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Summary
여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 심근 세포 기능의 돌연변이 매개 변화를 연구하고 스트레스 요인 및 약물 개입의 효과를 정의하기 위한 강력한 도구입니다. 이 연구에서는 이 광학 기반 시스템이 2D에서 hiPSC-CM의 기능 매개변수를 평가하는 강력한 도구임을 입증했습니다. 이 플랫폼을 사용하면 서로 다른 플레이트 레이아웃의 잘 보존된 온도 환경에서 쌍을 이루는 측정을 수행할 수 있습니다. 또한 이 시스템은 연구원에게 즉각적인 데이터 분석을 제공합니다.
이 논문은 변형되지 않은 hiPSC-CM의 수축성을 측정하는 방법을 설명합니다. 수축 동역학은 250Hz 샘플링 주파수에서 이완 시 취한 기준 프레임에 대한 픽셀 상관 관계 변화를 기반으로 37°C에서 측정됩니다. 또한, 세포 내 칼슘 과도 현상의 동시 측정은 Fura-2와 같은 칼슘 민감성 형광단을 세포에 로딩하여 얻을 수 있습니다. 하이퍼스위치를 사용하면 수축성 측정 면적에 해당하는 50μm 직경의 조명 스폿에서 비율계량 칼슘 측정을 수행할 수 있습니다.
Introduction
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 2019년 심혈관 질환으로 인해 전 세계적으로 1,860만 명이 사망했으며, 이는 지난 10년 동안 17.1% 증가한 수치입니다1. 심부전을 예방하고 치료하기 위한 약물 표적을 식별하려는 연구자들의 노력에도 불구하고 환자 결과는 여전히 좋지 않습니다2. 인간에 대한 동물 모델의 병태생리학의 차이는 심부전 치료의 최적화에 대한 제한된 성공의 근본적인 요인 중 하나일 수 있다3. 질병을 모델링하고 신약 화합물의 독성과 유효성을 테스트하기 위해 추가적인 인간 유사 모델이 보증됩니다.
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CMs)는 스트레스 요인, 허혈, 대사 변화 또는 병원성 유전자 변이에 의해 유도되는 세포 병리 기전과 약물 중재의 효과 및 독성을 정의하는 강력한 도구이다4. hiPSC-CM의 기능적 특성에 대한 영향을 정의하기 위해 세포 수축의 수축기 및 이완기 특성을 편향되지 않고 재현 가능한 방식으로 측정하는 고속 시스템이 보장됩니다. 현재 연구의 전반적인 목표는 광학 기반 시스템이 hiPSC-CM의 기능 매개변수에 대한 실시간 분석을 수행하는 강력한 도구임을 입증하는 것입니다.
현재 hiPSC-CM의 수축성을 평가하기 위한 여러 플랫폼이 있습니다. 그러나 현재 시스템은 판독 속도가 느리거나 필요한 셀 수가 문제가 될 수 있습니다. 라벨이 없는 비디오 측정 시스템(5,6)은 비디오의 사후 분석에 의존하는데, 이는 많은 저장 공간을 필요로 하고 비디오 획득 동안 직접적인 피드백이 부족합니다. 또한 충분한 시간 및 공간 해상도를 달성하기가 어려우며 언더샘플링이 발생할 수 있습니다. 형광 리포터를 사용한 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 편집 hiPSC-CM7과 같은 심근세포 특성을 측정하는 다른 방법은 세포의 유전자 안정성을 방해할 수 있으며 전문 실험실 전문 지식이 필요합니다.
위에서 언급한 한계를 극복하기 위해 이 연구에서는 고유한 광학 기반 측정 시스템을 개발하여 도입했습니다. 이 플랫폼은 플레이트 크기에 대한 제한 없이 필요한 플레이트 형식으로 간단히 재도금하여 수정되지 않은 hiPSC-CM에 대한 수축성 측정을 가능하게 합니다. 또한 실시간 측정을 통해 hiPSC-CM의 기능 파라미터를 직접 관찰하고 분석할 수 있으므로 프로토콜을 즉시 조정하고 최적화할 수 있는 실험 환경을 제공합니다. 또한 각 측정의 위치가 저장되므로 동일한 샘플에서 쌍을 이루는 측정이 가능하므로 실험의 성능이 향상됩니다.
광학 기반 시스템을 시연하기 위해 대조군 hiPSC-CM 라인에서 수축성 측정을 수행했습니다. 이 대조군 hiPSC 라인은 정상 핵형을 가진 건강한 남성 기증자의 진피 섬유아세포로부터 생성되었다8. 수축 동역학은 250Hz 샘플링 주파수에서 이완 동안 취해진 기준 프레임에 대한 픽셀 상관 관계 변화를 기반으로 37°C에서 측정되었습니다. 수축의 정확한 시작을 항상 명확하게 결정할 수는 없기 때문에 피크 높이의 20%에 도달한 시점(피크까지의 시간 20%)을 피크까지의 시간 측정의 시작점으로 삼았습니다. 이렇게 하면 한 샘플 내에서 이 매개변수에 대한 변동성이 더 적게 발견되었습니다. 유사하게, 신호가 베이스라인으로 복귀하는 정확한 순간을 평가하기 어렵기 때문에, 피크로부터 베이스라인으로의 복귀의 80%에 도달하는 데 걸린 시간(기준선까지의 시간 80%)을 완화 시간을 설명하기 위해 사용하였다.
전체 수축성 측정에는 안정시 박동 빈도, 20% 피크에서 피크 수축까지의 시간(TP. Con), 피크 수축에서 기준선의 80%까지의 시간(TB. 단점80) (그림 1B). 스트레스 요인의 효과를 테스트하기 위해 세포를 이소프레날린(ISO)과 함께 배양했습니다. 또한, 수축성 측정과 우연히도, 250Hz의 샘플링 주파수에서 Fura-2-아세톡시메틸 에스테르(Fura-2 AM)로 세포를 로딩함으로써 Ca2+ 과도 현상을 측정하였다. 하이퍼스위치를 이용한 비율계량적Ca2+ 측정(9)은 수축성 측정의 영역에 대응하는 50 μm 직경의 조명 영역 상에서 수행되었다. Ca2+ 측정 데이터는Ca2+ 과도기(TP.Ca)의 피크에서 80%까지의 시간(TB.Ca 80) 및 베이스라인의 20% 피크에서 피크까지의 시간(80)으로 묘사된다(도 1C). 빠른 자동 데이터 분석 도구를 사용하여 각 영역에 대한 평균 수축 및 칼슘 동역학 매개변수를 산출했습니다.
Protocol
1. 세포배양액 및 시약의 제조
- 49mL의 RPMI1640에 1mL의 B27 보충제(50x)를 추가하여 hiPSC-CM 배지를 준비합니다.
- 먼저 45mL의 hiPSC-CM 배지에 5mL의 녹아웃 혈청 대체물을 추가하여 재도금 배지를 준비합니다. 그런 다음 22.5 μL의 Y-27632 ROCK 억제제 (1 : 2,000 희석, 스톡 농도 : 10 mM)를 추가하고 완전히 혼합합니다.
- 아래 설명과 같이 기저막 코팅 플레이트를 준비합니다.
- 기저막 바이알을 냉장고나 아이스박스에서 밤새 해동합니다.
- 적절한 양의 Dulbecco's modified Eagle's medium/Ham's F12(DMEM/F12)로 기저막을 희석합니다. 기저막의 각 배치는 농도가 다르기 때문에 1mg/1mL 희석에 도달하는 데 필요한 DMEM/F12의 양을 계산합니다. -20 °C에서 보관하기 위해 0.5 또는 1 mL 분취량을 만듭니다.
알림: 1.3.2단계는 플로우 후드 내부의 얼음 위에서 수행해야 합니다. - 기저막 0.5mL 분취량을 해동하고 6mL의 DMEM/F12로 희석합니다. 철저히 섞는다.
- 24웰 플레이트에 희석된 기저막/웰 250μL를 피펫팅하여 플레이트를 코팅합니다. 다양한 플레이트 형식에 대한 각 웰의 표면적을 기준으로 계산합니다(예: 6웰 플레이트에서 1mL/웰).
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- Fura-2 AM을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 Fura-2 AM 분취액을 제조하고, 제조사 매뉴얼에 따라 1 mM 분취량을 제조하였다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
2. hiPSC-CM 배양
- hiPSC-CM 바이알을 37°C 수조에서 해동합니다. 바이알의 해동된 내용물을 15mL 튜브로 옮깁니다. 재도금 배지 10mL를 적가하여 세포에 첨가한다.
- 세포를 100 × g에서 5 분 동안 원심 분리한다.
- 상층액을 제거하고 재도금 배지 1mL를 추가합니다. 펠릿을 다시 현탁하고 세포 덩어리를 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 합니다.
- 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 배양된 플레이트에서 기저막을 제거하고 재도금 매체로 교체합니다.
- 기저막으로 코팅된 6/12/24/48/96-웰 플레이트(예: 24-웰 플레이트에서 250,000개 세포/웰)에 적절한 세포 밀도로 세포를 플레이트합니다.
참고: Ca2+ 과도 실험의 경우 유리 바닥 플레이트에 셀을 플레이트합니다. - 다음날 배지를 hiPSC-CM 배양 배지로 교체한 후 24웰 플레이트에서 0.5mL/웰을 사용하여 격일로 배지를 새로 고칩니다.
- hiPSC-CM이 해동 및 재도금에서 회복되면 수축성 측정을 수행합니다(이 프로토콜에서 재도금 후 3-5일).
참고: 고르지 않은 셀 재도금의 경우, 셀 그룹이 재도금된 셀의 나머지 부분과 접촉하지 않고 불규칙하거나 동기화되지 않은 박동 패턴을 보일 수 있습니다. 비동기를 피하기 위해, 각 웰에 세포의 균일 한 분포와 hiPSC-CM의 동기화 된 잘 연결된 단층을 갖는 것이 좋습니다.
3. 수축성 측정
- 광학 기반 측정 시스템, 현미경 발광 다이오드(LED) 광원 및 컴퓨터를 켭니다( 재료 표 참조).
- 프로그램을 열고 새 파일을 엽니다. 화면 왼쪽 상단의 File(파일 )에서 New( 새로 만들기)를 클릭합니다.
- 수집을 클릭하고 실험을 선택한 다음 "iPSC + 칼슘"을 선택합니다.
- 실내 온도 조절 장치를 켭니다. 온도를 37°C로 설정하고CO2 수준을 5%로 설정합니다.
- hiPSC-CM 배양 배지를 Tyrode 용액(24웰 플레이트에서 0.5mL/웰)으로 교체합니다. 플레이트 뚜껑을 실내 온도 조절 장치 뚜껑으로 교체하십시오.
알림: 칼슘 과도 측정을 수행해야 하는 경우 섹션 2에 설명된 대로 세포에 Fura-4 AM을 로드합니다. - 온도 조절 장치가 온도가 37°C임을 나타내면 광학 기반 측정 시스템 내부에 플레이트를 놓습니다.
참고: 수축은 명시야 조건을 사용하여 측정됩니다. - 도구 모음 아래에서 셀 찾기 열기 를 클릭하고 새 화면이 나타날 때까지 기다립니다. 화면 오른쪽 상단에서 플레이트 형식 과 웰을 선택합니다.
- 하나의 웰을 선택하고 웰 내의 영역을 선택하여 동기화된 수축 및 이완을 관찰하고 시작을 누르고 측정 추가를 클릭합니다. 설정에서 측정 기간을 선택합니다(영역당 10초). 비동기식 수축 측정값을 즉시 폐기하고 새 영역을 선택합니다.
참고: 실시간 수축성 과도 현상은 모니터에서 볼 수 있습니다. 동기화된 수축의 경우 부드러운 연속 과도 현상이 관찰되는 반면 비동기식 수축의 경우 작은 추가 피크가 관찰됩니다. - 우물의 크기에 따라 우물 내의 여러 영역을 측정합니다. 예를 들어, 이 연구를 수행하려면 24웰 플레이트에서 웰당 10개의 영역을 측정합니다. 기준 측정만 필요하고 화합물을 테스트할 계획이 없는 경우 3.13단계부터 계속하십시오.
- 웰 내의 영역을 측정한 후 완료를 누르고 광학 기반 측정 기기를 열어 웰에 응력 요인/화합물을 추가합니다(예: 티로드에 용해된 500nM ISO).
- 관심 화합물에 따라 배양 시간을 선택합니다(이 프로토콜에서 ISO로 2분).
- 자동 측정을 클릭하면 광학 기반 측정 기기가 기준선 측정이 수행된 동일한 영역에서 측정을 수행할 수 있으므로 웰 내에서 쌍을 이루는 측정이 가능합니다.
- 웰의 모든 측정이 수행되면 완료 를 누릅니다.
- 화면 오른쪽 상단에서 다음 우물을 선택합니다.
- 필요한 모든 웰에 대한 측정을 계속합니다.
- 필요한 모든 웰이 측정되면 중지 를 클릭하고 파일을 저장합니다.
알림: 기후 제어는 안정적인 CO2를 유지하는 데 사용됩니다. 이를 통해 hiPSC-CM에 대한 화합물/스트레스 요인의 영향을 고속 방식으로 측정할 수 있습니다.
4. 칼슘 과도 측정
- 37°C 티로드 용액을 준비합니다.
- Fura-2 AM 분취량을 Tyrode 용액에 용해시켜 1μM Fura-2 AM의 최종 농도가 세포에 추가되도록 합니다.
알림: Fura-2 AM을 사용하는 동안 빛 노출을 최소화하기 위해 흐름 후드의 조명이 꺼져 있는지 확인하십시오. - 배지를 흡인하고 Fura-2 AM이 포함된 Tyrode 용액으로 교체합니다.
- 인큐베이터 또는 광학 기반 측정 시스템에서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- Fura-2 AM이 포함된 Tyrode 용액을 제거한 다음 새 Tyrode 용액으로 2번 세척합니다. 마지막으로, Fura-2 AM의 탈에스테르화를 허용하기 위해 37°C에서 또 다른 5분 동안 Tyrode 용액에서 세포를 배양합니다.
- 광학 기반 측정 시스템 내부에 플레이트를 놓고 섹션 3에 설명된 대로 측정을 시작합니다.
참고: 4.6단계에서. 수축 측정과 동시에 측정을 시작함으로써 비율계량 칼슘 과도 현상이 기록됩니다: 100 μm 지점에서 340 nm 및 385 nm에서의 여기; 510 ± 40 nm에서 수집 된 방출. 수축성 추적 외에도 실시간 비율계량 칼슘 과도 현상이 화면에 나타납니다.
5. 데이터 분석
- 데이터를 분석하려면 바탕 화면에서 CytoSolver 를 클릭합니다.
- 가져오기를 클릭하고 분석할 파일을 선택합니다.
- 프로그램이 분석을 수행한 후 화면에 나타나는 허용된(파란색) 과도현상과 거부된(빨간색) 과도 현상을 관찰합니다(그림 1A).
참고: 여기서는 신호 대 잡음비(SNR) 및 적합도(R 2)로 정의된 다음과 같은 기본 거부 기준이 사용되었습니다: 수축 과도 현상에 대해 R 2 > 0.9 및 SNR > 4, 칼슘 과도 현상에 대해 R2 > 0.5 및 SNR > 3. 이러한 거부 기준은 측정 품질, 세포 품질 및 연구자의 주요 결과에 따라 사용자가 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 연구자의 관심이 주로 이완 동역학 인 경우, 피크 변수까지의 시간에 대한 기준을 낮출 수 있습니다. 매우 강한 칼슘 과도 현상이 얻어지면 잡음이 더 많은 데이터를 제외하기 위해 SNR을 증가시켜야 할 수 있습니다. - 내보내기를 클릭하고 평균 과도 데이터를 선택합니다. 스프레드시트에 표시된 분석된 데이터를 검사합니다.
- 컴퓨터와 다른 모든 악기를 끕니다.
Representative Results
이 프로토콜에 따라 수축성,Ca2+ 과도 현상 및 hiPSC-CM의 화합물에 대한 반응의 측정이 수행되었습니다. 이 광학 기반 측정 시스템을 사용함으로써 hiPSC-CM은 필요한 플레이트에 간단히 재도금될 수 있으며 수축성 측정이 수행될 수 있습니다. 수축성은 100μm x 100μm 관심 영역(ROI)에서 초당 250프레임으로 기준 프레임에 대한 픽셀 상관 관계를 계산하여 측정됩니다. 참조 프레임은 이완기 말기에 시스템에 의해 자동으로 감지됩니다. 수축 측정과 동시에 비율계량 칼슘 과도 현상이 기록됩니다.
이 연구에서는 세 가지 다른 분화 라운드가 세 가지 생물학적 복제물로 사용되었습니다. 분화의 각 배치에 대해 3개의 웰을 기술 복제물로 측정했습니다. 본 연구는 24-웰 플레이트를 사용하여 수행하였으며, 각 웰 내의 10개 영역을 측정하였다. 측정 후 CytoSolver 프로그램을 사용하여 데이터를 즉시 분석했습니다. 다음 매개변수가 보고되었습니다: 휴식 박동 빈도, TP. 죄수, 그리고 결핵. 대조군 hiPSC-CMs의 Con80 (도 2A-C). 언급된 각 파라미터에 대한 데이터의 가변성을 시각화하기 위해, 각 웰 내의 측정값과 각 분화 라운드에 대한 3개의 웰의 평균값이 수퍼플롯(superplot)10으로 제시된다. 각 차별화 라운드와 3라운드 간의 데이터 변동성을 더 잘 평가하기 위해 각 매개변수에 대한 분산 계수(그림 2D)를 계산했습니다. 그림 2D에서 볼 수 있듯이 하나의 생물학적 복제에 해당하는 기술 복제의 값은 서로 매우 가까운 범위(즉, 낮은 분산 계수) 내에 있으며, 이는 이 방법의 견고성을 보여줍니다.
이 응용 프로그램은 약물 효과를 테스트하는 데 매우 적합합니다. 여기서, 비선택적 β-아드레날린 수용체 작용제인 500 nM ISO가 대조군 hiPSC-CMs의 수축성에 미치는 영향을 실험하였다. 이 화합물은 심박수를 증가시키고 긍정적인 윤활 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 ISO는 모든 웰에서 박동 주파수를 크게 증가 시켰습니다. ISO는 또한 동역학을 증가시켰는데, 이는 TP의 감소에서 분명합니다. 죄수와 결핵. 단점80 (그림 3B, C). 전반적으로, ISO로 배양 할 때, 수축 및 이완 시간의 감소와 함께 모든 웰에서 박동 빈도가 유의하게 증가했으며, 이는이 화합물에 대한 예상 반응이이 플랫폼에 의해 등록되었음을 나타냅니다.
수축성 측정과 병행하여 칼슘 측정도 수행되었습니다. 수축성 데이터(그림 2)와 동일한 방식으로 hiPSC-CM의 칼슘 측정 데이터가 그림 4에 나와 있습니다. TB.Ca(80 )은 분리된 쥐 또는 생쥐의 심근 세포보다 상당히 느리며, 이는 부분적으로 종과 심박의 차이에 의해 설명되며11, 근질 세망 내의 낮은 칼슘 역학 및 일차 세포에 비해 칼슘 전달 단백질의 발현이 낮기 때문에 hiPSC-CM의 미성숙 칼슘 처리에 의해 설명된다12. 수축성 데이터와 유사하게, 칼슘 측정에 대한 분산 계수가 계산되었으며, 기술적 및 생물학적 복제 내에서 낮은 변동성을 보여줍니다(그림 4C).
그림 1: 실험 후 CytoSolver 과도 분석 도구를 즉시 사용하여 데이터를 분석합니다. (A) 우물 내에서 측정된 한 영역의 허용된 과도 현상(모두 파란색)의 예입니다. 패널 A1은 수축 과도 현상을 나타냅니다. 패널 A2는 칼슘 과도현상을 나타낸다. (B) 1라운드의 분화의 3개 웰에서 측정하여 얻은 평균 수축성 일시적. 각 단일 또는 평균 과도 상태에서 서로 다른 시점의 데이터에서 피크(TP. Con) 및 기준선까지의 시간(TB. Con) 과도수축의 수축성을 추출할 수 있었다. 수축의 정확한 시작을 항상 명확하게 결정할 수는 없기 때문에 피크까지의 시간 20%를 피크까지의 시간 측정의 시작점으로 삼습니다. 마찬가지로, 신호가 베이스라인으로 돌아오는 정확한 순간을 평가하기는 어렵습니다. 따라서 기준선 80%까지의 시간은 이완 시간을 설명하는 데 사용됩니다. 여기, TP. 단점(피크까지의 시간 - 피크까지의 시간 20%) 및 TB. 단점 80(기준선까지의 시간80% - 피크까지의 시간)이 사용됩니다. (C) 1라운드의 분화에 대해 3개의 웰에서 측정하여 얻은 평균 칼슘 과도 데이터. 각 단일 또는 평균 칼슘 과도 현상에서 칼슘 과도 현상의 피크 시간(TP.Ca) 및 기준선 도달 시간(TB.Ca)의 데이터를 추출할 수 있습니다. 피크 시간 측정의 경우 시작점은 피크 시간 20%이고 기준선 도달 시간의 경우 종료 시점은 기준선 도달 시간 80%입니다. 이 연구에서는 TP.Ca(피크까지의 시간 - 피크까지의 시간 20%) 및 TB.Ca 80(기준선까지의 시간 80% - 피크까지의 시간)을 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세 가지 다른 분화 라운드에서 수행된 기준선 수축성 측정. 각 분화 라운드에 대해 3개의 생물학적 복제물과 3개의 웰(즉, 3개의 기술적 복제). 각 분화 라운드에 대한 세 가지 주요 기호는 각 웰 내에서 측정된 영역(희미한 색상의 배경 기호)의 평균값을 나타냅니다. 데이터는 SEM± 평균으로 나타내었다. 안정시 박동 빈도에 관한 데이터는 Hertz 및 TP로 표시됩니다. 죄수와 결핵. 80에서 데이터는 초 단위입니다. (A) 안정시 박동 빈도. (B) 피크까지의 시간(TP. 단점). (C) 기준선까지의 시간 80%(TB. 단점80). (D) 각 라운드에서 얻은 데이터와 세 라운드 간의 차별화 사이의 변동을 평가하기 위해 각 웰의 평균값을 사용하여 분산 계수 백분율을 계산했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기준선(-)과 3회 분화에서 3개의 웰에서 ISO(+)로 배양한 후의 수축성 측정. (A) 안정시 박동 빈도(-) 및 500nM ISO(+)로 배양 후의 박동 빈도. (B) 피크까지의 시간(TP. Con) 기준선 및 ISO로 배양 후 측정. (C) 기준선까지의 시간 80%(TB. Con80) 기준선 및 ISO로 배양 후 측정. 수축성 매개변수에 대한 ISO의 효과를 평가하기 위해 Bonferroni 보정을 사용한 양방향 Anova를 수행했습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 안정시 박동 빈도에 관한 데이터는 Hertz 및 TP로 표시됩니다. 죄수와 결핵. 도80에 따르면, 데이터는 초 단위로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3차 분화에서 3개의 웰에서 수행된 기준선 칼슘 과도 측정. (A) 칼슘 과도현상의 최고점까지의 시간(TP.Ca) 및 (B) 기준선까지의 시간(TB.Ca80). 데이터는 SEM± 평균으로 나타내었다. TP.Ca 및TB.Ca 80 데이터는 초 단위로 표시된다. (C) 각 라운드에서 얻은 데이터와 세 라운드 간의 차별화 사이의 변동을 평가하기 위해 각 웰의 평균값을 사용하여 분산 계수 백분율을 계산했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구에서는 hiPSC-CM에 대한 수축성 및 칼슘 과도 측정을 수행하고 이러한 세포에 대한 스트레스 요인/약물의 영향을 연구하는 방법을 설명합니다. 수축성 측정, 비율계량 칼슘 측정 및 ISO에 대한 반응은 생물학적 복제물로서 세 가지 다른 분화 라운드에서 수행되었습니다. 각각의 생물학적 복제물에 대해, 측정은 기술적 복제물로서 3개의 웰에서 수행되었다. 이러한 방식으로 측정을 수행하는 이유는 샘플과 플랫폼의 생물학적 가변성과 기술적 가변성을 평가할 수 있도록 하기 위함이었습니다. 적절한 수의 생물학적 및 기술적 복제물을 고려하는 것 외에도 hiPSC-CM 배양 조건은 지속적이고 강력한 결과를 달성하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다. hiPSC-CM의 수명, 배지 구성, 재도금 조건 및 측정 중 화합물 배양 시간과 같은 기준과 일치하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 하나의 우물에서 10초 동안 11개 영역을 두 번 측정하는 데 평균 568초± 24초가 걸렸습니다. 여기에는 79초± 11초의 ISO 배양 시간이 포함됩니다. 이는 웰당 약 10분으로 줄어들며, 이를 통해 연구원들은 ~4시간 내에 전체 24웰 플레이트를 측정할 수 있습니다. 기후 제어는 안정적인 CO2를 유지하는 데 사용됩니다. 이를 통해 hiPSC-CM에 대한 화합물/스트레스 요인의 영향을 고속 방식으로 측정할 수 있습니다.
iPSC-CM의 수축 기능을 측정하기 위해, 광유전학(optogenetics)13 또는 비표지(label-free) 비디오 기반 현미경(video-based microscopy)5,6에 의존하는 몇 가지 기존 시스템이 있다. 광유전학 시스템은 매우 복잡하며 전기물리학 및/또는 수축성 데이터를 얻기 위해 특별한 기술이 필요합니다. 다른 시스템은 비디오의 사후 분석에 의존하므로 많은 저장 공간이 필요하고 비디오 획득 중에 직접적인 피드백이 부족합니다. 또한 충분한 시간 및 공간 해상도를 달성하기 어렵기 때문에 언더샘플링이 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 형광 리포터(fluorescent reporter)7가 있는 CRISPR/CAS-9 편집 hiPSC-CM은 심근 세포 행동에 원치 않는 영향을 미칠 수 있다. 수축-이완 측정을 위해 형광 염료를 사용하는 것도 우아한 접근 방식이지만, 동일한 샘플에 대해 장기간에 걸쳐 실험을 수행하는 것은 제한적이다14.
그러나 이 광학 기반 측정 플랫폼은 형광 염료나 침습적 방법을 사용하지 않고 수축-이완 시간을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 픽셀 상관은 공간 정보를 제공하지 않기 때문에 이 방법은 수축 강도를 측정하는 데 사용할 수 없으며 오히려 수축 및 이완 속도의 변화만 안정적으로 감지할 수 있습니다. 도입된 측정 시스템은 온도 제어가 가능하며 초당 >200프레임의 분해능으로 칼슘 및 수축성 데이터를 실시간으로 수집할 수 있습니다. 또한 각 측정의 위치가 저장되어 쌍을 이루는 측정이 가능하므로 실험의 검정력이 높아집니다. 또한 이 플랫폼은 연구원에게 데이터를 저장하고 실험 후 즉시 분석할 수 있는 기능을 제공합니다. 전반적으로, 이 광학 기반 측정 시스템은 세포 병리학 메커니즘을 연구하는 유망한 방법임을 보여주고, hiPSC-CM의 기능에 대한 화합물의 효과를 평가할 수 있으며, 약물 스크리닝의 전임상 과정에 도움이 될 수 있습니다.
Disclosures
EM은 CytoCypher BV의 직원입니다. MH는 CytoCypher BV의 CEO입니다. 나머지 저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Eurostars 보조금 Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) 및 NWO-VICI 보조금 91818602 (JV)에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
| B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
| KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
| Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
| MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
| Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |
References
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
- Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
- Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
- vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
- Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
- Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
- Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
- Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
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생물학 문제 195Erratum
Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:
Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine
to:
Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine
