתן היה לבצע את מדידות ההתכווצות. ההתכווצות נמדדת באזור עניין (ROI) של 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר בקצב של 250 פריימים לשנייה על-ידי חישוב מתאם הפיקסלים ביחס למסגרת ייחוס. מסגרת הייחוס מזוהה באופן אוטומטי על-ידי המערכת בדיאסטולה הסופית. במקביל למדידות ההתכווצות, נרשם ארעי סידן רציומטרי.

במחקר זה, שלושה סבבי התמיינות שונים שימשו כשלושה שכפולים ביולוגיים. עבור כל אצווה של בידול, שלוש בארות נמדדו כהעתקים טכניים. מחקר זה בוצע באמצעות לוחות של 24 בארות, ונמדדו 10 אזורים בתוך כל באר. לאחר המדידות, תוכנית CytoSolver שימשה לניתוח מיידי של הנתונים. דווח על הפרמטרים הבאים: תדירות פעימות המנוחה, TP. קון, ושחפת. Con80 של hiPSC-CMs הבקרה (איור 2A-C). כדי להמחיש את השתנות הנתונים עבור כל פרמטר שהוזכר, המדידות בתוך כל באר והערכים הממוצעים של שלוש בארות עבור כל סבב של דיפרנציאציה מוצגים כחלקות-על10. כדי להעריך טוב יותר את השתנות הנתונים עבור כל סבב בידול ובין שלושת הסבבים, חושב מקדם השונות (איור 2D) עבור כל פרמטר. כפי שניתן לראות באיור 2D, הערכים של שכפולים טכניים המתאימים לשכפול ביולוגי אחד נמצאים בטווח קרוב מאוד זה לזה (כלומר, מקדם שונות נמוך), מה שממחיש את החוסן של שיטה זו.

יישום זה מתאים מאוד לבדיקת השפעות התרופה. כאן נבדקה ההשפעה של ISO 500 ננומטר, אגוניסט קולטן β-אדרנרגי לא סלקטיבי, על התכווצות הבקרה hiPSC-CMs. תרכובת זו ידועה כמגבירה את קצב הלב ומפעילה השפעה לוסיטרופית חיובית. כפי שמתואר באיור 3A, ISO הגדיל באופן משמעותי את תדירות המכות בכל הבארות. ISO גם הגביר את הקינטיקה, המתבטאת בירידה ב- TP. קון ושחפת. קון80 (איור 3B,C). בסך הכל, עם הדגירה עם ISO, תדירות המכות הוגברה משמעותית בכל הבארות, יחד עם קיצור זמן ההתכווצות וההרפיה, מה שהצביע על כך שהתגובה הצפויה לתרכובת זו נרשמה על ידי פלטפורמה זו.

במקביל למדידות ההתכווצות, בוצעו גם מדידות סידן. באותו אופן כמו נתוני התכווצות (איור 2), נתוני מדידת הסידן של hiPSC-CMs מתוארים באיור 4. TB.Ca80 איטי במידה ניכרת מאשר בקרדיומיוציטים מבודדים של חולדות או עכברים, דבר המוסבר בחלקו על ידי הבדלי מינים וקצב לב11, כמו גם על ידי טיפול בסידן לא בשל ב- hiPSC-CMs עקב דינמיקה נמוכה יותר של סידן בתוך הרשתית הסרקופלזמית וביטוי נמוך יותר של חלבונים המטפלים בסידן בהשוואה לתאים ראשוניים12. בדומה לנתוני ההתכווצות, חושב מקדם השונות למדידות סידן, והוא מראה שונות נמוכה בתוך ההעתקים הטכניים והביולוגיים (איור 4C).

Figure 1
איור 1: שימוש מיידי בכלי ניתוח הארעי CytoSolver לאחר הניסוי כדי לנתח את הנתונים. (A) דוגמה לארעיים המקובלים (כולם בכחול) של אזור אחד הנמדד בתוך באר. לוח A1 מתאר את הארעיות המתכווצת. לוח A2 מייצג את מעברי הסידן. (B) התכווצות ארעית ממוצעת המתקבלת ממדידות בשלוש בארות של סבב התמיינות אחד. מכל ארעי יחיד או ממוצע, נתונים מנקודות זמן שונות עד לשיא (TP. Con) וזמן לבסיס (TB. חסרונות) של התכווצות ארעית ניתן לחלץ. מכיוון שלא תמיד ניתן לקבוע באופן חד משמעי את תחילת ההתכווצות, הזמן לשיא של 20% נלקח כנקודת המוצא למדידות של זמן לשיא. באופן דומה, קשה להעריך את הרגע המדויק שבו האות חוזר לקו הבסיס. לכן, זמן הבסיס 80% משמש לתיאור זמן הרפיה. הנה, TP. קון (זמן לשיא - זמן לשיא 20%) ושחפת. Con80 (זמן לבסיס 80% - זמן לשיא) משמשים. (C) נתונים ארעיים ממוצעים של סידן המתקבלים ממדידות בשלוש בארות של סבב התמיינות אחד. מכל מעבר סידן יחיד או ממוצע, ניתן להפיק נתונים מנקודות זמן שונות לשיא (TP.Ca) וזמן לקו הבסיס (TB.Ca) של מעברי סידן. עבור מדידות זמן לשיא, נקודת ההתחלה היא זמן לשיא של 20%, ועבור זמן לקו הבסיס, נקודת הסיום היא זמן לקו הבסיס של 80%. במחקר זה, נעשה שימוש ב- TP.Ca (זמן לשיא - זמן לשיא 20%) ו- TB.Ca 80 (זמן לקו הבסיס 80% - זמן לשיא). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מדידות התכווצות בסיסיות שבוצעו בשלושה סבבי התמיינות שונים. שלושה משכפלים ביולוגיים ושלוש בארות לכל סבב התמיינות (כלומר, שלושה שכפולים טכניים). שלושה סמלים עיקריים לכל סבב בידול מייצגים את הערך הממוצע של האזורים הנמדדים (סמלי הרקע בצבעים דהויים) בתוך כל באר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. נתונים לגבי תדירות פעימות מנוחה מיוצגים בהרץ, ועבור TP. קון ושחפת. קון80, הנתונים הם בשניות. (A) תדירות פעימות במנוחה. (B) זמן לשיא (TP. קון). (C) זמן לבסיס 80% (שחפת. קון80). (ד) כדי להעריך את השונות בין הנתונים שהתקבלו בכל סבב ובין כל שלושת סבבי הדיפרנציאציה, חושב מקדם אחוז השונות באמצעות הערכים הממוצעים של כל באר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידות התכווצות בקו הבסיס (-) ולאחר הדגירה עם ISO (+) על שלוש בארות משלושה סבבי התמיינות. (A) תדירות פעימות המנוחה (-) ותדירות המכות לאחר הדגירה עם ISO של 500 ננומטר (+). (B) זמן לשיא (TP. חסרונות) מדידות בנקודת ההתחלה ולאחר הדגירה עם ISO. (C) זמן לבסיס 80% (שחפת. Con80) מדידות בנקודת ההתחלה ולאחר הדגירה עם ISO. כדי להעריך את ההשפעה של ISO על הפרמטרים התכווצות, Anova דו כיווני עם תיקון Bonferroni בוצע. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. נתונים לגבי תדירות פעימות מנוחה מיוצגים בהרץ, ועבור TP. קון ושחפת. קון80, הנתונים מיוצגים בשניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מדידות בסיסיות של סידן ארעי שבוצעו בשלוש בארות משלושה סבבי התמיינות שונים. (A) זמן לשיא (TP.Ca) ו-(B) זמן לקו הבסיס של 80% (TB.Ca80) ממעברי הסידן. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. TP.Ca ו-TB.Ca- 80 הנתונים מיוצגים תוך שניות. (ג) כדי להעריך את השונות בין הנתונים שהתקבלו בכל סבב ובין כל שלושת סבבי הדיפרנציאציה, חושב מקדם אחוז השונות לפי הערך הממוצע של כל באר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במחקר זה מתוארת שיטה לביצוע מדידות התכווצות וסידן חולפות על hiPSC-CMs ולחקור את ההשפעה של גורמי סטרס/תרופות על תאים אלה. מדידות התכווצות, מדידות סידן יחסיות והתגובה ל-ISO בוצעו בשלושה סבבי התמיינות שונים כשכפולים ביולוגיים. עבור כל העתק ביולוגי, בוצעו מדידות על שלוש בארות כאשר השכפול הטכני. הסיבה לביצוע המדידות בדרך זו הייתה כדי להבטיח שניתן יהיה להעריך את השונות הביולוגית ואת השונות הטכנית של הדגימה והפלטפורמה. מלבד התחשבות במספר המתאים של שכפולים ביולוגיים וטכניים, מצב הרבייה hiPSC-CM יכול למלא תפקיד חשוב להשגת תוצאות קבועות וחזקות. חשוב להיות עקביים עם קריטריונים, כגון גיל hiPSC-CMs, הרכב בינוני, תנאי ציפוי מחדש, וזמן הדגירה המורכבת במהלך המדידות. במחקר זה, נדרשו בממוצע 568 ± 24 שניות כדי למדוד 11 אזורים פעמיים במשך 10 שניות בבאר אחת. זה כולל זמן דגירה ISO של 79 ± 11 שניות. זה מסתכם בערך 10 דקות לכל באר, מה שאמור לאפשר לחוקרים למדוד צלחת מלאה של 24 בארות ב~4 שעות. בקרת האקלים משמשת לשמירה על CO2 יציב. זה מאפשר למדוד את ההשפעה של תרכובות / גורמי עקה על hiPSC-CMs במהירות גבוהה.

כדי למדוד את תפקוד ההתכווצות של iPSC-CMs, קיימות מספר מערכות המסתמכות על אופטוגנטיקה13 או מיקרוסקופיה מבוססת וידאו ללא תוויות 5,6. מערכות אופטוגנטיקה הן מורכבות למדי ודורשות טכניקות מיוחדות כדי להשיג נתונים אלקטרופיזיים ו / או התכווצות. מערכות אחרות מסתמכות על ניתוח פוסט-הוק של סרטונים, הדורש אחסון רב וחסר משוב ישיר במהלך רכישת וידאו. בנוסף, קשה להשיג רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת, מה שעלול לגרום לתת-דגימה. באופן דומה, hiPSC-CMs ערוכים על ידי CRISPR/CAS-9 עם כתבים פלואורסצנטיים7 עלולים לגרום להשפעות לא רצויות על התנהגות קרדיומיוציטים. השימוש בצבעים פלואורסצנטיים למדידות התכווצות-הרפיה הוא גם גישה אלגנטית, אך מגביל ביצוע ניסויים על אותה דגימה על פני תקופה ארוכה יותר14.

פלטפורמת מדידה מבוססת אופטיקה זו, לעומת זאת, יכולה לשמש למדידת זמני התכווצות-הרפיה ללא שימוש בצבע פלואורסצנטי או בשיטות פולשניות. עם זאת, מכיוון שמתאם פיקסלים אינו מספק מידע מרחבי, לא ניתן להשתמש בשיטה זו כדי למדוד את עוצמת ההתכווצות, אלא רק לזהות באופן אמין שינויים במהירות ההתכווצות וההרפיה. מערכת המדידה שהוצגה היא מבוקרת טמפרטורה ויכולה לקבל נתוני סידן והתכווצות בזמן אמת ברזולוציה של >200 פריימים לשנייה. בנוסף, נשמר המיקום של כל מדידה, מה שמאפשר מדידות זוגיות, ובכך מגדיל את עוצמת הניסויים. יתר על כן, פלטפורמה זו מספקת לחוקרים את היכולת לאחסן נתונים ולנתח אותם מיד לאחר הניסוי. בסך הכל, מערכת מדידה מבוססת אופטיקה זו מתגלה כשיטה מבטיחה לחקר פתומנגנונים תאיים, יכולה להעריך את ההשפעה של תרכובות על הפונקציונליות של hiPSC-CMs, ויכולה לעזור בתהליך הפרה-קליני בסינון תרופות.

Disclosures

EM הוא עובד של CytoCypher BV. MH הוא מנכ"ל CytoCypher BV. שאר המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgments

מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK), ומענק NWO-VICI 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 195

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

מדידות בזמן אמת של פרמטרים של סידן והתכווצות בקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter