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Biology

Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65326
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 4, 4, 1,2, 1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Qui, viene descritto un metodo consolidato per eseguire misurazioni della contrattilità e del calcio in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando una piattaforma basata sull'ottica. Questa piattaforma consente ai ricercatori di studiare l'effetto delle mutazioni e la risposta a vari stimoli in modo rapido e riproducibile.

Abstract

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CMs) rappresentano un potente strumento per studiare i cambiamenti mediati da mutazioni nella funzione dei cardiomiociti e definire gli effetti dei fattori di stress e degli interventi farmacologici. In questo studio, è dimostrato che questo sistema basato sull'ottica è un potente strumento per valutare i parametri funzionali di hiPSC-CM in 2D. Utilizzando questa piattaforma, è possibile eseguire misurazioni accoppiate in un ambiente di temperatura ben conservato su diversi layout di piastre. Inoltre, questo sistema fornisce ai ricercatori un'analisi istantanea dei dati.

Questo articolo descrive un metodo per misurare la contrattilità di hiPSC-CM non modificati. La cinetica di contrazione viene misurata a 37 °C in base alle variazioni di correlazione dei pixel rispetto a un sistema di riferimento preso al rilassamento a una frequenza di campionamento di 250 Hz. Inoltre, le misurazioni simultanee dei transitori intracellulari del calcio possono essere acquisite caricando la cellula con un fluoroforo sensibile al calcio, come Fura-2. Utilizzando un iperinterruttore, è possibile eseguire misurazioni raziometriche del calcio su un punto di illuminazione di 50 μm di diametro, corrispondente all'area delle misurazioni di contrattilità.

Introduction

L'insufficienza cardiaca è la principale causa di morte in tutto il mondo. Nel 2019, le malattie cardiovascolari hanno causato 18,6 milioni di decessi a livello globale, il che riflette un aumento del 17,1% negli ultimi dieci anni1. Nonostante gli sforzi dei ricercatori per identificare bersagli farmacologici per prevenire e curare l'insufficienza cardiaca, i risultati dei pazienti sono ancora scarsi2. La differenza nella fisiopatologia dei modelli animali rispetto all'uomo potrebbe essere uno dei fattori alla base del limitato successo per l'ottimizzazione della terapia dello scompenso cardiaco3. Ulteriori modelli simili all'uomo sono garantiti per modellare la malattia e testare la tossicità e l'efficacia di nuovi composti farmacologici.

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CMs) rappresentano un potente strumento per definire i meccanismi patologici cellulari indotti da fattori di stress, ischemia, metabolismo alterato o varianti genetiche patogene e l'efficacia e la tossicità degli interventi farmacologici4. Per definire gli effetti sulle proprietà funzionali delle hiPSC-CM, è necessario un sistema ad alta velocità che misuri le proprietà sistoliche e diastoliche delle contrazioni cellulari in modo imparziale e riproducibile. Questo obiettivo generale del presente studio è dimostrare che un sistema basato sull'ottica è un potente strumento per eseguire analisi in tempo reale dei parametri funzionali degli hiPSC-CM.

Attualmente, ci sono più piattaforme per valutare la contrattilità degli hiPSC-CM. Tuttavia, i sistemi attuali offrono una lettura lenta o il numero richiesto di celle potrebbe essere una sfida. I sistemi di misurazione video senza etichette5,6 si basano sull'analisi post-hoc dei video, che richiede molto spazio di archiviazione e manca di feedback diretto durante l'acquisizione video. Inoltre, una risoluzione temporale e spaziale sufficiente è difficile da raggiungere e può comportare un sottocampionamento. Altri metodi per determinare le proprietà dei cardiomiociti, come le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / Cas9-edited hiPSC-CMs7 con reporter fluorescenti potrebbero interferire con la stabilità genica delle cellule e richiedere competenze di laboratorio specializzate.

Per superare i limiti sopra menzionati, in questo studio è stato sviluppato e introdotto un sistema di misurazione basato sull'ottica unico. Questa piattaforma consente misurazioni di contrattilità su hiPSC-CM non modificati semplicemente riplaccandoli su qualsiasi formato di piastra richiesto, senza alcuna limitazione nelle dimensioni della piastra. Inoltre, le misurazioni in tempo reale consentono l'osservazione diretta e l'analisi dei parametri funzionali delle hiPSC-CM, fornendo quindi un'impostazione sperimentale per regolare e ottimizzare istantaneamente i protocolli. Inoltre, viene memorizzata la posizione di ciascuna misurazione, il che consente misurazioni accoppiate sullo stesso campione, aumentando così la potenza degli esperimenti.

Per dimostrare il sistema basato sull'ottica, sono state eseguite misurazioni di contrattilità su una linea di controllo hiPSC-CM. Questa linea di controllo hiPSC è stata generata dal fibroblasto dermico di un donatore maschio sano concariotipo 8 normale. La cinetica di contrazione è stata misurata a 37 °C, sulla base dei cambiamenti di correlazione dei pixel rispetto a un sistema di riferimento preso durante il rilassamento a una frequenza di campionamento di 250 Hz. Poiché l'inizio esatto della contrazione non può sempre essere determinato in modo univoco, il punto temporale in cui è stato raggiunto il 20% dell'altezza del picco (tempo al picco 20%) è stato preso come punto di partenza per le misurazioni del tempo al picco. In questo modo, è stata riscontrata una minore variabilità per questo parametro all'interno di un campione. Allo stesso modo, poiché il momento esatto in cui il segnale ritorna alla linea di base è difficile da valutare, il tempo necessario per raggiungere l'80% del ritorno alla linea di base dal picco (tempo al basale 80%) è stato utilizzato per descrivere il tempo di rilassamento.

Le misurazioni complessive della contrattilità includevano le frequenze di battito a riposo, il tempo dal picco del 20% alla contrazione del picco (TP. Con), e il tempo dalla contrazione del picco all'80% del basale (TB. Con80) (Figura 1B). Per testare l'effetto di un fattore di stress, le cellule sono state incubate con isoprenalina (ISO). Inoltre, in coincidenza con le misure di contrattilità, i transitori Ca 2+ sono stati misurati caricando le celle con estere Fura-2-acetossimetil (Fura-2 AM) ad una frequenza di campionamento di 250 Hz. Le misurazioni raziometriche Ca2+ 9 utilizzando un iperinterruttore sono state eseguite su un'area di illuminazione di 50 μm di diametro, corrispondente all'area delle misurazioni di contrattilità. I dati di misurazione di Ca 2+ sono rappresentati come il tempo dal picco del 20% al picco nel transitorio Ca2+ (TP.Ca) e il tempo dal picco all'80% della linea di base (TB.Ca80) (Figura 1C). È stato utilizzato uno strumento di analisi dei dati rapido e automatico per produrre parametri contrattili e cinetici di calcio medi per ciascuna area.

Protocol

1. Preparazione di terreni di coltura cellulare e reagenti

  1. Preparare i supporti hiPSC-CM aggiungendo 1 mL di supplemento B27 (50x) a 49 mL di RPMI1640.
  2. Preparare il mezzo di riplaccatura aggiungendo prima 5 ml di siero knockout sostitutivo a 45 mL di mezzo hiPSC-CM. Quindi, aggiungere 22,5 μL di inibitore ROCK Y-27632 (diluizione 1:2.000; concentrazione di magazzino: 10 mM) e mescolare accuratamente.
  3. Preparare piastre rivestite di membrana basale come descritto di seguito:
    1. Scongelare una fiala di membrana basale durante la notte in frigorifero o su una ghiacciaia.
    2. Diluire la membrana basale con una quantità appropriata di terreno di Eagle modificato di Dulbecco/F12 di Ham (DMEM/F12). Poiché ogni lotto di membrana basale ha una concentrazione diversa, calcolare la quantità di DMEM/F12 necessaria per raggiungere una diluizione di 1 mg/1 ml. Produrre 0,5 o 1 mL di aliquote per la conservazione a -20 °C.
      NOTA: il passaggio 1.3.2 deve essere eseguito sul ghiaccio all'interno di una cappa di flusso.
    3. Scongelare l'aliquota di 0,5 mL della membrana basale e diluirla con 6 mL di DMEM/F12. Mescolare accuratamente.
    4. Rivestire la piastra pipettando 250 μL di membrana/pozzetto basale diluito in una piastra a 24 pozzetti. Calcola in base alla superficie di ciascun pozzetto per diversi formati di piastre, ad esempio 1 ml / pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
    5. Incubare la piastra per 1 ora in un'incubatrice a 37 °C.
  4. Preparare le aliquote Fura-2 AM sciogliendo Fura-2 AM in dimetilsolfossido (DMSO), secondo il manuale del produttore per preparare aliquote da 1 mM. Conservare le aliquote a -20 °C.

2. Coltura di hiPSC-CMs

  1. Scongelare un flaconcino di hiPSC-CMs a bagnomaria a 37 °C. Trasferire il contenuto scongelato del flaconcino in un tubo da 15 ml. Aggiungere 10 ml del mezzo di riplaccatura in modo goccia alle celle.
  2. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 100 × g.
  3. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno di riplaccatura. Pipe delicatamente su e giù per risospendere il pellet e rimuovere eventuali grumi di cellule.
  4. Utilizzare un emocitometro o un contatore automatico di cellule per contare il numero di cellule.
  5. Rimuovere la membrana basale dalla piastra incubata e sostituirla con il mezzo di riplaccatura.
  6. Placcare le celle con una densità di cella appropriata su una piastra a 6/12/24/48/96 pozzetti rivestita con membrana basale (ad esempio, 250.000 celle / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti).
    NOTA: Per gli esperimenti transitori Ca2+ , placcare le celle su lastre con fondo di vetro.
  7. Sostituire il terreno con terreno di coltura hiPSC-CM il giorno successivo e successivamente aggiornare il terreno a giorni alterni utilizzando 0,5 ml / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti.
  8. Eseguire le misurazioni della contrattilità una volta che gli hiPSC-CM si sono ripresi dallo scongelamento e dalla riplaccatura (3-5 giorni dopo la riplaccatura in questo protocollo).
    NOTA: In caso di placcatura irregolare delle cellule, è possibile che un gruppo di celle non sia in contatto con il resto delle celle riplaccate e possa mostrare un pattern di battito irregolare o non sincronizzato. Per evitare l'asincronia, si consiglia di avere una distribuzione uniforme delle celle e un monostrato sincronizzato ben collegato di hiPSC-CM in ciascun pozzetto.

3. Misure di contrattilità

  1. Accendere il sistema di misurazione basato su ottica, la sorgente luminosa a diodi emettitori di luce (LED) del microscopio e il computer (vedere Tabella dei materiali).
  2. Aprire il programma e aprire un nuovo file. In File nella parte superiore sinistra dello schermo fare clic su Nuovo.
  3. Fai clic su Raccogli, scegli Esperimenti, quindi seleziona "iPSC + Calcio".
  4. Accendere il dispositivo di climatizzazione. Impostare la temperatura su 37 °C e il livello di CO2 su 5%.
  5. Sostituire il terreno di coltura hiPSC-CM con la soluzione di Tyrode (0,5 ml/pozzetto in una piastra da 24 pozzetti). Sostituire il coperchio della piastra con il coperchio del climatizzatore.
    NOTA: Se è necessario eseguire misurazioni transitorie del calcio, caricare le celle con Fura-2 AM, come descritto nel paragrafo 4.
  6. Posizionare la piastra all'interno del sistema di misurazione basato su ottica una volta che il dispositivo di controllo del clima mostra che la temperatura è di 37 °C.
    NOTA: la contrazione viene misurata utilizzando condizioni di campo chiaro.
  7. Fai clic su Apri cell finder sotto la barra degli strumenti e attendi che venga visualizzata una nuova schermata. In alto a destra dello schermo, seleziona il formato della piastra e il pozzetto.
  8. Seleziona un pozzetto, scegli un'area all'interno del pozzo per osservare la contrazione e il rilassamento sincronizzati, premi l'avvio, fai clic su Aggiungi misurazione. Selezionare la durata delle misurazioni nelle impostazioni (10 s per area). Scartare immediatamente le misurazioni di contrazione asincrona e selezionare una nuova area.
    NOTA: i transitori di contrattilità in tempo reale possono essere visualizzati sul monitor. Per le contrazioni sincronizzate, si osserva un transitorio continuo liscio, mentre per le contrazioni asincrone si osservano piccoli picchi extra.
  9. Misurare più aree all'interno del pozzo a seconda delle dimensioni del pozzo. Ad esempio, per seguire questo studio, misurare 10 aree per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Nel caso in cui siano necessarie solo misurazioni di base e non vi sia alcun piano per testare alcun composto, continuare dal passaggio 3.13.
  10. Dopo aver misurato le aree all'interno di un pozzo, premere COMPLETE e aprire lo strumento di misurazione basato sull'ottica per aggiungere il fattore di stress / composto al pozzetto (ad esempio, 500 nM ISO, disciolto in Tyrode).
  11. Scegli il tempo di incubazione in base al composto di interesse (2 minuti con ISO in questo protocollo).
  12. Fare clic su misurazione automatica per consentire allo strumento di misurazione basato su ottica di eseguire misurazioni nelle stesse aree in cui sono state eseguite le misurazioni di base, ottenendo misurazioni accoppiate all'interno del pozzo.
  13. Premere Completa una volta eseguite tutte le misurazioni nel pozzetto.
  14. Scegli il riquadro successivo in alto a destra dello schermo.
  15. Continuare le misurazioni per tutti i pozzi richiesti.
  16. Fare clic su Stop una volta misurati tutti i pozzi richiesti e salvare il file.
    NOTA: Il climatizzatore viene utilizzato per mantenere stabile la CO2. Ciò consente di misurare l'effetto di composti / fattori di stress su hiPSC-CM in modo ad alta velocità.

4. Misurazioni transitorie del calcio

  1. Preparare la soluzione di Tyrode a 37 °C.
  2. Sciogliere le aliquote di Fura-2 AM nella soluzione di Tyrode in modo da aggiungere alle cellule una concentrazione finale di 1 μM Fura-2 AM.
    NOTA: durante l'utilizzo di Fura-2 AM, assicurarsi che le luci nella cappa di flusso siano spente per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
  3. Aspirare il mezzo e sostituirlo con la soluzione di Tyrode contenente Fura-2 AM.
  4. Incubare per 15 minuti a 37 °C in un incubatore o nel sistema di misura basato sull'ottica.
  5. Rimuovere la soluzione di Tyrode contenente Fura-2 AM e successivamente lavarne 2 volte con una soluzione fresca di Tyrode. Infine, incubare le cellule in soluzione di Tyrode per altri 5 minuti a 37 °C per consentire la deesterificazione di Fura-2 AM.
  6. Posizionare la piastra all'interno del sistema di misurazione basato su ottica e avviare le misurazioni, come descritto nella sezione 3.
    NOTA: nel passaggio 4.6. Avviando le misurazioni contemporaneamente alle misure di contrazione, viene registrato un transitorio raziometrico del calcio: eccitazione a 340 nm e 385 nm in uno spot di 100 μm; emissioni raccolte a 510 ± 40 nm. Oltre alle tracce di contrattilità, sullo schermo appariranno transitori di calcio raziometrici in tempo reale.

5. Analisi dei dati

  1. Per analizzare i dati, fare clic su CytoSolver sul desktop.
  2. Fare clic su importa e selezionare i file da analizzare.
  3. Dopo che il programma ha eseguito l'analisi, osservare i transitori accettati (blu) e rifiutati (rosso) visualizzati sullo schermo (Figura 1A).
    NOTA: Qui sono stati utilizzati i seguenti criteri di rifiuto predefiniti, definiti dal rapporto segnale/rumore (SNR) e dalla bontà di adattamento (R 2): R 2 > 0,9 e SNR > 4 per i transitori di contrazione e R2 > 0,5 e SNR > 3 per i transitori di calcio. Questi criteri di rifiuto possono essere regolati dall'utente in base alla qualità delle misurazioni, alla qualità delle celle e al risultato primario per il ricercatore. Ad esempio, se l'interesse del ricercatore è principalmente la cinetica di rilassamento, i criteri potrebbero essere abbassati per il tempo alle variabili di picco. Se si ottengono transitori di calcio molto forti, potrebbe essere necessario aumentare l'SNR per escludere i dati più rumorosi.
  4. Fare clic su Esporta e selezionare i dati transitori medi. Ispeziona i dati analizzati presentati in un foglio di calcolo.
  5. Spegnere il computer e tutti gli altri strumenti.

Representative Results

Seguendo questo protocollo, sono state eseguite misurazioni della contrattilità, dei transitori di Ca2+ e della risposta a un composto in hiPSC-CMs. Utilizzando questo sistema di misurazione basato sull'ottica, gli hiPSC-CM potrebbero essere semplicemente riplaccati sulle piastre richieste e le misurazioni della contrattilità potrebbero essere eseguite. La contrattilità viene misurata in una regione di interesse (ROI) di 100 μm x 100 μm a 250 fotogrammi al secondo calcolando la correlazione dei pixel rispetto a un sistema di riferimento. Il sistema di riferimento viene rilevato automaticamente dal sistema alla diastole finale. Contemporaneamente alle misurazioni della contrazione, viene registrato un transitorio di calcio raziometrico.

In questo studio, tre diversi cicli di differenziazione sono stati utilizzati come tre repliche biologiche. Per ogni lotto di differenziazione, sono stati misurati tre pozzi come repliche tecniche. Questo studio è stato eseguito utilizzando piastre a 24 pozzetti e sono state misurate 10 aree all'interno di ciascun pozzo. Dopo le misurazioni, il programma CytoSolver è stato utilizzato per analizzare immediatamente i dati. Sono stati riportati i seguenti parametri: la frequenza di battitura a riposo, TP. Con, e TB. Con80 degli hiPSC-CMs di controllo (Figura 2A-C). Per visualizzare la variabilità dei dati per ciascun parametro menzionato, le misurazioni all'interno di ciascun pozzetto e i valori medi di tre pozzi per ogni ciclo di differenziazione sono presentati come superplot10. Per valutare meglio la variabilità dei dati per ogni ciclo di differenziazione e tra i tre round, è stato calcolato il coefficiente di varianza (Figura 2D) per ciascun parametro. Come mostrato nella Figura 2D, i valori delle repliche tecniche corrispondenti a una replica biologica rientrano in un intervallo molto vicino l'uno all'altro (cioè un basso coefficiente di varianza), il che illustra la robustezza di questo metodo.

Questa applicazione è molto adatta per testare gli effetti dei farmaci. Qui, è stato testato l'effetto di 500 nM ISO, un agonista non selettivo del recettore β-adrenergico, sulla contrattilità delle hiPSC-CM di controllo. Questo composto è noto per aumentare la frequenza cardiaca ed esercitare un effetto lusitropico positivo. Come illustrato nella Figura 3A, ISO ha aumentato significativamente la frequenza di battimento in tutti i pozzi. L'ISO ha anche aumentato la cinetica, evidente in una diminuzione del TP. Con e TB. Con80 (Figura 3B,C). Nel complesso, dopo l'incubazione con ISO, la frequenza di battitura è stata significativamente aumentata in tutti i pozzi, insieme a una riduzione del tempo di contrazione e rilassamento, il che ha indicato che la risposta attesa a questo composto è stata registrata da questa piattaforma.

Parallelamente alle misurazioni della contrattilità, sono state eseguite anche misurazioni del calcio. Allo stesso modo dei dati di contrattilità (Figura 2), i dati di misurazione del calcio di hiPSC-CMs sono rappresentati nella Figura 4. Il TB.Ca80 è considerevolmente più lento rispetto ai cardiomiociti isolati di ratto o topo, il che è in parte spiegato dalle differenze di specie e frequenza cardiaca11, nonché dalla manipolazione immatura del calcio nelle hiPSC-CM a causa della minore dinamica del calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico e della minore espressione delle proteine di manipolazione del calcio rispetto alle cellule primarie12. Analogamente ai dati di contrattilità, è stato calcolato il coefficiente di varianza per le misurazioni del calcio e mostra una bassa variabilità all'interno delle repliche tecniche e biologiche (Figura 4C).

Figure 1
Figura 1: Utilizzo immediato dello strumento di analisi dei transitori CytoSolver dopo l'esperimento per analizzare i dati. (A) Un esempio dei transitori accettati (tutti in blu) di un'area misurata all'interno di un pozzo. Il pannello A1 raffigura i transitori contrattili. Il pannello A2 rappresenta i transitori di calcio. (B) Contrattilità media transitoria ottenuta da misurazioni in tre pozzetti di un ciclo di differenziazione. Da ogni singolo o medio transitorio, i dati da diversi punti temporali di tempo al picco (TP. Con) e tempo al basale (TB. Con) della contrattilità transitoria potrebbe essere estratta. Poiché l'inizio esatto della contrazione non può sempre essere determinato in modo univoco, il tempo al picco del 20% è preso come punto di partenza per le misurazioni del tempo al picco. Allo stesso modo, il momento esatto in cui il segnale ritorna alla linea di base è difficile da valutare. Pertanto, il tempo al basale 80% viene utilizzato per descrivere il tempo di rilassamento. Qui, TP. Con (tempo al picco - tempo al picco 20%) e TB. Vengono utilizzati con 80 (tempo al basale80% - tempo al picco). (C) Dati transitori medi di calcio ottenuti da misurazioni in tre pozzetti di un ciclo di differenziazione. Da ogni singolo o medio transitorio di calcio, è stato possibile estrarre dati da diversi punti temporali di tempo al picco (TP.Ca) e tempo al basale (TB.Ca) dei transitori di calcio. Per le misurazioni del tempo al picco, il punto di partenza è il tempo per il picco del 20% e per il tempo al basale, il punto finale è il tempo per la linea di base dell'80%. In questo studio vengono utilizzati TP.Ca (tempo al picco - tempo al picco 20%) e TB.Ca 80 (tempo al basale 80% - tempo al picco). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Misurazioni della contrattilità basale eseguite su tre diversi cicli di differenziazione. Tre repliche biologiche e tre pozzetti per ogni ciclo di differenziazione (cioè tre repliche tecniche). Tre simboli principali per ogni giro di differenziazione rappresentano il valore medio delle aree misurate (i simboli di sfondo in colori sbiaditi) all'interno di ciascun pozzetto. I dati sono indicati come media ± SEM. I dati relativi alla frequenza di battitura a riposo sono rappresentati in Hertz e per TP. Con e TB. Con80, i dati sono in secondi. (A) Frequenza di battitura a riposo. (B) Tempo di picco (TP. Contro). (C) Tempo al basale 80% (TB. Con80). (D) Per valutare la variazione tra i dati ottenuti in ciascun round e tra tutti e tre i cicli di differenziazione, il coefficiente di variazione percentuale di varianza è stato calcolato utilizzando i valori medi di ciascun pozzo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Misure di contrattilità al basale (-) e dopo incubazione con ISO (+) su tre pozzetti da tre cicli di differenziazione. (A) La frequenza di battitura a riposo (-) e la frequenza di battitura dopo l'incubazione con 500 nM ISO (+). (B) Tempo di picco (TP. Con) misurazioni al basale e dopo incubazione con ISO. (C) Tempo al basale 80% (TB. Con80) misurazioni al basale e dopo incubazione con ISO. Per valutare l'effetto dell'ISO sui parametri di contrattilità, è stata eseguita una correzione Anova bidirezionale con Bonferroni. I dati sono indicati come media ± SEM. I dati relativi alla frequenza di battitura a riposo sono rappresentati in Hertz e per TP. Con e TB. Con80, i dati sono rappresentati in secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Misurazioni transitorie di calcio al basale eseguite su tre pozzetti da tre cicli di differenziazione . (A) Tempo al picco (TP.Ca) e (B) tempo al basale 80% (TB.Ca80) dei transitori di calcio. I dati sono mostrati come media ± SEM. TP.Ca e TB.Ca80 dati sono rappresentati in secondi. (C) Per valutare la variazione tra i dati ottenuti in ciascun round e tra tutti e tre i cicli di differenziazione, il coefficiente di variazione percentuale è stato calcolato utilizzando il valore medio di ciascun pozzo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

In questo studio, viene descritto un metodo per eseguire misurazioni transitorie di contrattilità e calcio su hiPSC-CMs e studiare l'effetto di fattori di stress / farmaci su queste cellule. Le misurazioni della contrattilità, le misurazioni raziometriche del calcio e la risposta all'ISO sono state eseguite su tre diversi cicli di differenziazione come repliche biologiche. Per ogni replica biologica, le misurazioni sono state eseguite su tre pozzi come repliche tecniche. Il motivo per eseguire le misurazioni in questo modo era quello di garantire che la variabilità biologica e la variabilità tecnica del campione e della piattaforma potessero essere valutate. Oltre a considerare il numero appropriato di repliche biologiche e tecniche, la condizione di coltura hiPSC-CM potrebbe svolgere un ruolo importante per ottenere risultati costanti e robusti. È importante essere coerenti con criteri, quali l'età delle hiPSC-CM, la composizione del mezzo, le condizioni di riplaccatura e il tempo di incubazione del composto durante le misurazioni. In questo studio, ci sono voluti in media 568 ± 24 s per misurare 11 aree due volte per 10 s in un pozzetto. Ciò include un tempo di incubazione ISO di 79 ± 11 s. Questo si riduce a circa 10 minuti per pozzetto, che dovrebbe consentire ai ricercatori di misurare una piastra completa da 24 pozzetti in ~ 4 ore. Il controllo del clima viene utilizzato per mantenere stabile la CO2. Ciò consente di misurare l'effetto di composti / fattori di stress su hiPSC-CM in modo ad alta velocità.

Per misurare la funzione contrattile delle iPSC-CM, esistono diversi sistemi che si basano sull'optogenetica13 o sulla microscopia senza etichetta basata su video 5,6. I sistemi optogenetici sono piuttosto complessi e richiedono tecniche speciali per ottenere dati elettrofisici e/o di contrattilità. Altri sistemi si basano sull'analisi post-hoc dei video, che richiede molto spazio di archiviazione e manca di feedback diretto durante l'acquisizione video. Inoltre, è difficile ottenere una risoluzione temporale e spaziale sufficiente, il che può comportare un sottocampionamento. Allo stesso modo, gli hiPSC-CM modificati da CRISPR / CAS-9 con reporter fluorescenti7 possono introdurre effetti indesiderati sul comportamento dei cardiomiociti. Anche l'uso di coloranti fluorescenti per le misurazioni di contrazione-rilassamento è un approccio elegante, ma limita l'esecuzione di esperimenti sullo stesso campione per un periodo più lungo14.

Questa piattaforma di misurazione basata sull'ottica, tuttavia, potrebbe essere utilizzata per misurare i tempi di contrazione-rilassamento senza utilizzare alcun colorante fluorescente o metodi invasivi. Tuttavia, poiché la correlazione dei pixel non fornisce informazioni spaziali, questo metodo non può essere utilizzato per misurare la forza della contrazione, ma piuttosto può solo rilevare in modo affidabile i cambiamenti nella velocità di contrazione e rilassamento. Il sistema di misura introdotto è a temperatura controllata e può acquisire dati di calcio e contrattilità in tempo reale con una risoluzione di >200 fotogrammi al secondo. Inoltre, viene memorizzata la posizione di ciascuna misurazione, che consente misurazioni accoppiate, aumentando così la potenza degli esperimenti. Inoltre, questa piattaforma offre ai ricercatori la possibilità di archiviare i dati e analizzarli immediatamente dopo l'esperimento. Nel complesso, questo sistema di misurazione basato sull'ottica dimostra di essere un metodo promettente per studiare i meccanismi patologici cellulari, può valutare l'effetto dei composti sulla funzionalità delle hiPSC-CM e può essere utile con il processo preclinico nello screening dei farmaci.

Disclosures

EM è un dipendente di CytoCypher BV. MH è il CEO di CytoCypher BV. I restanti autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata in parte dalla sovvenzione Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) e dalla sovvenzione NWO-VICI 91818602 (JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Numero 195

Erratum

Formal Correction: Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Posted by JoVE Editors on 12/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. The Authors section was updated from:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

to:

Rafeeh Dinani1,2
Emmy Manders1,2,3
Michiel Helmes1,2,3
Lili Wang4
Bjorn C. Knollmann4
Diederik W. D. Kuster1,2
Jolanda van der Velden1,2
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University
2Heart Failure & Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences
3CytoCypher BV
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
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Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., … More

Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).

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