Summary
Este protocolo describe la aplicación de la microscopía de fuerza atómica y la espectroscopia infrarroja a nanoescala para evaluar el rendimiento de la espectroscopia infrarroja fototérmica a nanoescala en la caracterización de muestras multipoliméricas tridimensionales.
Abstract
Los sistemas poliméricos multifásicos abarcan dominios locales con dimensiones que pueden variar desde unas pocas decenas de nanómetros hasta varios micrómetros. Su composición se evalúa comúnmente mediante espectroscopía infrarroja, que proporciona una huella dactilar promedio de los diversos materiales contenidos en el volumen sondeado. Sin embargo, este enfoque no ofrece ningún detalle sobre la disposición de las fases en el material. Las regiones interfaciales entre dos fases poliméricas, a menudo en el rango de nanoescala, también son difíciles de acceder. La espectroscopia infrarroja fototérmica a nanoescala monitorea la respuesta local de los materiales excitados por la luz infrarroja con la sonda sensible de un microscopio de fuerza atómica (AFM). Si bien la técnica es adecuada para interrogar características pequeñas, como proteínas individuales en superficies de oro prístinas, la caracterización de materiales multicomponentes tridimensionales es más difícil de alcanzar. Esto se debe a un volumen relativamente grande de material que experimenta expansión fototérmica, definido por la focalización láser en la muestra y por las propiedades térmicas de los constituyentes poliméricos, en comparación con la región a nanoescala sondeada por la punta AFM. Utilizando una perla de poliestireno (PS) y una película de alcohol polivinílico (PVA), evaluamos la huella espacial de la espectroscopia infrarroja fototérmica a nanoescala para el análisis de superficies en función de la posición de PS en la película de PVA. Se investiga el efecto de la posición de la característica en las imágenes infrarrojas a nanoescala y se adquieren espectros. Se ofrecen algunas perspectivas sobre los futuros avances en el campo de la espectroscopia infrarroja fototérmica a nanoescala, considerando la caracterización de sistemas complejos con estructuras poliméricas embebidas.
Introduction
La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha vuelto esencial para obtener imágenes y caracterizar la morfología de una amplia variedad de muestras con resolución a nanoescala 1,2,3. Al medir la deflexión de un voladizo AFM resultante de la interacción de la punta afilada con la superficie de la muestra, se han desarrollado protocolos de imágenes funcionales a nanoescala para mediciones locales de rigidez y adhesión punta-muestra 4,5. Para el análisis de materia condensada blanda y polímeros, las mediciones de AFM que exploran las propiedades nanomecánicas y nanoquímicas de los dominios locales son muy buscadas 6,7,8. Antes de la aparición de la espectroscopia infrarroja a nanoescala (nanoIR), las puntas de AFM se modificaron químicamente para evaluar la presencia de diferentes dominios de la curva de fuerza de AFM y deducir la naturaleza de la interacción punta-muestra. Por ejemplo, este enfoque se utilizó para revelar la transformación de microdominios de acrilato de poli(terc-butilo) en la superficie de películas delgadas de copolímero de poliestireno-bloque-poli(acrilato de terc-butilo) tratadas con ciclohexano en el nivel9 de sub 50 nm.
La combinación de luz infrarroja (IR) con AFM ha tenido un impacto significativo en el campo de la ciencia de los polímeros6. La espectroscopia IR convencional es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la estructura química de materiales poliméricos 10,11, pero no proporciona información sobre las fases individuales y el comportamiento de las interfases, ya que las regiones son demasiado pequeñas en comparación con el tamaño del haz IR utilizado para sondear la muestra. El problema se mantiene con la microespectroscopía IR, ya que está restringida por el límite de difracción óptica6. Tales mediciones promedian las contribuciones de toda la región excitada por la luz infrarroja; Las señales resultantes de la presencia de fases a nanoescala dentro de la región sondeada exhiben huellas dactilares complejas que deben ser deconvolutadas durante el posprocesamiento o se pierden debido a un nivel de señal por debajo del nivel detectable. Por lo tanto, es esencial desarrollar herramientas capaces de una resolución espacial a nanoescala y una alta sensibilidad IR para explorar las características químicas a nanoescala en medios complejos.
Se han desarrollado esquemas para lograr espectroscopía nanoIR, primero utilizando una punta metálica de AFM como nanoantena 12,13 y, más recientemente, explotando la capacidad del voladizo AFM para monitorear los cambios en la expansión fototérmica incurridos durante la iluminación IR de la muestra 12,14,15. Este último utiliza una fuente de luz infrarroja pulsada y sintonizable sintonizada con una banda de absorción del material sondeado, lo que hace que la muestra absorba la radiación y sufra una expansión fototérmica. Este enfoque es muy adecuado para materiales orgánicos y poliméricos. La excitación pulsada hace que el efecto sea detectable por el voladizo AFM en contacto con la superficie de la muestra en forma de oscilación. A continuación, se monitoriza la amplitud de una de las resonancias de contacto del sistema observadas en el espectro de frecuencias en función de la longitud de onda de iluminación, que constituye el espectro de absorción nanoIR del material situado debajo de la punta AFM15. La resolución espacial de las imágenes y espectroscopía nanoIR está limitada por varios efectos de la expansión fototérmica del material. Se ha evaluado que la espectroscopia fototérmica nanoIR utilizando AFM en modo de contacto puede adquirir las propiedades de los espectros de absorción vibracional de materiales con una resolución espacial a escala inferior a 50 nm14, con trabajos recientes que demuestran la detección de monómeros y dímeros de α-sinucleína 16,17. Sin embargo, los estudios cuantitativos del rendimiento de las mediciones de nanoIR en materiales poliméricos heterogéneos ensamblados en diversas configuraciones, como el caso de los absorbentes de dimensiones finitas incrustados en el volumen de varias películas poliméricas, siguen siendo limitados.
Este artículo tiene como objetivo crear un ensamblaje polimérico con una característica incrustada de una dimensión conocida para evaluar la sensibilidad de la expansión fototérmica y la resolución espacial de nanoIR durante el análisis de superficies. El protocolo cubre la preparación de una película delgada de polímero de alcohol polivinílico (PVA) sobre un sustrato de silicio y la colocación de una perla tridimensional de poliestireno (PS) sobre o incrustada en la película de PVA, que constituye la formación del sistema modelo. Las mediciones de imágenes y espectroscopía de nanoinfrarrojos se describen en el contexto de la evaluación de las señales generadas por la misma perla de PS colocada sobre o debajo de la película de PVA. Se evalúa la influencia de la posición de la perla en las señales nanoIR. Se discuten los métodos para evaluar la huella espacial de la cuenta en el mapa nanoIR y se consideran los efectos de varios parámetros.
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Protocol
1. Fabricación de una solución de alcohol polivinílico (PVA)
- Mida el agua y los gránulos de polímero PVA (consulte la Tabla de materiales) para crear una solución de 10 ml con una proporción de PVA a agua del 20 % en peso.
- Calentar el agua de la cristalería sobre una placa calefactora a 100 °C.
- Coloque los gránulos de polímero PVA en el agua caliente. Inserte una barra agitadora magnética.
- Reduzca el fuego a 80 °C y revuelva hasta que el PVA se disuelva por completo.
- Cubra la parte superior de la cristalería para evitar la contaminación.
- Una vez que esté completamente disuelta, coloque la solución de PVA al 20% en un recipiente de almacenamiento adecuado para almacenarla a temperatura ambiente.
2. Preparación de obleas de silicio (Si) recubiertas de PVA
- Corta una oblea de silicio (Si) (ver Tabla de Materiales) en ~10 x 10 mm2 cuadrados.
- Limpie el sustrato de Si con alcohol isopropílico y déjelo secar.
- Coloque la oblea de Si limpia en el mandril de la máquina de recubrimiento giratorio (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque aproximadamente 10 μL de solución de PVA en el centro del sustrato de Si. Trate de evitar la formación de burbujas.
- Cubra el sustrato de Si con una película uniforme de PVA mediante recubrimiento giratorio durante 30 s a 1.500 rotaciones por minuto (rpm).
NOTA: El volumen especificado de líquido y los parámetros de recubrimiento por centrifugación crean una capa uniforme de PVA a través de la superficie del sustrato con un espesor suficiente para evitar un secado rápido entre el recubrimiento por centrifugación y la colocación de las perlas de PS sobre la superficie de PVA en el siguiente paso.
- Retire la muestra de la máquina de recubrimiento por centrifugación y colóquela en un recipiente de muestra limpio para evitar la contaminación antes de transferir las perlas de PS.
3. Colocación de las perlas de PS en la superficie recubierta de PVA
- Limpie un sustrato de Si con alcohol isopropílico y déjelo secar.
- Con una pipeta, coloque 1 μL de perlas de PS suspendidas en agua en el centro del sustrato.
- Deje que el agua se evapore colocando la muestra en un compartimento de almacenamiento que contenga desecante de arcilla bentonita.
NOTA: Este paso preserva la muestra al reducir la exposición a la humedad. - Coloque el sustrato recubierto de PVA (paso 2.4) y el sustrato con las perlas de PS secas (paso 3.3) bajo un microscopio óptico. Dependiendo de su tamaño, una sola cuenta será visible con binoculares simples o requerirá un mayor aumento óptico.
- Afloje suavemente las cuentas con unas pinzas ultrafinas (consulte la tabla de materiales). Use un pincel de pelo fino para recoger algunas cuentas sueltas y golpee ligeramente los pelos del pincel sobre la oblea recién recubierta de PVA. Los barridos múltiples deben permitir que las cuentas se acumulen dentro de los pelos del cepillo. Golpee la parte superior de los pelos del pincel para alterar el polvo de perlas de PS para liberar perlas sobre la superficie pegajosa de PVA.
NOTA: Es importante que el pincel sea de alta calidad y esté limpio para evitar la liberación de fibras y contaminantes en la superficie de la película de PVA. Moverse rápidamente durante este paso es esencial para que el PVA no se seque por completo. - Repita este paso hasta que se confirme mediante inspección por microscopía óptica que las perlas individuales de PS se adhieren a la superficie de PVA.
- Guarde la muestra en un recipiente limpio. Deje que la muestra se seque por completo.
NOTA: Se debe dejar que la muestra se enfríe y se seque por completo antes de realizar más intentos de análisis. Las mediciones de altura de AFM o las mediciones de perfilador de superficies pueden evaluar el espesor de películas sucesivas de PVA.
4. Carga de la muestra para la caracterización de AFM
NOTA: El protocolo descrito se basa en los procedimientos operativos estándar de una plataforma nanoIR2 (ver Tabla de Materiales), pero debe adaptarse de acuerdo con el modelo AFM utilizado para la medición.
- Monte la muestra de perlas de PVA y PS en la platina AFM utilizando un disco metálico AFM y lengüetas adhesivas, de modo que la muestra quede firmemente unida al portamuestras.
- Monte una sonda nanoIR (por ejemplo, FORTGG) en el soporte de la sonda AFM.
NOTA: El voladizo AFM mide 225 μm de largo, 27 μm de ancho y 2,7 μm de grosor, con un radio de punta de menos de 10 nm. El voladizo está recubierto con una película de oro de 45 nm de espesor en ambos lados para limitar su respuesta a la iluminación IR de la parte superior de la muestra (consulte la Tabla de materiales). Para las mediciones de espectroscopía nanoIR, utilice preferiblemente un voladizo que se haya almacenado en un entorno libre de polidimetilsiloxano antes de su uso. - Alinee el láser de lectura en el extremo libre del haz en voladizo girando las perillas de alineación del láser (ajustes x e y de la posición del láser y ajuste vertical de la posición del detector).
- Maximice la señal SUM del detector.
- Ajuste la posición del detector girando la perilla de deflexión de modo que el láser esté alineado con el centro del detector sensible a la posición del sistema de lectura AFM, correspondiente a una señal de deflexión vertical de ~0 V.
- Haga clic en el icono Cargar en el panel de control "Sonda" de AFM.
- Siga las indicaciones de la pantalla del asistente. Utilice las flechas de enfoque para determinar el plano focal del voladizo nanoIR. Utilice los controles de desplazamiento XY para colocar el voladizo en el centro de la pantalla (alineado con la cruz blanca).
- A continuación, haga clic en las flechas de enfoque para encontrar el plano focal de la superficie de la muestra.
- Utilice la vista óptica del sistema y los controles de desplazamiento XY para colocar la punta en voladizo sobre el cordón de interés y haga clic en Siguiente.
- En la pantalla de activación, establezca el "distanciamiento" en 50 μm y haga clic en Solo aproximación.
- Inicie el procedimiento Engage para acercarse a la punta para obtener imágenes.
5. Creación de imágenes topográficas y nanoIR de la muestra multipolímero
- Adquiera imágenes topográficas en el "Modo de contacto" estándar. Una vez ajustada la posición del voladizo con respecto al cordón PS, inicie la aproximación haciendo clic en el icono de enganche en el panel de control "Sonda" de AFM. Para todo el estudio se utiliza un punto de ajuste de acoplamiento de un diferencial de deflexión de 0,2 V, correspondiente a una fuerza de ~100 nN.
En el panel de control "Escanear" de AFM, establezca la velocidad de escaneo en 0,8 Hz, el tamaño de escaneo (alto y ancho) y el número de puntos por línea y el número de líneas por imagen que se utilizarán para la obtención de imágenes (aquí se utilizó 512 x 512). Haga clic en Escanear para adquirir la imagen de topografía.
NOTA: La calibración del voladizo18 se realiza determinando la sensibilidad a la deflexión (en nm/V) a partir de la pendiente de la curva de distancia-deflexión obtenida con el voladizo interactuando con un sustrato de zafiro (Figura suplementaria 1A). La rigidez en voladizo se determina a partir del ajuste térmico19 (Figura suplementaria 1B). La resonancia del voladizo se ajusta mediante una función lorentziana. La rigidez del voladizo (en N/m) se determina mediante el teorema
de equipartición , donde KBes la constante de Boltzmann, T es la temperatura (T = 295K) y P es el área del espectro de potencia de las fluctuaciones térmicas del voladizo determinada integrando el ajuste lorentziano de los datos de ajuste térmico20. - Para las mediciones de nanoinfrarrojos, coloque la punta AFM en la entidad de interés identificada a partir de la imagen topográfica.
- Seleccione el icono del diapasón en el panel de control nanoIR para determinar las frecuencias de resonancia de contacto del voladizo. Establezca un número de onda de iluminación que excite la expansión fototérmica en el material. Establezca un rango de frecuencia de pulso láser para barrer y configure el ciclo de trabajo del láser nanoIR. Seleccione Adquirir dentro de la "Ventana de sintonización de pulso láser".
- Seleccione la segunda resonancia de contacto del sistema de punta-muestra para las mediciones de nanoIR colocando la barra de marcador (línea vertical verde) en el pico de la segunda resonancia de contacto.
NOTA: La selección del modo de resonancia de contacto puede variar según el tipo de voladizo y la muestra. - Haga clic en Optimizar para alinear el centro de la región focal del láser IR con la posición de la punta en voladizo. La alineación se realiza en un número de onda de iluminación IR seleccionado, correspondiente a una banda de absorción del material sondeado. El voladizo se coloca en el centro de la huella láser (Figura complementaria 2).
NOTA: La alineación puede variar para diferentes números de onda según el modelo de láser. - Adquiera un fondo de la iluminación láser IR. Consiste en medir la salida del láser de cascada cuántica IR (QCL) en el rango de longitud de onda de emisión a la frecuencia de pulso seleccionada (Figura suplementaria 3). Esto es importante para la corrección de fondo de los espectros nanoIR.
- Adquiera el espectro nanoIR seleccionando el rango de números de onda (aquí, Start y Stop se establecen en 1.530 cm-1 y 1.800 cm-1, respectivamente), el tamaño del paso (2 cm-1) y el número de promedios utilizados para la medición. Realice la corrección de fondo de los espectros mostrados dividiendo la amplitud fototérmica medida por el fondo atenuado, que consiste en multiplicar el fondo recogido en el paso 5.2.4 por el porcentaje de potencia seleccionado para la medición.
- Para la obtención de imágenes nanoIR, seleccione la región de interés para la obtención de imágenes.
- Habilite el ajuste automático de bucle de bloqueo de fase (PLL) en la "Ventana de ajuste de pulso láser" (a la que se accede mediante el icono del diapasón ).
- Ajuste la frecuencia mínima y máxima para crear un rango de barrido centrado en el segundo modo de resonancia en el panel de control general.
- Ponga a cero la fase haciendo clic en cero en el panel de control PLL y luego haga clic en OK en la "ventana Laser Pulse Tun".
- Seleccione Imágenes IR habilitadas colocando una marca de verificación en la casilla dentro del panel de control nanoIR.
- En el panel de control "Vista de imágenes", elija Altura (Vista de imágenes 1), Amplitud 2 (Vista de imágenes 2) y Fase 2 (Vista de imágenes 3) para adquirir las imágenes topográficas y químicas de la muestra. Establezca la dirección de adquisición en Trazar (o Volver a trazar). A menudo se requiere una línea de ajuste de línea para observar la imagen topográfica de la muestra que se está adquiriendo. El ajuste de captura debe establecerse en Ninguno.
NOTA: Las preferencias de escaneo, como la dirección de escaneo capturada o la paleta de colores utilizada, se pueden ajustar según sea necesario. - En el panel de control "Escanear" de AFM, seleccione el icono Escanear .
- Para guardar la imagen, seleccione el icono Ahora o Fin del fotograma en el panel de control "Capturar".
- Para exportar los datos, haga clic con el botón derecho en los nombres de los archivos de imagen o espectro dentro de las listas de datos. Seleccione Exportar y elija el formato del archivo que desea exportar. Guarde el archivo en la ubicación de la carpeta de la computadora deseada.
de equipartición , donde KBes la constante de Boltzmann, T es la temperatura (T = 295K) y P es el área del espectro de potencia de las fluctuaciones térmicas del voladizo determinada integrando el ajuste lorentziano de los datos de ajuste térmico20.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las perlas de PS ((C8H8)n) se depositaron sobre un sustrato limpio de Si (Figura 1A) y sobre PVA ((CH2CHOH)n) (Figura 1B, C). Debido a la mala adherencia de la perla en el Si, no se pudieron adquirir imágenes nanoIR en modo de contacto para esta muestra. En su lugar, utilizando la vista óptica de la muestra en nanoIR, la sonda AFM recubierta de oro se acopló en la parte superior de la perla de PS en modo de contacto, con una fuerza estimada de aproximadamente 100 nN (Figura 2A). El láser IR pulsado se configuró para excitar la muestra a 1.730 cm-1, ya que se espera que tanto PS como PVA absorban a este número de onda. La frecuencia de pulso del láser se barrió para determinar la resonancia de contacto del voladizo para la medición del espectro nanoIR. Cuando se pulsó a la frecuencia de resonancia de contacto, se monitoreó la respuesta en voladizo para determinar la amplitud de la oscilación (Figura 2B). A continuación, se construyeron los espectros nanoIR monitorizando la amplitud de la resonancia de contacto en función del número de onda de iluminación, de 1.530 a 1.800 cm-1 en pasos de 2 cm-1 (Figura 2C). En este rango (Figura 3A, recuadro), el espectro reveló la presencia de dos bandas IR centradas en 1.600 cm-1 y 1.730 cm-1, correspondientes al modo de estiramiento predominante de la fracción fenilo y a un subconjunto del estiramiento del anillo en PS, respectivamente21. La comparación del espectro nanoIR con el espectro infrarrojo por transformada de Fourier de campo lejano (FTIR) de PS confirmó la presencia del modo aromático a 1.600 cm-1 (Figura 3A). Sin embargo, se observó que la amplitud relativa I1600/I1730 era significativamente diferente en los espectros FTIR y nanoIR, con valores respectivos de 2,9 y 0,9. Esto se atribuyó al mecanismo de detección de la espectroscopia nanoIR, que monitorea la expansión fototérmica del polímero en lugar de su absorbancia, como en la espectroscopia FTIR. En el caso de PS, esto correspondió a una mayor expansión fototérmica al excitar las subbandas aromáticas a 1.730 cm-1. El espectro nanoIR del PVA mostró una mejor concordancia con el espectro FTIR con una banda de absorción predominante centrada en ~1.730 cm-1 (Figura 3B). Si bien esta banda no era esperada en el PVA puro, que no contiene un grupo C=O, trabajos previos sugieren que la presencia de la banda puede atribuirse a los grupos funcionales carbonilo debido al acetato residual utilizado en la preparación del PVA (tasa como ~80%-90% hidrolizado)22. Para el propósito de este estudio, la presencia de una banda a 1.730 cm-1 fue adecuada para evaluar el efecto de la absorción simultánea de PS y PVA.
Los espectros nanoIR se utilizaron para seleccionar los números de onda de iluminación para la obtención de imágenes químicas de la perla de PS depositada en la superficie del PVA (Figura 4A-C) y de la perla de PS recubierta con PVA (Figura 4D-F). Se utilizó la capacidad de seguimiento de la frecuencia de resonancia de contacto PLL del sistema para garantizar que la medición de la amplitud en cada píxel correspondiera a la amplitud máxima del pico de resonancia de contacto15 (Figura 2C). La resonancia de contacto del voladizo se midió cuando la punta del voladizo estaba en contacto con PVA y PS para determinar un rango adecuado de seguimiento de frecuencia PLL.
Las imágenes NanoIR se adquirieron por primera vez a 1.600 cm-1, lo que corresponde al caso en el que el PS es el absorbente predominante del sistema (Figura 4Ai; Di)). Aunque en ambos casos se obtuvo una imagen de una perla de PS de 5 μm, la amplitud de la expansión fototérmica registrada en esta longitud de onda fue diferente cuando la punta estaba directamente en contacto con la perla de PS y cuando la punta estaba en contacto con el recubrimiento delgado de PVA en la parte superior de la perla de PS. El aumento en la expansión fototérmica detectada por encima de la perla de PS fue significativamente menor cuando la perla se cubrió con la capa de PVA, estimada en ~1,8 μm de espesor utilizando un perfilador de superficie (Figura suplementaria 4). A la potencia láser utilizada (1,47%, que corresponde a ~3,4 mW a 1.600 cm-1 y ~3,8 mW a 1.730 cm-1) (Tabla suplementaria 1), una región de ~13 μm de diámetro exhibió un ligero aumento en la amplitud ~2 nm por encima de la señal registrada en la capa de PVA puro no absorbente lejos del cordón de PS. La huella espacial del aumento de amplitud fue mucho más amplia que cuando la perla de PS estaba en la parte superior de la película de PVA (Figura 4A), donde la señal de expansión fototérmica era asimétrica pero permanecía contenida dentro de una región de ~6 μm de ancho en la dirección de escaneo rápido y ~8 μm de largo en la dirección de escaneo lento de la imagen. Las lecturas de amplitud en esta región alcanzaron hasta 12,1 nm por encima de la expansión fototérmica de la capa de PVA puro. Al iluminar la muestra a 1.730 cm-1, tanto el PS como el PVA exhibieron una mayor amplitud de expansión fototérmica que a 1.600 cm-1. En el caso de la perla PS expuesta (Figura 4Ci), la expansión fototérmica fue mayor en la parte superior de la perla, alcanzando valores de hasta 26,5 nm. La alta respuesta fototérmica se extendió varios micrómetros más allá de la huella observada en la Figura 4Ai. El PVA también se expandió debido a la excitación, pero a una amplitud más baja, es decir, ~7,6 nm registrados lejos de la cuenta PS. Se observó que la respuesta fue consistentemente más fuerte en el lado izquierdo de la cuenta de PS. Para la perla incrustada (Figura 4F), la señal era más simétrica, pero la amplitud de la expansión fototérmica sobre la perla PS era solo ~2,3 nm más alta que la del PVA. Para ello, se registró una amplitud fototérmica constante de ~13,6 nm dentro de la huella de 10-13 μm de la región afectada por el calentamiento de PS, determinada a partir del mapeo de la superficie con la sonda AFM. En el caso de las mediciones realizadas a 1.620 cm-1, no se detectó ninguna señal, lo que es consistente con la ausencia de una banda de absorción IR notable para PS y PVA en esta región del espectro.
A continuación, se compararon los espectros nanoIR recogidos en la parte superior de una perla de PS cubierta con el PVA (Figura 5A). La señal PS a 1.600 cm-1 fue significativamente menor que en el caso de la cuenta descubierta. A pesar de la baja contribución de la banda, un análisis más detallado de las señales confirmó que el aumento de la potencia del láser condujo a una mayor relación I1600/I1730 (Figura 5B, C). Los resultados sugirieron que una mayor potencia del láser corresponde a una mayor profundidad de penetración, como se muestra en la Figura 5B. A su vez, esto afecta a la imagen nanoIR recogida bajo una potencia láser diferente. A una potencia más alta de ~20 mW, la amplitud fototérmica del material exhibió consistentemente una amplitud más baja que a potencias láser más bajas. Además, el nivel de ruido en los espectros aumentó, lo que sugiere algunas inestabilidades en el material, probablemente debido al aumento de la temperatura en el polímero.
Figura 1: Deposición de perlas de PS. Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la perla de PS de 5 μm (A) sobre un sustrato de silicio prístino, (B) sobre una película de PVA y (C) cubierta con PVA. Barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquemas que ilustran el principio de la imagen y la espectroscopia nanoIR. (A) El láser pulsado IR está alineado y enfocado en el punto de contacto de la punta metálica en voladizo AFM con la muestra. El voladizo mide la respuesta fototérmica del material resultante de la absorción IR. La capa de oro en ambos lados se utiliza para reducir la contribución fototérmica y acústica del voladizo durante la medición, lo que interferiría con la medición nanoIR de la muestra. (B) Señal del detector sensible a la posición que monitorea la desviación del voladizo en el dominio del tiempo [S(t)] y en el dominio de la frecuencia [S(ω)]. Los modos de resonancia de contacto del voladizo se identifican mediante mediciones de amplificador de bloqueo. La segunda resonancia de contacto se utiliza para el seguimiento de PLL durante la obtención de imágenes. Se mide la amplitud del modo de resonancia de contacto Acr2 . (C) Espectro NanoIR obtenido mediante la monitorización del cambio en la amplitud Acr2 en función del número de onda de iluminación. La imagen NanoIR se obtuvo monitorizando el cambio de amplitud Acr2 en función de la posición de la punta en la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espectros IR de PS y PVA. (A) Espectro FTIR de PS. El recuadro rojo indica el rango del espectro estudiado con espectroscopía nanoIR. El espectro nanoIR PS correspondiente se proporciona en el recuadro. (B) Espectro FTIR de PVA. El recuadro rojo indica el rango del espectro estudiado con espectroscopía nanoIR. El espectro de PVA nanoIR correspondiente se proporciona en el recuadro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes NanoIR. La perla de PS (A-C) depositada en la superficie del PVA y (D-F) incrustada en el PVA como se muestra en los recuadros. Los mapas NanoIR adquiridos a (A i,Di) 1.600 cm-1, (B i,Ei) 1.620 cm-1 y (C i,Fi) 1.730 cm-1 se superponen en el mapa topográfico 3D. La topografía correspondiente y los perfiles nanoIR extraídos a lo largo de la línea discontinua blanca se presentan en los gráficos respectivos (ii). Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Espectro de NanoIR recogido por la punta AFM en contacto con el cordón de PS recubierto con PVA. (A) Espectros de NanoIR recogidos en p1 = 1,47%, p2 = 2,48%, p3 = 5,20% y p4 = 11% de la potencia del láser. La potencia del láser varía en función de la longitud de onda, que se corrige mediante una corrección de fondo atenuada para cada caso. (B) Esquemas que ilustran el efecto de la potencia del láser sobre la intensidad de las señales recogidas. (C) Relación I1600/I1730 en función de la potencia del láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Calibración del voladizo nanoIR. (A) Curva de distancia-deflexión obtenida sobre un sustrato de zafiro. La pendiente de la curva de retracción proporciona la sensibilidad a la deflexión del voladizo utilizado para calcular la constante de resorte. (B) Frecuencia de resonancia en voladizo determinada por sintonización térmica utilizada para calcular la constante del resorte. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Huella láser IR. La amplitud de oscilación del voladizo en contacto con la superficie de la muestra se registra en función de la posición del láser IR. La alineación del láser IR se varía mediante un espejo móvil. La posición del espejo se establece para alinear el centro del volumen focal (región roja) con la posición del voladizo (centro de la cruz blanca). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Potencia de salida del láser (en mW) en función del número de onda. La potencia de salida del láser QCL se determina utilizando un detector IR estándar de 1.530 cm-1 a 1.800 cm-1 en pasos de 2 cm-1 a la frecuencia de pulso correspondiente a la configuración utilizada para las mediciones de nanoIR. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: Mediciones de espesor de PVA obtenidas mediante perfilometría de superficie confocal láser. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: La potencia del láser en milivatios para cada número de onda. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El AFM combinado con la espectroscopia nanoIR puede proporcionar información química a nanoescala utilizando un voladizo en modo de contacto y una fuente de luz IR sintonizable pulsada. Los sistemas de modelos, como la incrustación de un absorbedor con dimensiones finitas en el volumen de un material polimérico, son importantes para mejorar la comprensión de los mecanismos de formación de imágenes y determinar el rendimiento de la herramienta. En el caso de la configuración PS/PVA que aquí se presenta, se llevó a cabo la optimización para obtener un cordón PS estable colocado por encima o por debajo de la superficie de la película de PVA. Se encontró que depositar las perlas de PS inmediatamente después de retirar el sustrato de Si recubierto del recubrimiento giratorio resultó en una mejor adhesión. La viscosidad de la capa de PVA puede afectar el posicionamiento del cordón con respecto a la superficie de la película de PVA. El calentamiento de la muestra durante aproximadamente 15 minutos a ~200 °C permitió una implantación más profunda de las perlas.
Gracias al tamaño de las perlas PS (5 μm aquí), es posible alinear rápidamente la punta en voladizo con el centro de la perla utilizando el microscopio óptico incorporado con el sistema nanoIR. Mientras que las perlas de PS y las microburbujas en el PVA difícilmente se pueden diferenciar ópticamente, el análisis nanoIR puede confirmar la composición de la muestra. Si bien la contribución de la banda IR a 1.600 cm-1 puede ser débil cuando la perla de PS está cubierta con otro polímero, como se observa en la Figura 5, la alta potencia del láser puede aumentar la contribución de PS a 1.600 cm-1 en la huella dactilar nanoIR recogida directamente encima de ella, con el voladizo en contacto con la superposición de PVA. Se espera que las perlas de PS con diámetros más pequeños sean más difíciles de localizar con microscopía óptica y contribuyan con una señal más baja al espectro nanoIR. En tal caso, se deben considerar las mediciones de imágenes de AFM y nanoIR de las perlas de PS antes de la deposición de la capa superior de PVA, junto con el marcado de la muestra para garantizar que se conozca la ubicación de las perlas de PS incrustadas. A pesar de estos desafíos previstos, este enfoque para preparar sistemas modelo tiene la ventaja de ser barato y fácilmente disponible. El perfil de la topografía de la cuenta podría utilizarse para estimar la posición de la cuenta, aunque se debe tener en cuenta el llamado efecto punta para evaluar el diámetro de la entidad fotografiada.
En cuanto a la adquisición y análisis de datos, los datos producidos con nanoIR en este estudio revelan varias inestabilidades inesperadas de la interacción punta-muestra cuando se utiliza un voladizo nanoIR más blando y cuando se aumenta la potencia del láser. Las imágenes de NanoIR recogidas con un voladizo más blando (k < 0,4 N/m) fueron consistentemente inestables cerca de la perla de PS excitada por la luz IR, a pesar de una imagen topográfica estable. Los espectros nanoIR de PS y PVA registrados en este estudio concuerdan bien con los espectros FTIR comúnmente reportados de los polímeros a granel correspondientes21,22. Las dos bandas distintas de absorción a 1.600 cm-1 (solo PS) y 1.730 cm-1 (PS y PVA) proporcionan una forma de comparar el efecto de excitar el absorbedor de una sola perla debajo de la superficie. Las imágenes nanoIR presentadas en la Figura 4 indican que la señal en las proximidades del cordón es fuerte cuando el cordón PS está expuesto, pero disminuye significativamente cuando una película delgada de PVA cubre el cordón. Sin embargo, los resultados indican que una perla a más de 1 μm por debajo de la superficie puede ser detectada en el mapa nanoIR, tanto cuando se excita el sistema a 1.600 cm-1 como a 1.730 cm-1. La amplitud detectada por el voladizo aumenta en ~2 nm directamente por encima del cordón en el mapa en ambos casos. Aunque de baja amplitud, la huella de esta expansión es de aproximadamente 13 μm de ancho para la excitación de 1.600 cm-1, que es mucho mayor que el diámetro del cordón, lo que confirma que el calor se difunde desde el absorbedor de PS al PVA. Esta expansión de Joule puede afectar a la resolución espacial del nanoIR en materiales heterogéneos, y se espera un efecto más fuerte si el absorbedor está más cerca de la superficie. La mayor respuesta de la muestra a 1.730 cm-1 es consistente con los espectros nanoIR presentados en la Figura 5, mostrando que la contribución de la banda a 1.600 cm-1 es mucho más débil que a 1.730 cm-1.
El enfoque actual presenta algunas limitaciones. Sigue siendo inalcanzable colocar las cuentas por debajo de la superficie del PVA mientras se limita la protuberancia topográfica en la superficie del sistema modelo. De hecho, puede requerir un recubrimiento tan grueso que la perla podría volverse indetectable desde el punto de vista de la espectroscopia nanoIR. La profundidad del cordón es difícil de controlar y caracterizar, lo que dificultaría proporcionar suficiente información para el modelado para una representación precisa del sistema modelo. Una imagen más completa del efecto del tamaño y la profundidad del absorbedor subsuperficial en la señal nanoIR medida en la superficie requeriría variar las dimensiones y posiciones del cordón con mayor precisión. Además, es probable que en un sistema complejo real, varios absorbentes subsuperficiales con diferentes tamaños, posiciones y composiciones interfieran con las mediciones, lo que no se describe en este modelo.
No obstante, las mediciones confirman que hay mucho que aprender de la generación de señales en muestras multipoliméricas para la caracterización de nanoIR. Se debe llevar a cabo una mayor optimización del protocolo de preparación de muestras para variar de forma controlada la profundidad a la que se incrusta la perla de PS para permitir un análisis más completo de cómo la expansión fototérmica en la superficie del PVA se ve afectada por el absorbedor subsuperficial. La combinación de polímeros utilizados para las mediciones también se puede variar para determinar el papel de la conductividad térmica, la expansión térmica y las propiedades mecánicas en el rendimiento de las mediciones de nanoIR para materiales heterogéneos. Esto constituye un enfoque prometedor para comprender mejor el comportamiento de la muestra para la espectroscopia y la obtención de imágenes nanoIR, y se espera que facilite aún más la cuantificación de la profundidad de penetración, la resolución espacial y la sensibilidad de la herramienta. Esto es particularmente importante dada la aparición de nuevos modos de imagen, como el nanoIRmultifrecuencia 15,23, para los cuales la naturaleza de la información y el efecto de los parámetros de actuación en el rendimiento de las herramientas siguen siendo poco conocidos. Para profundizar en la comprensión de los datos recopilados, será fundamental combinar el enfoque experimental con el modelado multifísico24. Considerar las características incrustadas de diferentes tamaños y variar su posición debajo de la superficie será fundamental para desarrollar un modelo más completo. A su vez, esto hará avanzar el campo de la espectroscopia nanoIR hacia aplicaciones de materiales heterogéneos y tridimensionales de la vida real.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF CHE-1847830).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10|0 2200 Golden Taklon Round | Zem | ||
| 5357-8NM Tweezers | Pelco | ||
| Adhesive Tabs | Ted Pella | 16079 | |
| AFM metal specimen disks | Ted Pella | 16208 | |
| Binocular | AmScope | ||
| Cantilever for nanoIR measurements | AppNano | FORTGG | |
| Cell culture dishes | Greiner bio-one GmbH | ||
| Desiccator | |||
| Floating optical table | Newport | RS 4000 | |
| Hotplate | VWR | ||
| Isopropanol | |||
| Kimwipes | KIMTECH | ||
| Magnetic stir bar | |||
| Microparticles based on polystyrene size: 5 µm | SIGMA-ALDRICH | 79633 | |
| nanoIR2 microscope | Bruker | Contact mode NanoIR2 | |
| Nitrogen Tank | Airgas | ||
| Petri dishes | Greiner bio-one GmbH | ||
| Polyvinyl Alcohol | SIGMA-ALDRICH | 363170 | this polymer was only 87%-89% hydrolyzed, which explains the presence of residual C=O at 1730 cm-1 |
| Quantum Cascade Laser | Daylight Solutions | 1550-1800 cm-1 range | |
| Silicon wafer | MEMC St. Peters | #901319343000 | |
| Spin coater | Oscilla |
References
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