Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het kweken van de koolwitte vlinder (Pieris rapae) in gecontroleerde omstandigheden: een casestudy met tolerantie voor zware metalen

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65383
Automatic Translation
1, 1,2
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Summary

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het kweken van de koolwitte vlinder in gecontroleerde laboratoriumomstandigheden met een kunstmatig dieet, dat nauwkeurige manipulaties van voeding in het vroege leven en blootstelling aan toxines mogelijk maakt. De representatieve resultaten laten zien hoe toxiciteit van zware metalen met dit protocol kan worden getest.

Abstract

De koolwitte vlinder (Pieris rapae) is een belangrijk systeem voor toegepast ongediertebestrijdingsonderzoek en fundamenteel onderzoek in gedrags- en voedingsecologie. Koolwitten kunnen gemakkelijk worden grootgebracht in gecontroleerde omstandigheden op een kunstmatig dieet, waardoor ze een modelorganisme van de vlinderwereld zijn. In dit artikel wordt een manipulatie van blootstelling aan zware metalen gebruikt om basismethoden voor het kweken van deze soort te illustreren. Het algemene protocol illustreert hoe vlinders in het veld kunnen worden gevangen, ertoe kunnen worden aangezet om eieren in kaskooien te leggen en als larven kunnen worden overgebracht naar kunstmatige diëten. De methoden laten zien hoe vlinders kunnen worden gemarkeerd, gemeten en bestudeerd voor een verscheidenheid aan onderzoeksvragen. De representatieve resultaten geven een idee van hoe kunstmatige diëten die variëren in componenten kunnen worden gebruikt om vlinderprestaties te beoordelen ten opzichte van een controledieet. Meer specifiek waren vlinders het meest tolerant voor nikkel en het minst tolerant voor koper, met een tolerantie voor zink ergens in het midden. Mogelijke verklaringen voor deze resultaten worden besproken, waaronder nikkel hyperaccumulatie in sommige mosterdwaardplanten en recent bewijs bij insecten dat koper giftiger kan zijn dan eerder werd aangenomen. Ten slotte bespreekt de discussie eerst variaties op het protocol en aanwijzingen voor het oplossen van problemen met deze methoden, voordat wordt overwogen hoe toekomstig onderzoek het kunstmatige dieet dat in deze studie wordt gebruikt, verder kan optimaliseren. Over het algemeen, door een gedetailleerd video-overzicht te bieden van de fokkerij en meting van koolwitten op kunstmatige diëten, biedt dit protocol een hulpmiddel voor het gebruik van dit systeem in een breed scala van studies.

Introduction

De kleine koolwitvlinder (Pieris rapae, hierna "koolwitje" genoemd) is een kosmopolitische plaagsoort van mosterdgewassen, zoals kool, broccoli en koolzaad 1,2,3. Tegelijkertijd is het koolwitje een krachtig systeem voor onderzoek in de biologie en een veelgebruikt vlindermodel, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gekweekt en gemanipuleerd in gecontroleerde laboratoriumexperimenten 4,5. Onderzoek naar koolwitte vlinders heeft kritische inzichten opgeleverd met betrekking tot het zoeken naar gastheer 6,7,8, nectargebruik9,10,11, partnerkeuze en seksuele selectie 12,13,14, vleugelpatroonontwikkeling en evolutie15,16,17, en reacties op nieuwe en veranderende Omgevingen18,19. Veel van deze inzichten zijn gebaseerd op het feit dat koolwitten kunnen worden gekweekt op kunstmatige diëten 4,20,21, die nauwkeurig kunnen worden gemanipuleerd om slechte voedingsomstandigheden22,23, ecologisch relevante verontreinigende niveaus 24,25,26,27 of overgangen naar nieuwe waardplanten28,29 weer te geven. De huidige studie maakt gebruik van een experiment met blootstelling aan zware metalen om basismethoden te illustreren voor het kweken van koolwitte vlinders op een kunstmatig dieet in het laboratorium en belangrijke prestatiemetingen van larven en volwassenen. Veel aspecten van deze methoden zijn van toepassing op andere vlinders30,31 en motten32,33,34 die op een kunstmatig dieet kunnen worden grootgebracht.

In dit artikel wordt een experiment over metaaltolerantie gebruikt om de algemene methoden voor het fokken van koolwitte vlinders te illustreren. Zware metalen zijn een veel voorkomende antropogene verontreinigende stof die voortkomt uit de afbraak van menselijke producten, industriële processen en legacy-verontreiniging door historisch gebruik in pesticiden, verven en andere producten35,36,37,38. Veel zware metalen, waaronder lood, koper, zink en nikkel, kunnen van grond en water naar plantenweefsel 39,40,41,42 gaan en metalen in stof kunnen worden afgezet op plantenbladeren43,44,45, wat resulteert in meerdere blootstellingsroutes aan fytofaag insectenlarven. Blootstelling aan zware metalen vroeg in het leven kan negatieve effecten hebben op de ontwikkeling van dieren, vooral op neuraal weefsel, en hoge niveaus kunnen dodelijk zijn 35,36,46,47,48. Een aantal studies hebben de negatieve effecten van blootstelling aan metaal op zich ontwikkelende insecten aangetoond, waaronder zowel plagen als nuttige insecten 49,50,51. Het grote aantal verontreinigende stoffen met zware metalen en het feit dat ze vaak samen voorkomen in menselijke omgevingen52, betekent dat nauwkeurige laboratoriummethoden nodig zijn waarin onderzoekers zich ontwikkelende insecten kunnen blootstellen aan verschillende niveaus en combinaties van diverse metalen om hun milieueffecten te begrijpen en te verzachten.

Het huidige werk contrasteert de effecten van gewone metalen op de overleving en ontwikkeling van koolwit, met de nadruk op koper (Cu), zink (Zn) en nikkel (Ni), drie veel voorkomende verontreinigende stoffen in menselijke omgevingen. Forbs van landelijke bermen van Minnesota bevatten bijvoorbeeld tot 71 ppm Zn, 28 ppm Cu en 5 ppm Ni53. Dit experiment manipuleert de niveaus van deze metalen in kunstmatige diëten van koolwitte vlinders op niveaus die overeenkomen met en hoger zijn dan de niveaus die in het milieu worden gezien. Een kunstmatig dieet wordt gebruikt om de relatieve toxiciteit van deze metalen te contrasteren, en voorspelt dat koolwitten gevoeliger zouden zijn voor metaalverontreinigende stoffen die geen integraal onderdeel zijn van hun fysiologie (nikkel) in vergelijking met die welke, zij het op kleine niveaus, voorkomen in enzymen en weefsel (koper en zink; Figuur 1). Deze tekst biedt methodologische details en bijbehorende videovisualisaties om de opfok- en onderzoeksmethoden van dit belangrijke vlindermodelsysteem te illustreren.

Protocol

Dit onderzoek werd uitgevoerd onder USDA APHIS-vergunning P526P-13-02979.

1. Verzameling experimentele vlinders

  1. Vang volwassen vrouwelijke vlinders met een insectennet in de lucht. Koolwitten worden over het algemeen gevonden in open, verstoorde habitats met nectarplanten en waardplanten (in de familie Brassicaceae) aanwezig.
    1. Zoek wanneer de zon schijnt en de temperatuur warm is. Om vrouwtjes te targeten, zoek je naar individuen die langzaam fladderen, dicht bij de grond en landen op planten om de bladeren te "trommelen" (proeven) met hun foretarsi.
  2. Zet vrouwtjes in kooien om eieren te oogsten.
    OPMERKING: In het veld verzamelde vrouwtjes hebben gemiddeld met een of twee mannetjes12 gepaard en moeten kort na de vangst beginnen met het leggen van vruchtbare eieren. In het wild gevangen vrouwtjes hebben natuurlijk licht nodig om te oviposit en te paren, dus plaats de kooi in een kas of vensterbank.
  3. Huis vrouwtjes met een waardplant om eieren te oogsten.
    OPMERKING: Vrouwtjes accepteren een verscheidenheid aan waardplanten, waaronder groene kool, radijs, boerenkool, collards en Arabidopsis, maar zorgen ervoor dat de planten niet zijn behandeld met pesticiden.
    1. Presenteer de waardplanten in potten of in containers met water om de bladdruk te behouden, zoals stengels van boerenkool in bloemige waterbuizen.
    2. Als de onderzoeker eieren wil verzamelen en ze rechtstreeks naar het dieet wil overbrengen, gebruik dan eerst een elastiekje om een blad van een waardplant aan de bovenkant van een plastic beker met water te bevestigen en strek vervolgens een stuk parafilm rond de rand - vrouwtjes die het blad aanraken, zullen oviposit op de parafilm (zie5).
  4. Zorg ervoor dat de kooi ook iets bevat om de relatieve luchtvochtigheid hoog te houden, bijvoorbeeld door dagelijks water te geven aan een potplant of een handdoek nat te maken, vooral in droge omstandigheden. Als potplanten in de kooi worden bewaterd, zorg er dan voor dat er een handdoek onder de pot zit, omdat vlinders vast kunnen komen te zitten in zwembadwater.
  5. Voed de vlinders met een 10% verdunde honingwateroplossing gepresenteerd op een gele spons, die vlinders snel leren gebruiken, vooral als ze zijn gehuisvest met ervaren individuen.
    1. Om vlinders aan te moedigen zich te voeden met sponzen, plaatst u ze direct op de feeder, vooral na licht sproeien met een waterfles, waardoor ze vaak hun slurf uitsteken.
    2. Om de feeder op te zetten, spoelt u eerst de gele of oranje sponzen grondig af en snijdt u ze vervolgens in kleine vierkantjes die in plastic petrischaaltjes van 60 mm passen. Vervang de feeders dagelijks en reinig de sponzen in een milde bleekoplossing, gevolgd door grondig spoelen om schimmelgroei te voorkomen.

2. Kunstmatige diëten maken

  1. Gebruik eerst het recept in tabel 1 of andere relevante bronnen om het relevante recept voor een experiment te bepalen. Breng de nodige wijzigingen aan die specifiek zijn voor de focale soort of het experiment. Print een recept uit om te volgen tijdens het wegen van ingrediënten.
  2. Weeg alle droge ingrediënten, behalve de agar, in één bak. Zorg ervoor dat de ingrediënten worden teruggeplaatst in hun respectieve opslaglocatie, waarbij u opmerkt dat verschillende ingrediënten worden bewaard bij 4 ° C. Plaats het vooraf gewogen, droge ingrediëntenmengsel in een blender met 5 ml lijnzaadolie.
  3. Volg voor elke dieetbatch de onderstaande stappen.
    1. Meng 15 g fijnmazige agar met 400 ml gedestilleerd water in een bekerglas van ten minste 1 l. Magnetron totdat de agar bijna kookt, met fijne belletjes door het hele mengsel, roer het mengsel om de 30-60 s om te voorkomen dat het overkookt.
    2. Voeg aan dit hete agarmengsel 400 ml gedestilleerd water met kraantemperatuur toe om het op een geschikte temperatuur te brengen om te mengen met de droge ingrediënten, omdat het vitaminemengsel hittegevoelig is.
    3. Voeg het agarmengsel toe aan de blender en meng grondig, schraap indien nodig de randen van de blender.
  4. Terwijl de agar opwarmt, plaats je minstens vierenzeventig ounce dieetbekers op het aanrecht met de randen die elkaar raken. Na het grondig mengen van het dieet, giet je het mengsel uit de blender in dieetbekers, zodat het dieet de bodem van elk kopje bedekt.
  5. Nadat het dieet is afgekoeld, plaatst u de deksels op de kopjes, etiketteert u de dieetbekers met dieettype, stapelt u ze op trays en bewaart u ze maximaal 1 maand bij 4 °C tot gebruik.

3. Overdracht en opfok op kunstmatige diëten

  1. Huiswaardplant bladeren met vlindereieren in 30 oz deli kopjes met een gaasbedekking in een klimaatkamer van 24 °C. Controleer na 1 week de kopjes - zorg ervoor dat de larven zijn uitgebroed en in het late eerste of vroege tweede instar-stadium, een goed moment voor overdracht naar het kunstmatige dieet.
  2. Breng de larven over naar het kunstmatige dieet met een penseel, desinfecteer het met bleekspray en een waterspoeling tussen containers met larven. Breng drie larven over in elke beker van 4 oz. Hoewel het kunstmatige dieet energiedicht is en hoge dichtheden van larven kan ondersteunen, vermijd het verpakken van larven in kopjes, omdat ziekten en schimmels zich kunnen verspreiden in kopjes met een hoge larvale dichtheid.
  3. Plaats de bekers in een plastic bak aan hun zijkanten, zodat frass op de bodem van de bekers valt en weg van het dieet, waardoor schimmel- en ziekterisico wordt verminderd.
    1. Bewaar de dieetbekers in gecontroleerde temperatuuromstandigheden met lage tot matige lichtniveaus. Controleer de kopjes elke 1-2 dagen op schimmels en ziekten door door de heldere bekerdeksels te gluren.
    2. Bekers met schimmel of ziekte kunnen in quarantaine worden geplaatst of worden ingevroren om verspreiding naar andere kopjes te voorkomen.

4. Volwassen opkomst en behandeling

  1. Laat de larven verpoppen en tevoorschijn komen in de dieetbekers. Wanneer volwassenen tevoorschijn komen, geef ze dan een paar uur om hun vleugels te laten uitharden voordat je ze verwijdert voor markering. Verwijder volwassen vlinders uit de kopjes met schone handen door hun vleugels voorzichtig vast te pakken, waarbij je opmerkt dat het vastpakken van alle vier de vleugels dichter bij hun lichaam een stabielere greep is.
  2. Om de vlinders te markeren, houd je droge individuen bij het hoofd en de thorax en gebruik je een fijnpuntige sharpie om lichtjes een nummer op hun achtervleugel te markeren.
    1. Seks individuen met behulp van een combinatie van vleugelmarkeringen en genitaliën; Vrouwtjes hebben over het algemeen twee zwarte vlekken op hun dorsale voorvleugel en donkere, meer gelige achtervleugels, terwijl mannetjes over het algemeen een kleinere zwarte vlek op de dorsale voorvleugel hebben op een helderdere witte achtergrond54.
    2. Gezien het feit dat deze kleuring individuele en seizoensgebonden variatie vertoont, bevestigt u het geslacht met behulp van buikkenmerken - mannetjes hebben twee klauwen aan het distale uiteinde van hun buik en een smallere buik in het algemeen, terwijl vrouwtjes een enkele genitale opening hebben.
  3. Breng de volwassenen over naar wasglasenveloppen door de envelop met één hand te openen, de vlinder bij het hoofd en de thorax te houden, in de envelop te schuiven en met de andere hand de vleugels door de envelop te grijpen.
    1. Zorg ervoor dat alle vier de vleugels normaal gesloten zijn binnen de envelop.
    2. Houd de vlinders in koude omstandigheden (5-6 °C) tot 1 week voorafgaand aan het experiment, maar laat minstens 1 dag acclimatiseren wanneer ze uit de koelkast worden gehaald.

5. Prestatiemetingen

  1. Om vleugeleigenschappen op dode individuen te meten, verwijdert u de vleugels van de vlinder door de thorax in één hand te houden en met een tang elke vleugel aan de basis te verwijderen. Plaats de vleugels plat in een lichtbak en maak foto's voor latere metingen.
  2. Om schattingen van de vruchtbaarheid te krijgen, huisvest u de volwassenen in paringskooien, waarbij ten minste 1 dag voor reproductieve rijping van mannetjes en 1 dag voor paring wordt toegestaan. Offer vrouwtjes op vaste tijdstippen voor het tellen van eieren door middel van dissectie, of verzamel elke dag eieren op waardplanten.
  3. Om de eibelasting te schatten, verwijdert u de buik van het vrouwtje, plaatst u deze in 1x PBS-buffer en snijdt u een spleet langs de ventrale kant.
    1. Gebruik een tang om de ingewanden van de cuticula te scheiden en trek vervolgens de eierstokken weg van de darm, trachae en andere inhoud van de buik.
    2. Maak de vier gekrulde eicellen in elk van de twee eierstokken los en merk op waar volwassen, dooier- en gepelde eieren overgaan in onrijpe follikels. Gebruik een teller om de totale volwassen eieren te tellen, over het algemeen variërend van 0-200 eieren.
  4. Om de paringsstatus van een ontleed vrouwtje te bepalen, opent u de bursa copulatrix en scheidt u de spermatoforen binnenin. Als spermatoforen worden verteerd, ontwikkelen ze over het algemeen een "staart" en worden ze in elkaar genesteld.

6. Casestudy

OPMERKING: Volwassen vrouwelijke koolwitte vlinders werden in 2014 uit het wild verzameld om de experimentele populaties te stichten. Volwassen vrouwtjes zijn afkomstig uit de buurt van Davis, Californië (N = 8 stichtende vrouwtjes).

  1. Het huisvesten van de vlinders
    1. Plaats de vrouwtjes in "BugDorm" gaaskooien (61 cm x 61 cm x 61 cm) onder natuurlijk licht in een kas. Zorg voor een biologisch blad van de waardplant kool (Brassica oleracea) voor ovipositionering.
    2. Om de luchtvochtigheid in de kooien te behouden, neemt u een kleine potplant (Cosmos) op, dagelijks bewaterd, bovenop een handdoek in elke kooi geplaatst.
    3. Verzamel dagelijks eieren door bladeren met nieuwe eieren over te brengen naar plastic bekers van 473 ml met gaten in het deksel en plaats ze in een klimaatkamer.
    4. Geef vlinders ad libitum toegang tot een 10% honingwateroplossing (gemaakt door biologische honing te verdunnen met gedestilleerd water), toegankelijk via een gele spons in een kleine petrischaal die dagelijks wordt vervangen.
  2. Kunstmatige diëten voorbereiden
    1. Bereid kunstmatige diëten voor koolwitte larven met behulp van modificaties van eerder ontwikkelde Lepidoptera-diëten4. Eén partij dieet bevatte 50 g tarwekiemen, 27 g caseïne, 10 g cellulose, 24 g sucrose, 15 g koolmeel, 9 g Wesson-zoutmix, 12 g Torula-gist, 3,6 g cholesterol, 10,5 g Vanderzant-vitaminemix, 1,1 g methylparabenen, 1,5 g sorbinezuur, 3 g ascorbinezuur en 0,175 g streptomycine (zie tabel met materialen).
    2. Weeg de droge ingrediënten voor meerdere dieetbatches vooraf af (tabel 1) en meng grondig om de homogeniteit tussen dieettypen te vergroten voordat ze worden onderverdeeld in afzonderlijke batches voor menging met metaaloplossingen.
    3. Doe de droge ingrediënten in een blender met lijnolie en het bijbehorende metaalmengsel.
      OPMERKING: Lijnolie werd gebruikt in het huidige experiment omdat het werd verkocht door een eerdere leverancier van insectendiëten. Nu wordt uitsluitend biologische lijnzaadolie gebruikt, die is gemaakt van dezelfde plant, maar minder snel additieven bevat dan commerciële leveranciers van lijnolie.
    4. Giet het bereide dieet in 118 ml (4 oz) plastic deli-bekers. Gebruik oplosbare metaalzouten om focale metalen toe te voegen aan kunstmatige diëten. Streef naar metaalconcentraties op basis van eerdere waarnemingen van het metaalgehalte van planten (bijv. nikkelaccumulatie 55,56,57 of verontreiniging langs de weg van planten 58,59,60) en tolerantie van metalen in andere Lepidoptera 49,50,51.
    5. Los metaalzouten op in 500-1.000 ml gedestilleerd water voordat u de overeenkomstige hoeveelheden inneemt om toe te voegen aan kunstmatige diëten. Om bijvoorbeeld het nikkeldieet van 100 ppm te maken, voegt u 317,6 ml 1 M NiCl2-oplossing toe aan het kunstmatige dieet voordat u het mengt om een uiteindelijke dieetconcentratie van 100 mg / g Ni droog gewicht (ongeveer 53 mg / g nat gewicht) te geven. Deze hoeveelheid vertaalt zich in een gemiddelde gemeten concentratie van 109,6 ppm (tabel 2) op basis van inductief gekoppelde plasma-atoomemissiespectroscopie.
      OPMERKING: De niveaus van metalen werden geschat door de Research Analytical Labs van de Universiteit van Minnesota met zes monsters.
  3. Onderhoud
    1. Houd de eieren geoogst op waardplanten in klimaatkamers op 23 °C op 14:10 fotoperioden gedurende 7 dagen. Breng hierna de vroege tweede instarlarven over naar het kunstmatige dieet.
    2. Verdeel bij overdracht de larven van een bepaalde plant gelijkmatig over de vier dieettypen om te voorkomen dat partijen larven worden verstoord met het dieettype. Breng de larven (N = 346 totaal) over als twee personen per 118 ml dieetbeker om de ziekte-incidentie van overbevolking te verminderen en voldoende ruimte te bieden voor volwassenen om uiteindelijk te omsluiten.
    3. Pons gaten (drie per deksel) in de deksels van de opfokbekers. Plaats de bekers in plastic bakken ter grootte van een schoenendoos voor de opfok, met de verschillende diëten afgewisseld om systematische effecten van locatie in de opfokkamer te voorkomen.
    4. Bewaar de kopjes larven in klimaatkamers op 23 °C op 14:10 fotoperioden (met bakken water op de bodem van de kamer om de luchtvochtigheid rond de 50% -60% te houden, bewaakt met een luchtvochtigheidssensor voor thuis). In het geval dat de kopjes beschimmeld raakten (ongeveer acht in totaal kopjes in deze casestudy), verwijder dan de kopjes uit de kamer en verwijder die personen uit het experiment.
    5. Laat larven verpoppen en tevoorschijn komen in de opfokbekers (N = 162 totaal).
      OPMERKING: Voor de opfokomstandigheden in deze studie bedroeg de ontwikkelingstijd van het verzamelen van eieren tot het verschijnen van volwassen exemplaren gemiddeld ongeveer 25-30 dagen (variërend van 20-40 dagen, bijv. 25,28).
    6. Als de poppen volwassen opkomst naderen, controleer dan de kopjes dagelijks op nieuw ingesloten individuen en verwijder volwassenen met gedroogde vleugels. Label de volwassenen op hun achtervleugels met hun overeenkomstige individuele nummer (toegewezen bij larvale overdracht) met behulp van een fijne zwarte sharpie. Bepaal het geslacht van elk individu en markeer op een glazen envelop samen met hun aantal en opkomstdatum. Doe de volwassen vlinders in glazen enveloppen en bewaar bij -20° C tot verdere verwerking.
      OPMERKING: Een klein deel van de opkomende volwassenen vertoont vleugelmisvormingen die de vlucht en de overleving van volwassenen zouden verstoren (5% -8%); Deze individuen zijn uitgesloten van overlevingsanalyses voor deze experimenten.
  4. Meting en data-analyse
    1. Meet de overleving als overleving vanaf de tweede instar (toen de rupsen op dieet werden gezet) tot volwassen opkomst.
      OPMERKING: De huidige studie richtte zich op overleving en ontwikkelingstijd als maatstaven voor prestaties op de verschillende diëten.
    2. Meet de ontwikkelingstijd als het aantal dagen tussen de overgang naar diëten en de opkomst van volwassenen in de klimaatkamer.
    3. Voer voor gegevensanalyse twee sets modellen uit die interacties tussen het metaal en de concentratie bevatten.
      OPMERKING: Aangezien beide interacties significant waren (F 2.194 = 4,56, p = 0,01 voor ontwikkelingstijd en X2 = 12,1, p = 0,002 voor overleving), ging de studie verder met een afzonderlijke analyse van elk metaal.
    4. Om de overleving te analyseren, voert u chi-kwadraattests uit voor elk metaal om de effecten van metaaldosis (behandeld als vier categorieën) op overleving tot volwassenheid te testen met vleugels volledig intact.
    5. Wanneer een significant effect van de dosis wordt gedetecteerd, voert u een follow-up chi-kwadraat uit om elk niveau te vergelijken met het controledieet. Om de ontwikkelingstijd te analyseren (van het moment van overdracht tot opkomst als volwassene), test u op effecten van seks op de ontwikkelingstijd.
      OPMERKING: Omdat er geen effect was van seks op de ontwikkelingstijd (p > 0,10) voor enig metaal in dit experiment, hebben we het uit de overweging in het model laten vallen.
    6. Voer voor elk metaal een afzonderlijke ANOVA uit om te testen op het effect van de vier concentraties op de ontwikkelingstijd. Voer bovendien t-tests uit voor elke concentratie ten opzichte van de controle om de minimale concentratie te bepalen waar een prestatie-effect wordt waargenomen.
      OPMERKING: In deze studie werd JMP v16 gebruikt voor alle analyses. Alle ruwe gegevens zijn beschikbaar op Mendeley61.

Representative Results

Overzicht
Kunstmatig dieet kan worden gebruikt om koolwitte vlinders in standaardomstandigheden groot te brengen om de effecten van bepaalde dieetingrediënten op vlinderprestaties te testen. In het huidige werk werden kunstmatige diëten gebruikt om de toxiciteit van verschillende metalen te bestuderen die worden aangetroffen in waardplanten die in vervuilde gebieden groeien (figuur 1). Larven werden grootgebracht op diëten met toenemende concentraties van drie verschillende metalen (figuur 2; specifieke methodologische details weergegeven in sectie 6 van het protocol). De overleving en ontwikkeling van vlinders werden meer beïnvloed door koper en zink en het minst beïnvloed door nikkel (figuur 3 en figuur 4), met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met andere studies met vlinders en motten die zijn grootgebracht op kunstmatige diëten (figuur 5).

Overleving
Vlinderlarven werden overgebracht naar kunstmatige diëten die koper, nikkel, zink of controle bevatten, waarbij elk metaaltype in concentratie varieerde op drie niveaus (tabel 3). Een representatief beeld van larven bij een toenemende dosering toxine is weergegeven in figuur 2. Er was geen effect van metaalconcentratie op de overleving voor nikkel, maar er was wel een significant effect voor zowel koper als zink (tabel 3 en figuur 3). Post-hoc chi-kwadraatvergelijkingen toonden aan dat zink een afname in overleving vertoonde ten opzichte van het controledieet bij alleen het hoogste zinkgehalte (1.000 ppm, post-hoc vergelijking X12 = 8,41, p = 0,004; Figuur 1). Koper vertoonde ook een significante afname van de overleving alleen bij de hoogste gebruikte niveaus (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), hoewel er een niet-significante gunstige toename van de overleving was op de twee laagste niveaus (50 ppm en 100 ppm; Figuur 3).

Ontwikkeltijd
Er was een significant effect van de koper- en zinkconcentratie op de ontwikkelingstijd (tabel 4 en figuur 4). Naarmate de koperconcentratie toenam, nam de ontwikkelingstijd toe, met een significante afwijking van de controle vanaf 50 ppm (p = 0,027; Figuur 3). Naarmate de zinkconcentratie toenam, nam de ontwikkelingstijd toe, met een significante afwijking van de controle vanaf 100 ppm (p = 0,03; Figuur 4). Er was een trend dat het verhogen van nikkel resulteerde in langere ontwikkelingstijden (p = 0,08; Tabel 4) en vergelijkingen van elk dieet met de controle toonden significante effecten vanaf 100 ppm (p = 0,022; Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1: Waargenomen niveaus van focale metalen in vlinderweefsel en waardplanten. (Gegevens van 62.) Niveaus van koper, nikkel en zink worden getoond voor Pieris vlinderweefsel (gekweekt op paksoi in het laboratorium) en wild verzamelde mosterd (Bertorea sp.). Auto's geven de niveaus aan die te zien zijn in plantenbladeren langs drukke wegen53. De niveaus van metalen in kunstmatige diëten die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in tabel 1; punten vertegenwoordigen middelen en foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Afbeelding van koolwitte larven die op dezelfde dag worden overgebracht naar kunstmatige diëten met een toenemende concentratie van een toxine. Deze afbeelding toont larven uit een dosis-responsstudie (gepresenteerd in 28 met gedroogd plantmateriaal voor de giftige plant Aristolochia). Foto door ESR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Variatie in overleving tussen metaaldiëten met toenemende concentraties. Sterretjes duiden op een significante afwijking in overleving ten opzichte van het controledieet. De exacte metaalconcentraties in de diëten zijn vermeld in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Effecten van metaalconcentratie op de ontwikkelingstijd. De sterretjes geven de laagste metaalconcentratie aan waarvoor er een significant verschil is ten opzichte van de controle (met behulp van een t-test). De exacte metaalconcentraties in de diëten zijn vermeld in tabel 2. Punten vertegenwoordigen middelen en foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Samenvatting van de metaaltolerantie in andere Lepidoptera. Getoond zijn samengestelde overlevingsgegevens uitgezet uit 11 bestaande studies 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. De responsvariabele is het niveau (in ppm) van de metaalconcentratie waar negatieve effecten op de overleving voor het eerst worden waargenomen. Vlinders geven de resultaten van deze studie aan en merken op dat de tolerantiewaarden voor nikkel hoger waren dan die gemeten in deze studie. Punten vertegenwoordigen middelen en foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ingrediënt Wegen als g Ml
Tarwekiemen droge ingrediënten 50
Cellulose droge ingrediënten 10
Koolmeel droge ingrediënten 15
Caseïne droge ingrediënten 27
Sacharose droge ingrediënten 24
Wesson Zout Mix droge ingrediënten 9
Torula Gist droge ingrediënten 12
Cholesterol droge ingrediënten 3.6
Vitamine mix droge ingrediënten 10.5
Methyl parabenen droge ingrediënten 0.75
Sorbinezuur droge ingrediënten 1.5
Ascorbinezuur droge ingrediënten 3
Streptomycine droge ingrediënten 0.175
Lijnzaadolie natte ingrediënten 5
Agar-agar agar-agar 15

Tabel 1: Recept voor kunstmatige voeding. Getoond zijn de gewichten (en volumes) van ingrediënten in één partij koolwitte vlinderdieet. De droge ingrediënten (en lijnzaadolie) worden apart van het agarmengsel bereid (opgelost in 400 ml kokend water en vervolgens op een koelere temperatuur gebracht met 400 ml water op kamertemperatuur).

Type dieet Koper (ppm) Nikkel (ppm) Zink (ppm)
Koper-"100 ppm" 96.1 1.75 69.9
Nikkel-"100 ppm" 7.29 109.6 68.9
Zink-"100 ppm" 7.96 1.06 186.2
Zink-"500 ppm" 6.51 1.16 708
Beheersen 5.89 0.59 59.3

Tabel 2: Metingen van metalen in diëten. Getoond zijn de gemiddelde niveaus van koper, nikkel en zink in een subset van de kunstmatige diëten die in de studie worden gebruikt. De dieetnaam ("type" in de analyse) wordt aan de linkerkant weergegeven, waarbij waarden tussen aanhalingstekens het berekende niveau zijn. De doelconcentratie wordt tussen aanhalingstekens weergegeven. Een subset van diëten die in de studie werden gebruikt, werd geanalyseerd om ervoor te zorgen dat de berekende waarden op schema lagen met gerealiseerde waarden; Opgemerkt moet worden dat er vaak een kleine mate van variatie is in de samenstelling van dieetcomponenten, en elke gerapporteerde lijn vertegenwoordigt slechts één replicatie.

Metal Pearson X32 P
Koper (N = 118) 17.82 0.0005
Nikkel (N = 152) 3.45 0.33
Zink (N = 152) 12.52 0.006

Tabel 3: Effecten van metaalconcentratie op overleving. Getoond zijn de resultaten van een chi-kwadraattest voor elk metaal, waarbij drie concentraties metaal worden vergeleken met een controledieet.

Metaal F P
Koper (N = 61) F3,57 = 9,84 <0,0001
Nikkel (N = 75) F3,71 = 2,35 0.079
Zink (N = 64) F3,60= 3,79 0.015

Tabel 4: Effecten van metaalconcentratie op de ontwikkelingstijd. Getoond zijn de resultaten van individuele ANOVAs voor elk metaal.

Beschikbaarheid van gegevens:

Alle gegevens zijn beschikbaar op Mendeley61.

Discussion

In dit onderzoek werden koolwitte vlinders (Pieris rapae) grootgebracht op een kunstmatig dieet om verschillen in toxiciteit voor zware metalen te onderzoeken. Daarbij biedt deze studie algemene methoden voor opfok en laboratoriumstudies van dit gemakkelijk te manipuleren vlindersysteem. Deze discussie behandelt eerst meer algemene vragen over de hier besproken methoden, beoordeelt vervolgens onze wetenschappelijke bevindingen voordat we afsluiten met reflecties over de componenten van het kunstmatige dieet.

Het hier besproken protocol geeft stappen van een algemene opfokmethode voor koolwitte vlinders, maar er zijn veel punten binnen dit protocol die kunnen worden aangepast. Terwijl de hier gepresenteerde casestudy bijvoorbeeld sponzen gebruikt voor het voeden, hebben andere onderzoekers geluk gehad met tandwieken en zijden bloemen gevuld met honingwater5. Terwijl de huidige studie honingwater als voedsel gebruikt, hebben andere onderzoekers suikeroplossingen en zelfs Gatorade gebruikt. Als poppen moeten worden gewogen of verplaatst naar andere omstandigheden voor opkomst (bijvoorbeeld diapause induceren en 1 maand moeten koelen), kan de onderzoeker ze gemakkelijk uit de kopjes verwijderen door ze met water te besprenkelen om hun zijden hulpstukken te bevochtigen en ze met een verentang te pakken en ze vervolgens opnieuw op te hangen met dubbelzijdige tape. Als onderzoekers meer flexibiliteit nodig hebben in termen van wanneer volwassen vlinders in kooien worden verplaatst voor volwassen gedrag, kunnen ze enkele weken in de koelkast worden gehouden, maar ze moeten worden gevoerd. Om de paar dagen moeten de vlinders eruit worden gehaald om een verdunde honingwateroplossing te krijgen. Onder binnenverlichting kan dit worden gedaan door een pin te gebruiken om hun slurf in het voedsel uit te rollen. Aan de kant van de volwassen prestaties kan een breed scala aan fitnessmaatregelen worden genomen op koolwitte vlinders. De lichaamsgrootte kan worden gemeten als de natte of droge massa van larven in bepaalde stadia, poppen of volwassenen (geofferd of vastgehouden in glassine enveloppen), of door het meten van de vleugellengte in het programma ImageJ (zie 12,24,25,28). De levenslange vruchtbaarheid van vrouwtjes kan worden gemeten door dagelijkse eierverzamelingen op waardplanten 25,69,70, en de grootte van specifieke eigenschappen kan worden gemeten als een metriek voor prestaties; bijvoorbeeld de massa of het volume van de hersenen of individuele hersengebieden 62,71,72, of de massa of het eiwitgehalte van de thorax of vluchtspier 62,70. Ten slotte kunnen volwassenen worden gebruikt in gedragsstudies om een willekeurig aantal vragen te testen die het effect van dieetmanipulatie op foerageer- of ovipositiekeuzeonderzoeken 27,73.

Als het opfokprotocol niet werkt zoals verwacht, zijn er een paar aspecten die u moet oplossen. Ten eerste kan men zich afvragen of de lichtniveaus hoog genoeg zijn om normaal volwassen gedrag uit te lokken. Terwijl lab-aangepaste lijnen van Pieris eieren leggen onder fluorescerend licht, is het enige kunstlicht dat werkt voor wild-type lijnen krachtige breedspectrum kaslampen. Natuurlijk licht in kassen, vensterbanken of buitenshuis werkt het beste om parings- en eierleggedrag uit te lokken. Ten tweede, als eieren niet uitkomen of als larven vroeg in de ontwikkeling sterven, zijn er een paar dingen om te overwegen. Het materiaal van de waardplant moet organisch zijn, waarbij wordt opgemerkt dat "organische" planten uit winkels soms worden behandeld met chemicaliën die larven kunnen doden, dus het kweken van de eigen waardplanten is vaak het beste. Als de acceptatiegraad van de gastheer lager is, kunnen jongere bladeren met een hoger stikstofgehalte worden geprobeerd, waarbij potplanten worden gepresenteerd in plaats van individuele bladeren en ervoor wordt gezorgd dat vrouwtjes worden gedekt. Vrouwtjes accepteren het zaaien van Brassica, zelfs kleine spruiten die 2 weken oud zijn. De paraffinemethode werkt goed om eieren naar verschillende omstandigheden over te brengen, maar er moet worden opgemerkt dat de acceptatiegraad meestal lager is dan hele planten. Ten derde moeten alle componenten van het dieet van hoge kwaliteit zijn en niet verlopen. Lijnzaadolie moet jaarlijks worden vervangen en in de koelkast worden bewaard24,25. Tarwekiemen, de vitaminemix en antibiotica moeten ook koel worden gehouden. Ten vierde kan men overwegen om de dieetbekeropstelling aan te passen. Een willekeurig aantal plastic wegwerpbekertypen kan worden gebruikt voor het fokken, van 1 oz tot 15 oz. We hebben ontdekt dat 4 oz een goede maat is om volwassen opkomst mogelijk te maken en mooi in onze klimaatkamers past. Gaten in de deksels zorgen voor luchtstroom, maar te veel gaten kunnen het dieet drogen bij een lage luchtvochtigheid, dus dit aantal moet mogelijk worden aangepast. Ten vijfde moeten de omstandigheden in de klimaatkamer mogelijk worden aangepast in combinatie met de bekercondities. Als de omstandigheden te droog zijn, kunnen waardplanten met eieren uitdrogen voordat larven kunnen worden overgebracht, en kopjes met dieet kunnen uitdrogen voordat vlinders tevoorschijn komen. Aan de andere kant, als de omstandigheden te nat zijn, kunnen de kopjes schimmel en ziekte bevatten. Onderzoekers moeten mogelijk de luchtstroom in bekers aanpassen door het gebruik van gaasdeksels of min of meer gaten in de deksels. Een ander veel voorkomend probleem zijn kamerlampen die helder genoeg zijn om temperatuurschommelingen in de kopjes en een opeenhoping van condensatie te veroorzaken; Het gebruik van dimmerlampen is een eenvoudige optie voor het opfokken van larven.

Met betrekking tot de onderzoeksvragen in dit artikel, bleek uit deze studie dat koolwitten relatief gevoeliger waren voor koper dan voor nikkel of zink. Koper had significante negatieve effecten op de ontwikkelingstijd bij concentraties zo laag als 50 ppm (figuur 3 en tabel 3) en op de overleving bij 500 ppm (figuur 4, tabel 4). Daarentegen waren er geen negatieve effecten van nikkel op de overleving (tot 500 ppm; Figuur 3) of negatieve effecten op de ontwikkelingstijd bij 100 ppm (figuur 4). Koolwitten waren redelijk tolerant voor zink, met overlevingseffecten die alleen werden waargenomen bij 1.000 ppm (figuur 3) en negatieve effecten op de ontwikkelingstijd vanaf 100 ppm (figuur 4). Op basis van de relatief hogere concentraties zink in vlinderweefsel en mosterd (hun waardplant; Figuur 1), werd verwacht dat een relatief grotere tolerantie voor zink zou worden gezien. De gevoeligheid voor koper en de tolerantie van nikkel waren echter enigszins onverwacht gezien de zeer lage niveaus van nikkel in vlinderweefsel (figuur 1) en de noodzaak van koper als micronutriënt. Deze onverwachte bevindingen worden hieronder besproken na het overwegen van de tolerantie van deze metalen in andere vlinders en motten.

Om de huidige gegevens te vergelijken met de metaalgevoeligheid gemeten in andere Lepidoptera, werden gegevens uit bestaande studies verzameld over de minimale concentratie, waar zware metalen de overleving negatief beïnvloedden 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; deze studies richtten zich op motten, met name plaagsoorten (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle gemeten gevoeligheidswaarden in dit onderzoek liggen dicht bij het bereik dat voor deze andere soorten is gemeten (figuur 5). De meting van nikkeltolerantie in deze studie lijkt echter hoger te zijn dan verwacht - hoewel er geen significant effect van overleving was bij 500 ppm, vond de vorige studie over Pieris rapae ook een zeer hoge tolerantie voor nikkel (significante effecten vanaf 1.000 ppm56), ondanks lage niveaus in hun weefsel van nature (figuur 1). De maat voor kopergevoeligheid in deze studie lijkt ook aan de lage kant te zijn voor studies van Lepidoptera. Hoewel het gebruik van een kunstmatig dieet een handige en gecontroleerde vergelijking van relatieve metaalgevoeligheid mogelijk maakt, is het belangrijk op te merken dat componenten van het dieet de meting van absolute metaalgevoeligheid kunnen veranderen. Vitamine C in het dieet kan bijvoorbeeld metaalgeïnduceerde oxidatieve stresscompenseren 74, of antibiotica in het dieet kunnen eventuele effecten van microben op de verwerking van metalen veranderen75. Een interessante lijn van toekomstig onderzoek zou zijn om dergelijke dieetcomponenten systematisch te manipuleren om effecten op metaaltoxiciteit te testen, vooral gezien vragen over de functionele rol van lepidoptera-darmmicroben 76,77 en nectarcomponenten die antioxiderende eigenschappen kunnen hebben78. Bovendien kan variatie in voedingsbehoeften tussen soorten interspecifieke vergelijkingen uitdagend maken, en kunstmatige op dieet gebaseerde methoden moeten worden aangevuld met manipulaties van waardplanten.

Deze vlinders zijn bijzonder tolerant voor nikkel en gevoelig voor koper. Eerder onderzoek heeft opgemerkt dat veel planten in de mosterdfamilie, waaronder planten die favoriet zijn bij Pieridae, hyperaccumuleren nikkel als een verdedigingsmechanisme tegen herbivoren 55,56,63,79,80,81. Deze hyperaccumulatie is meer dan 1.000 ppm in plantenweefsel, wat ordes van grootte groter is dan wat in de meeste planten wordt gezien (figuur 1). Het is mogelijk dat Pieris een bijzonder hoge tolerantie voor nikkel hebben als gevolg van eerdere selectie door dergelijke nikkelaccumulatoren, zoals eerder werd gespeculeerd26. Hoewel koper minder vaak is bestudeerd als een micronutriënt in insectendiëten, zijn er aanwijzingen dat het een kleine rol speelt bij de voortplanting en immuniteit, hoewel voornamelijk in bloedvoedende insecten (bijv. 82,83). Het is mogelijk dat koper een minder belangrijke fysiologische rol speelt bij vlinders dan bij andere dieren 84,85,86, in overeenstemming met recent werk dat benadrukt hoe koper net zo zorgwekkend kan zijn voor insecten als lood, cadmium en kwik (bijv. 87,88,89). Hoewel van Pieris is aangetoond dat het koperverontreiniging bij lage niveaus90 voorkomt, heeft de mobiliteit van koper in planten (bijvoorbeeld het verplaatsen naar bladeren en bloemen) het ook gemarkeerd als een metaalverontreiniging van zorg91.

Hoewel deze resultaten interessante gegevens opleveren over de relatieve toxiciteit van deze metalen voor koolwitte vlinders, wil dit artikel ook van algemeen nut zijn als een gedetailleerde visuele illustratie van methoden voor het fokken van dit krachtige systeem. Koolwitten zijn gemakkelijk te kweken en te manipuleren in gecontroleerde laboratoriumexperimenten4,5 vergemakkelijken studies van gastheer zoeken 6,7,8, foerageren9,10,11 en seksuele selectie12,13,14. Het vermogen om deze vlinders op een kunstmatig dieet groot te brengen, is de sleutel tot het creëren van gemeenschappelijke tuinomstandigheden voor vergelijkingen en om voedingsstoffen, toxines en zelfs nieuwe waardplanten te manipuleren. Het is echter belangrijk op te merken dat dit kunstmatige dieet niet noodzakelijkerwijs het optimale kunstmatige dieet voor deze soort is en waarschijnlijk kan worden verbeterd met toekomstige manipulaties. De zoutmix in dit dieet (en andere lepidoptera-diëten) is bijvoorbeeld oorspronkelijk ontwikkeld voor gewervelde dieren en heeft een hoger calciumgehalte dan wat de meeste insecten nodig hebben92,93. Zo hebben sommige van onze opfokinspanningen aangepaste zoutmengsels gemaakt met lagere calciumspiegels (bijv. 62), en anderen maken gebruik van "Beck's zoutmix", die mogelijk meer geschikt is voor veel insectensoorten94. In onze eigen manipulaties vonden we ook dat vlinders beter presteerden met relatief minder tarwekiemen en relatief meer cellulose in vergelijking met oorspronkelijke concentraties4. Een gebied dat verdere aandacht nodig heeft, is de lipidenbron en concentratie in het dieet. Eerder werk heeft bijvoorbeeld aangetoond dat het verschuiven van lijnolie (gebruikt in deze studie) naar fosfolipiden de paringssnelheden en groeisnelheden van Pieris op kunstmatige diëten verhoogde95. Suppletie van specifieke vetzuren in kunstmatige diëten kan extra positieve effecten hebben96,97. Het optimaliseren van het kunstmatige dieet van Pieris98,99 creëert mogelijkheden voor het beantwoorden van interessante vragen over voedingsecologie 100,101,102, evolutionaire ecologie en ecotoxicologie. Deze kunstmatige dieetbenaderingen stellen onderzoekers in staat om vragen te beantwoorden over de rol van specifieke lipiden in cognitieve evolutie 103, pre-aanpassing aan toxines28, voedingscomponenten die de toxiciteit van verontreinigende stoffen verminderen 104, of stoichiometrische interacties tussen voedingsstoffen105.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor de steun van niet-gegradueerde assistenten tijdens de opvoeding voor dit werk, in het bijzonder Regina Kurandina en Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hielp bij het samenstellen van literatuur over metaaltoxiciteit in andere Lepidoptera. Dit werk werd mogelijk gemaakt door een zomeronderzoeksbeurs van het Department of Ecology, Evolution and Behavior van de Universiteit van Minnesota.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon - Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon - Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon - Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon - Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snyder, L. D., Gomez, M. I., Mudrak, E. L., Power, A. G. Landscape-dependent effects of varietal mixtures on insect pest control and implications for farmer profits. Ecological Applications. 31 (2), 2246 (2021).
  2. Shelton, A., Andaloro, J. T., Barnards, J. Effects of cabbage looper, imported cabbageworm, and diamondback moth on fresh market and processing cabbage. Journal of Economic Entomology. 75 (4), 742-745 (1982).
  3. Cartea, M. E., Padilla, G., Vilar, M., Velasco, P. Incidence of the major Brassica pests in northwestern Spain. Journal of Economic Entomology. 102 (2), 767-773 (2009).
  4. Troetschler, R. G., Malone, C. M., Bucago, E. R., Johnston, M. R. System for rearing Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) on a noncruciferous artificial diet developed for Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae). Journal of Economic Entomology. 78 (6), 1521-1523 (1985).
  5. Webb, S., Shelton, A. Laboratory rearing of the imported cabbageworm. New Yorks Food and Life Sciences Bulletin. 122, 1-6 (1988).
  6. Root, R. B., Kareiva, P. M. The search for resources by cabbage butterflies (Pieris rapae): ecological consequences and adaptive significance of Markovian movements in a patchy environment. Ecology. 65 (1), 147-165 (1984).
  7. Hern, A., Edwards-Jones, G., McKinlay, R. G. A review of the pre-oviposition behaviour of the small cabbage white butterfly, Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae). Annals of Applied Biology. 128 (2), 349-371 (1996).
  8. Renwick, J. A. A., Radke, C. D. Sensory cues in host selection for oviposition by the cabbage butterfly, Pieris-Rapae. Journal of Insect Physiology. 34 (3), 251-257 (1988).
  9. Lewis, A. C. Memory constraints and flower choice in Pieris rapae. Science. 232 (4752), 863-865 (1986).
  10. Kandori, I., Ohsaki, N. The learning abilities of the white cabbage butterfly, Pieris rapae, foraging for flowers. Researches on Population Ecology. 38, 111-117 (1996).
  11. Alm, J., Ohmeiss, T. E., Lanza, J., Vriesenga, L. Preference of cabbage white butterflies and honey-bees for nectar that contains amino-acids. Oecologia. 84 (1), 53-57 (1990).
  12. Espeset, A., et al. Anthropogenic increases in nutrients alter sexual selection dynamics: a case study in butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 598-608 (2019).
  13. Tigreros, N. Linking nutrition and sexual selection across life stages in a model butterfly system. Functional Ecology. 27 (1), 145-154 (2013).
  14. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
  15. Stoehr, A. M., Goux, H. Seasonal phenotypic plasticity of wing melanisation in the cabbage white butterfly, Pieris rapae L. (Lepidoptera: Pieridae). Ecological Entomology. 33 (1), 137-143 (2008).
  16. Stoehr, A. M., Walker, J. F., Monteiro, A. Spalt expression and the development of melanic color patterns in pierid butterflies. Evodevo. 4 (1), 6 (2013).
  17. Stoehr, A. M., Wojan, E. M. Multiple cues influence multiple traits in the phenotypically plastic melanization of the cabbage white butterfly. Oecologia. 182 (3), 691-701 (2016).
  18. Ryan, S. F., et al. Global invasion history of the agricultural pest butterfly Pieris rapae revealed with genomics and citizen science. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 20015-20024 (2019).
  19. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R. Patterns of phenotypic plasticity in common and rare environments: a study of host use and color learning in the cabbage white butterfly Pieris rapae. American Naturalist. 173 (5), 615-631 (2009).
  20. Kono, Y. Rearing Pieris rapae crucivora Boisduval (Lepidoptera: Pieridae) on artificial diets. Applied Entomology and Zoology. 3 (2), 96-98 (1968).
  21. Parra, J. R. The Evolution of Artificial Diets and their Interactions in Science and Technology. Insect Bioecology and Nutrition for Integrated Pest Management. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2012).
  22. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. Developmental responses to variable diet composition in a butterfly: the role of nitrogen, carbohydrates and genotype. Oikos. 119 (4), 636-645 (2010).
  23. Rotem, K., Agrawal, A. A., Kott, L. Parental effects in Pieris rapae in response to variation in food quality: adaptive plasticity across generations. Ecological Entomology. 28 (2), 211-218 (2003).
  24. Shephard, A. M., et al. Assessing zinc tolerance in two butterfly species: consequences for conservation in polluted environments. Insect Conservation and Diversity. 13 (2), 201-210 (2020).
  25. Shephard, A. M., Zambre, A. M., Snell-Rood, E. C. Evaluating costs of heavy metal tolerance in a widely distributed, invasive butterfly. Evolutionary Applications. 14 (5), 1390-1402 (2021).
  26. Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Nickel exposure has complex transgenerational effects in a butterfly. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 1008-1017 (2018).
  27. Philips, K. H., Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Developmental lead exposure has mixed effects on butterfly cognitive processes. Animal Cognition. 20 (1), 87-96 (2017).
  28. Sikkink, K. L., et al. Tolerance of novel toxins through generalized mechanism simulating gradual host shifts of butterflies. American Naturalist. 195 (3), 485-503 (2020).
  29. Pentzold, S., et al. excretion and avoidance of cyanogenic glucosides in insects with different feeding specialisations. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 66, 119-128 (2015).
  30. Lampert, E. C., Dyer, L. A., Bowers, M. D. Dietary specialization and the effects of plant species on potential multitrophic interactions of three species of nymphaline caterpillars. Entomologia Experimentalis et Applicata. 153 (3), 207-216 (2014).
  31. Genc, H., Nation, J. L. An artificial diet for the butterfly Phyciodes phaon (Lepidoptera: Nymphalidae). Florida Entomologist. 87 (2), 194-198 (2004).
  32. Brinton, F., Proverbs, M., Carty, B. Artificial diet for mass production of the codling moth, Carpocapsa Pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae)1. The Canadian Entomologist. 101 (6), 577-584 (1969).
  33. Metwally, H. M., et al. Low cost artificial diet for rearing the greater wax moth, Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) as a host for entomopathogenic nematodes. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 22 (1), 15 (2012).
  34. Carpenter, J. E., Bloem, S. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3), 283-294 (2002).
  35. Jaiswal, A., Verma, A., Jaiswal, P. Detrimental effects of heavy metals in soil, plants, and aquatic ecosystems and in humans. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology. 37 (3), 183-197 (2018).
  36. Kumar, A., et al. Lead toxicity: Health hazards, influence on food chain, and sustainable remediation approaches. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (7), 2179 (2020).
  37. Gall, J. E., Boyd, R. S., Rajakaruna, N. Transfer of heavy metals through terrestrial food webs: a review. Environmental Monitoring and Assessment. 187, 201 (2015).
  38. Mohammed, A. S., Kapri, A., Goel, R. Heavy Metal Pollution: Source, Impact, and Remedies. Biomanagement of Metal-Contaminated Soils. , Springer. 1-28 (2011).
  39. Mitra, A., Chatterjee, S., Voronina, A. V., Walther, C., Gupta, D. K. Lead toxicity in plants: a review. Lead in Plants and the Environment. , Springer. 99-116 (2020).
  40. Perugini, M., et al. Heavy metal (Hg, Cr, Cd, and Pb) contamination in urban areas and wildlife reserves: Honeybees as bioindicators. Biological Trace Element Research. 140 (2), 170-176 (2011).
  41. Rycewicz-Borecki, M., McLean, J. E., Dupont, R. R. Bioaccumulation of copper, lead, and zinc in six macrophyte species grown in simulated stormwater bioretention systems. Journal of Environmental Management. 166, 267-275 (2016).
  42. Zulfiqar, U., et al. Lead toxicity in plants: Impacts and remediation. Journal of Environmental Management. 250, 109557 (2019).
  43. Spliethoff, H. M., et al. Estimated lead (Pb) exposures for a population of urban community gardeners. Environmental Geochemistry and Health. 38, 955-971 (2016).
  44. Li, C. C., et al. Foliar dust as a reliable environmental monitor of heavy metal pollution in comparison to plant leaves and soil in urban areas. Chemosphere. 287, 132341 (2022).
  45. Ram, S. S., et al. Plant canopies: bio-monitor and trap for re-suspended dust particulates contaminated with heavy metals. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 19, 499-508 (2014).
  46. Karri, V., Schuhmacher, M., Kumar, V. Heavy metals (Pb, Cd, As and MeHg) as risk factors for cognitive dysfunction: A general review of metal mixture mechanism in brain. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 203-213 (2016).
  47. Tong, S., von Schirnding, Y. E., Prapamontol, T. Environmental lead exposure: a public health problem of global dimensions. Bulletin of the World Health Organization. 78 (9), 1068-1077 (2000).
  48. Liu, J. H., Lewis, G. Environmental toxicity and poor cognitive outcomes in children and adults. Journal of Environmental Health. 76 (6), 130-138 (2014).
  49. Gintenreiter, S., Ortel, J., Nopp, H. J. Effects of different dietary levels of cadmium, lead, copper, and zinc on the vitality of the forest pest insect Lymantria-Dispar L (Lymantriidae, Lepid). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 25, 62-66 (1993).
  50. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. Testing the joint effects hypothesis of elemental defense using Spodoptera exigua. Journal of Chemical Ecology. 41 (2), 168-177 (2015).
  51. Coleman, C. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Extending the elemental defense hypothesis: Dietary metal concentrations below hyperaccumulator levels could harm herbivores. Journal of Chemical Ecology. 31 (8), 1669-1681 (2005).
  52. Kaushal, S. S., et al. Making 'chemical cocktails'-Evolution of urban geochemical processes across the periodic table of elements. Applied Geochemistry. 119, 104632 (2020).
  53. Shephard, A. M., et al. Traffic patterns, more than adjacent land use, influence element content of roadside forbs for insect pollinators. Ecological Solutions and Evidence. 3 (4), 12195 (2022).
  54. Scott, J. A. The Butterflies of North America: A Natural History and Field Guide. , Stanford University Press. (1992).
  55. Boyd, R. S. High-nickel insects and nickel hyperaccumulator plants: A review. Insect Science. 16 (1), 19-31 (2009).
  56. Boyd, R. S., Martens, S. N. Nickel hyperaccumulated by thlaspi-montanum var montanum is acutely toxic to an insect herbivore. Oikos. 70 (1), 21-25 (1994).
  57. Cempel, M., Nickel, G. A review of its sources and environmental toxicology. Polish Journal of Environmental Studies. 15 (3), 375-382 (2006).
  58. Aslam, J., Khan, S. A., Khan, S. H. Heavy metals contamination in roadside soil near different traffic signals in Dubai, United Arab Emirates. Journal of Saudi Chemical Society. 17 (3), 315-319 (2013).
  59. Mitchell, T. S., et al. Traffic influences nutritional quality of roadside plants for monarch caterpillars. Science of the Total Environment. 724, 138045 (2020).
  60. Voegborlo, R., Chirgawi, M. Heavy metals accumulation in roadside soil and vegetation along a major highway in Libya. Journal of Science and Technology. 27 (3), 86-97 (2007).
  61. Snell-Rood, E., Kobiela, M. Data for: Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. , Mendeley Data. (2023).
  62. Snell-Rood, E. C., Espeset, A., Boser, C. J., White, W. A., Smykalski, R. Anthropogenic changes in sodium affect neural and muscle development in butterflies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10221-10226 (2014).
  63. Boyd, R. S., Moar, W. J. The defensive function of Ni in plants: response of the polyphagous herbivore Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) to hyperaccumulator and accumulator species of Streptanthus (Brassicaceae). Oecologia. 118 (2), 218-224 (1999).
  64. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. J. Exploring lower limits of plant elemental defense by cobalt, copper, nickel, and zinc. Journal of Chemical Ecology. 39 (5), 666-674 (2013).
  65. Davis, M. A., Boyd, R. S., Cane, J. H. Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science. 97 (11-12), 554-557 (2001).
  66. Dubovskiy, I. M., Grizanova, E. V., Ershova, N. S., Rantala, M. J., Glupov, V. V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Galleria mellonella. Chemosphere. 85 (1), 92-96 (2011).
  67. Jhee, E. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Nickel hyperaccumulation as an elemental defense of Streptanthus polygaloides (Brassicaceae): influence of herbivore feeding mode. New Phytologist. 168 (2), 331-343 (2005).
  68. Zhou, J. L., Shu, Y. H., Zhang, G. R., Zhou, Q. Lead exposure improves the tolerance of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) to cypermethrin. Chemosphere. 88 (4), 507-513 (2012).
  69. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Reproductive tradeoffs of learning in a butterfly. Behavioral Ecology. 22 (2), 291-302 (2011).
  70. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Plasticity in learning causes immediate and trans-generational changes in allocation of resources. Integrative and Comparative Biology. 53 (2), 329-339 (2013).
  71. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R., Brain Gronenberg, W. size: A global or induced cost of learning. Brain Behavior and Evolution. 73 (2), 111-128 (2009).
  72. Snell-Rood, E. C., et al. Nutritional constraints on brain evolution: Sodium and nitrogen limit brain size. Evolution. 74 (10), 2304-2319 (2020).
  73. Jaumann, S., Snell-Rood, E. C. Adult nutritional stress decreases oviposition choosiness and fecundity in female butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 852-863 (2019).
  74. Sahiti, H., Bislimi, K., Bajgora, A., Rexhepi, A., Dalo, E. Protective effect of vitamin C against oxidative stress in common carp (Cyprinus carpio) induced by heavy metals. International Journal of Agriculture and Biosciences. 7 (2), 71-75 (2018).
  75. Rothman, J. A., Leger, L., Graystock, P., Russell, K., McFrederick, Q. S. The bumble bee microbiome increases survival of bees exposed to selenate toxicity. Environmental Microbiology. 21 (9), 3417-3429 (2019).
  76. Hammer, T. J., Janzen, D. H., Hallwachs, W., Jaffe, S. P., Fierer, N. Caterpillars lack a resident gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (36), 9641-9646 (2017).
  77. Hammer, T. J., Sanders, J. G., Fierer, N. Not all animals need a microbiome. FEMS Microbiology Letters. 366 (10), (2019).
  78. Baker, H. G., Baker, I. Coevolution of Animals and Plants. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
  79. Boyd, R. S., Davis, M. A., Wall, M. A., Balkwill, K. Metal concentrations of insects associated with the South African Ni hyperaccumulator Berkheya coddii (Asteraceae). Insect Science. 13 (2), 85-102 (2006).
  80. Boyd, R. S., Wall, M. A., Jaffre, T. Nickel levels in arthropods associated with Ni hyperaccumulator plants from an ultramafic site in New Caledonia. Insect Science. 13 (4), 271-277 (2006).
  81. Kramer, U. Metal hyperaccumulation in plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 517-534 (2010).
  82. Cardoso-Jaime, V., Broderick, N. A., Maya-Maldonado, K. Metal ions in insect reproduction: a crosstalk between reproductive physiology and immunity. Current Opinion in Insect Science. 52, 100924 (2022).
  83. Rivera-Perez, C., Clifton, M. E., Noriega, F. G. How micronutrients influence the physiology of mosquitoes. Current Opinion in Insect Science. 23, 112-117 (2017).
  84. Lee, J. H. Micronutrient deficiency syndrome: zinc, copper and selenium. Pediatric Gastroenterology, Hepatology & Nutrition. 15 (3), 145-150 (2012).
  85. Nube, M., Voortman, R. L. Human micronutrient deficiencies: linkages with micronutrient deficiencies in soils, crops and animal nutrition. Combating Micronutrient Deficiencies: Food-Based Approaches. , CABI International. Wallingford, UK. 289-311 (2011).
  86. Wysocka, D., Snarska, A., Sobiech, P. Copper-An essential micronutrient for calves and adult cattle. Journal of Elementology. 24 (1), 101-110 (2019).
  87. Oliveira, C. S., et al. Toxic metals that interact with thiol groups and alteration in insect behavior. Current Opinion in Insect Science. 52, 100923 (2022).
  88. Mogren, C. L., Trumble, J. T. The impacts of metals and metalloids on insect behavior. Entomologia Experimentalis et Applicata. 135 (1), 1-17 (2010).
  89. Hladun, K. R., Di, N., Liu, T. X., Trumble, J. T. Metal contaminant accumulation in the hive: Consequences for whole-colony health and brood production in the honey bee (Apis mellifera L.). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (2), 322-329 (2016).
  90. Elbassiouny, S. A. Changes in food-related behavioral-patterns of some phytophagous insect species following exposures to an antifeedant. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 26 (3-4), 483-496 (1991).
  91. Hladun, K. R., Parker, D. R., Trumble, J. T. Cadmium, copper, and lead accumulation and bioconcentration in the vegetative and reproductive organs of Raphanus sativus: Implications for plant performance and pollination. Journal of Chemical Ecology. 41, 386-395 (2015).
  92. Nation, J., Robinson, F. Concentration of some major and trace elements in honeybees, royal jelly and pollens, determined by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 35-43 (1971).
  93. Herbert Jr, E. W., Shimanuki, H. Mineral requirements for brood-rearing by honeybees fed a synthetic diet. Journal of Apicultural Research. 17 (3), 118-122 (1978).
  94. Beck, S. D., Chippendale, G., Swinton, D. Nutrition of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. VI. A larval rearing medium without crude plant fractions. Annals of the Entomological Society of America. 61 (2), 459-462 (1968).
  95. Junnikkala, E. Rearing Pieris-Brassicae (L.) on a phospholipid and vitamin-supplemented semi-artificial diet. Annales Zoologici Fennici. 17 (1), 39-42 (1980).
  96. Hixson, S. M., et al. Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids have developmental effects on the crop pest, the Cabbage White Butterfly Pieris rapae. PLoS One. 11 (3), e0152264 (2016).
  97. Turunen, S. Lipid utilization in adult Pieris brassicae with special reference to the role of linolenic acid. Journal of Insect Physiology. 20 (7), 1257-1269 (1974).
  98. Vanderzant, E. S. Development, significance, and application of artificial diets for insects. Annual Review of Entomology. 19, 139-160 (1974).
  99. Cohen, A. C. Insect Diets: Science and Technology. , CRC Press. (2003).
  100. Balluffi-Fry, J., Leroux, S. J., Champagne, E., Vander Wal, E. In defense of elemental currencies: can ecological stoichiometry stand as a framework for terrestrial herbivore nutritional ecology. Oecologia. 199 (1), 27-38 (2022).
  101. Coogan, S. C. P., Raubenheimer, D., Zantis, S. P., Machovsky-Capuska, G. E. Multidimensional nutritional ecology and urban birds. Ecosphere. 9 (4), 02177 (2018).
  102. Raubenheimer, D., Simpson, S. J., Mayntz, D. Nutrition, ecology and nutritional ecology: toward an integrated framework. Functional Ecology. 23 (1), 4-16 (2009).
  103. Arien, Y., Dag, A., Zarchin, S., Masci, T., Shafir, S. Omega-3 deficiency impairs honey bee learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (51), 15761-15766 (2015).
  104. Man, K. Y., et al. Use of biochar as feed supplements for animal farming. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 51 (2), 187-217 (2021).
  105. Shephard, A. M., Knudsen, K., Snell-Rood, E. C. Anthropogenic sodium influences butterfly responses to nitrogen-enriched resources: implications for the nitrogen limitation hypothesis. Oecologia. 201 (4), 941-952 (2023).

Tags

Biologie Nummer 198
Het kweken van de koolwitte vlinder (<em>Pieris rapae</em>) in gecontroleerde omstandigheden: een casestudy met tolerantie voor zware metalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E.… More

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E. Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. J. Vis. Exp. (198), e65383, doi:10.3791/65383 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter