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Biology

통제 된 조건에서 양배추 흰 나비 (Pieris rapae) 키우기 : 중금속 내성 사례 연구

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65383
Automatic Translation
1, 1,2
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Summary

이 논문은 인공 식단으로 통제된 실험실 조건에서 양배추 흰 나비를 기르기 위한 자세한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 조기 생애 영양 및 독소 노출을 정밀하게 조작할 수 있습니다. 대표적인 결과는 이 프로토콜로 중금속 독성을 분석할 수 있는 방법을 보여줍니다.

Abstract

양배추 흰 나비 (Pieris rapae)는 응용 해충 방제 연구 및 행동 및 영양 생태학의 기초 연구에 중요한 시스템입니다. 양배추 흰자는 인공 식단으로 통제된 조건에서 쉽게 키울 수 있어 나비 세계의 모델 유기체가 됩니다. 이 논문에서는 이 종을 기르는 기본 방법을 설명하기 위해 중금속 노출의 조작을 사용합니다. 일반적인 프로토콜은 나비가 들판에서 잡히고, 온실 새장에 알을 낳도록 유도하고, 유충으로 인공 식단으로 옮길 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 다양한 연구 질문에 대해 나비를 표시, 측정 및 연구하는 방법을 보여줍니다. 대표적인 결과는 구성 요소가 다양한 인공 식단을 사용하여 대조군 식단과 비교하여 나비 성능을 평가하는 방법에 대한 아이디어를 제공합니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 나비는 니켈에 가장 내성이 강하고 구리에 가장 내성이 낮았으며 중간 어딘가에 아연이 내성이 있었습니다. 일부 겨자 숙주 식물에서의 니켈 과다 축적과 구리가 이전에 인식된 것보다 더 독성이 있을 수 있다는 곤충의 최근 증거를 포함하여 이러한 결과에 대한 가능한 설명이 논의됩니다. 마지막으로, 논의는 향후 연구가 이 연구에 사용된 인공 식단을 더욱 최적화할 수 있는 방법을 고려하기 전에 먼저 프로토콜의 변형과 이러한 방법의 문제 해결 지침을 검토합니다. 전반적으로, 인공 식단에서 양배추 흰자의 사육 및 측정에 대한 자세한 비디오 개요를 제공함으로써 이 프로토콜은 광범위한 연구에서 이 시스템을 사용하기 위한 리소스를 제공합니다.

Introduction

작은 양배추 흰 나비 (Pieris rapae, 이하 "양배추 흰색")는 양배추, 브로콜리, 카놀라와 같은 겨자 작물의 국제적인 해충 종입니다 1,2,3. 동시에, 양배추 흰자는 생물학 연구를 위한 강력한 시스템이며 통제된 실험실 실험에서 쉽게 사육되고 조작될 수 있기 때문에 일반적으로 사용되는 나비 모델입니다 4,5. 양배추 흰 나비에 대한 연구는 숙주 탐색 6,7,8, 꿀 자원 사용9,10,11, 짝 선택 및 성 선택 12,13,14, 날개 패턴 발달 및 진화15,16,17, 새롭고 변화하는 반응과 관련하여 중요한 통찰력을 제공했습니다 환경18,19. 이러한 통찰의 대부분은 양배추 흰자위가 인공 사료로 사육될 수 있다는 사실에 의존한다.4,20,21, 이는 열악한 영양 조건22,23, 생태학적으로 관련된 오염 물질 수준(24,25,26,27) 또는 새로운 숙주 식물로의 전환(28,29)을 반영하도록 정밀하게 조작될 수 있다 . 본 연구는 중금속 노출에 대한 실험을 통해 실험실에서 인공사료로 양배추흰나비를 기르는 기본 방법과 유충과 성충의 핵심성능 측정을 설명한다. 이 방법의 많은 측면은 인공 식단으로 키울 수 있는 다른 나비30,31과 나방32,33,34에 적용됩니다.

이 논문에서는 양배추 흰 나비를 기르는 일반적인 방법을 설명하기 위해 금속 내성에 대한 실험을 사용합니다. 중금속은 인간 제품, 산업 공정 및 살충제, 페인트 및 기타 제품의 역사적 사용으로 인한 유산 오염으로 인한 일반적인 인위적 오염 물질입니다35,36,37,38. 납, 구리, 아연 및 니켈을 포함한 많은 중금속은 토양과 물에서 식물 조직으로 이동할 수 있으며(39,40,41,42), 먼지 속의 금속은 식물 잎(43,44,45)에 침착되어 식물포식성 곤충 유충에 대한 여러 경로의 노출을 초래할 수 있다. 생애 초기에 중금속에 노출되면 동물 발달, 특히 신경 조직에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 높은 수치는 치명적일 수 있습니다 35,36,46,47,48. 많은 연구에서 해충과 유익한 곤충을 포함한 곤충개발에 대한 금속 노출의 부정적인 영향을 보여주었습니다 49,50,51. 많은 수의 중금속 오염 물질과 인간 환경에서 종종 동시에 발생한다는 사실52은 연구자가 발달하는 곤충을 다양한 수준과 다양한 금속 조합에 노출시켜 환경 영향을 이해하고 완화할 수 있는 정확한 실험실 방법이 필요하다는 것을 의미합니다.

본 연구는 인간 환경에서 흔히 볼 수 있는 세 가지 오염 물질인 구리(Cu), 아연(Zn), 니켈(Ni)에 초점을 맞춰 일반 금속이 양배추 흰자의 생존과 발달에 미치는 영향을 대조합니다. 예를 들어, 시골 미네소타 길가의 포브는 최대 71ppm Zn, 28ppm Cu 및 5ppm Ni53을 함유하고 있습니다. 이 실험은 양배추 흰 나비의 인공 식단에서 이러한 금속의 수준을 환경에서 볼 수 있는 수준에 해당하거나 초과하는 수준으로 조작합니다. 인공 식단은 이러한 금속의 상대적 독성을 대조하기 위해 사용되며, 양배추 흰자는 효소와 조직 (구리 및 아연; 그림 1). 전체적으로 이 텍스트는 이 중요한 나비 모델 시스템의 사육 및 연구 방법을 설명하기 위해 방법론적 세부 사항과 함께 제공되는 비디오 시각화를 제공합니다.

Protocol

이 연구는 USDA APHIS 허가 P526P-13-02979에 따라 수행되었습니다.

1. 실험용 나비 수집

  1. 공중 방충망으로 성인 암컷 나비를 잡으십시오. 양배추 흰자는 일반적으로 과즙 식물과 숙주 식물(Brassicaceae과)이 존재하는 개방적이고 교란된 서식지에서 발견됩니다.
    1. 해가 뜨고 온도가 따뜻할 때 검색하십시오. 암컷을 표적으로 삼으려면 천천히 펄럭이고 땅에 가까이 다가가 식물에 착지하여 앞발로 잎을 "드럼"(맛보기)하는 개체를 찾으십시오.
  2. 새장에 암컷을 세워 알을 수확하십시오.
    참고: 현장에서 채집한 암컷은 평균적으로 한두 마리의 수컷과 교미를 한다12, 포획 직후 수정란을 낳기 시작한다. 야생에서 잡힌 암컷은 산란과 짝짓기를 위해 자연 채광이 필요하므로 새장을 온실이나 창턱에 두십시오.
  3. 알을 수확하기 위해 숙주 식물을 가진 암컷을 기르십시오.
    참고: 암컷은 녹색 양배추, 무, 케일, 콜라드, 애기장대를 포함한 다양한 숙주 식물을 수용하지만 식물이 살충제로 처리되지 않았는지 확인합니다.
    1. 꽃 물관에 있는 케일 줄기와 같이 잎 압력을 유지하기 위해 화분이나 물이 담긴 용기에 숙주 식물을 제시합니다.
    2. 연구자가 알을 채취하여 식단으로 직접 옮기려면 먼저 고무 밴드를 사용하여 숙주 식물 잎을 플라스틱 물 컵 상단에 부착한 다음 가장자리 주위에 파라필름 조각을 늘립니다.
  4. 예를 들어 케이지에 상대 습도를 높게 유지하기 위한 무언가가 포함되어 있는지 확인하십시오.ample, 특히 건조한 조건에서 화분에 매일 물을 주거나 수건을 적시는 것과 같이. 화분에 심은 식물이 새장에 물을 주면 나비가 고인 물에 갇힐 수 있으므로 화분 아래에 수건이 있는지 확인하십시오.
  5. 나비에게 노란색 스폰지에 제시된 10 % 희석 된 꿀 물 용액을 먹이십시오.이 용액은 나비가 특히 숙련 된 개인과 함께 수용하는 경우 빠르게 사용법을 배웁니다.
    1. 나비가 스폰지에서 먹이를 먹도록 장려하기 위해, 특히 물병을 살짝 뿌린 후에는 나비를 피더에 직접 올려 놓으십시오.
    2. 피더를 설치하려면 먼저 노란색 또는 주황색 스폰지를 철저히 헹구고 60mm 플라스틱 페트리 접시에 맞는 작은 사각형으로 자릅니다. 매일 피더를 교체하고 순한 표백제 용액으로 스폰지를 청소한 다음 곰팡이가 자라지 않도록 철저히 헹굽니다.

2. 인공 다이어트 만들기

  1. 먼저, 표 1의 레시피 또는 기타 관련 소스를 사용하여 실험에 대한 관련 레시피를 결정합니다. 초점 종이나 실험에 따라 필요한 수정을 가하십시오. 재료의 무게를 잴 때 따를 레시피를 인쇄하십시오.
  2. 한천을 제외한 모든 건조 재료를 하나의 용기에 담습니다. 여러 재료가 4°C에서 보관된다는 점에 유의하여 재료를 각각의 보관 위치에 다시 넣었는지 확인합니다. 미리 계량된 건조 재료 혼합물을 아마씨 오일 5mL와 함께 블렌더에 넣습니다.
  3. 각 다이어트 배치에 대해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
    1. 15 g의 미세 메쉬 한천과 400 mL의 증류수를 최소 1 L 크기의 비이커에 넣고 섞는다. 한천이 끓을 때까지 전자레인지에 돌리고 혼합물 전체에 미세한 거품이 생기고 혼합물이 끓는 것을 방지하기 위해 30-60초마다 저어줍니다.
    2. 이 뜨거운 한천 혼합물에 400mL의 수도꼭지 온도 증류수를 첨가하여 비타민 혼합물이 열에 민감하므로 건조 성분과 혼합할 수 있는 적절한 온도로 만듭니다.
    3. 한천 혼합물을 블렌더에 넣고 필요한 경우 블렌더의 가장자리를 긁어 완전히 혼합합니다.
  4. 한천이 가열되는 동안 가장자리가 닿도록 카운터에 최소 70개의 4온스 다이어트 컵을 놓습니다. 다이어트를 완전히 섞은 후 블렌더의 혼합물을 다이어트 컵에 붓고 다이어트가 각 컵의 바닥을 덮도록 합니다.
  5. 다이어트가 식은 후 컵에 뚜껑을 덮고 다이어트 컵에 다이어트 유형을 라벨을 붙이고 트레이에 쌓아 놓고 사용할 때까지 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.

3. 인공 식단에 대한 전이 및 양육

  1. 하우스 호스트 식물은 24 ° C 기후 챔버에서 메쉬 커버가있는 30 온스 델리 컵에 나비 알을 담근다. 1 주일 후, 컵을 확인하여 유충이 부화하고 늦은 첫 번째 또는 두 번째 instar 단계에서 인공 식단으로 옮기기에 좋은시기입니다.
  2. 유충을 페인트 브러시로 인공 식단으로 옮기고 표백제 스프레이로 소독하고 유충 용기 사이에 물을 헹굽니다. 3마리의 유충을 각 4온스 컵에 옮깁니다. 인공 식단은 에너지 밀도가 높고 고밀도의 유충을 지원할 수 있지만 유충 밀도가 높은 컵에 질병과 곰팡이가 퍼질 수 있으므로 유충을 컵에 포장하지 마십시오.
  3. 컵을 옆면의 플라스틱 통에 넣어 프라스가 컵 바닥으로 떨어지고 식단에서 멀어지도록 하여 곰팡이와 질병 위험을 줄입니다.
    1. 다이어트 컵은 낮거나 중간 정도의 조명 수준으로 제어된 온도 조건에 보관하십시오. 투명한 컵 뚜껑을 통해 엿보면서 1-2일마다 컵에 곰팡이와 질병이 있는지 모니터링하십시오.
    2. 곰팡이나 질병이 있는 컵은 다른 컵으로 퍼지는 것을 방지하기 위해 격리하거나 냉동할 수 있습니다.

4. 성인 출현 및 취급

  1. 유충이 번데기를 타고 다이어트 컵에 나오도록 하십시오. 성충이 나오면 표시를 위해 날개를 제거하기 전에 날개가 굳을 때까지 몇 시간을 주십시오. 날개를 부드럽게 잡고 깨끗한 손으로 컵에서 성인 나비를 제거하고 네 날개를 모두 몸에 더 가깝게 잡는 것이 더 안정적인 그립이라는 점에 유의하십시오.
  2. 나비를 표시하려면 마른 사람의 머리와 가슴을 잡고 끝이 가는 샤피를 사용하여 뒷날개에 숫자를 가볍게 표시합니다.
    1. 날개 표시와 생식기의 조합을 사용하는 성별 개인; 암컷은 일반적으로 등쪽 앞날개에 두 개의 검은 반점이 있고 더 어둡고 더 노란 뒷날개가 있는 반면, 수컷은 일반적으로 더 밝은 흰색 배경에 등쪽 앞날개에 작은 검은 반점이 하나 있습니다54.
    2. 이 착색이 개인 및 계절적 변화를 나타낸다는 점을 감안할 때, 복부 특성을 사용하여 성별을 확인하십시오 - 남성은 복부의 말단부에 두 개의 걸쇠가 있고 일반적으로 복부가 더 좁은 반면 여성은 단일 생식기 개구부를 가지고 있습니다.
  3. 한 손으로 봉투를 열고 나비의 머리와 가슴을 잡고 봉투에 밀어 넣고 다른 손으로 봉투를 통해 날개를 잡아 성인을 왁스 글라신지 봉투로 옮깁니다.
    1. 네 개의 날개가 모두 봉투 내에서 정상적으로 닫혀 있는지 확인하십시오.
    2. 실험 전 최대 5주일 동안 나비를 추운 조건(6-1°C)에 유지하되 냉장고에서 꺼낼 때 적응하는 데 최소 1일이 걸립니다.

5. 성과 측정

  1. 죽은 개체의 날개 특성을 측정하려면 한 손으로 흉부를 잡고 집게를 사용하여 바닥에서 각 날개를 제거하여 나비의 날개를 제거합니다. 날개를 라이트박스에 평평하게 놓고 나중에 측정할 수 있도록 사진을 찍습니다.
  2. 번식력을 추정하려면 성충을 짝짓기 케이지에 수용하여 수컷의 생식 성숙에 최소 1일, 짝짓기에 1일을 허용합니다. 해부를 통해 알 수를 위해 정해진 시점에 암컷을 희생시키거나 숙주 식물에서 매일 알을 수집합니다.
  3. 달걀 부하를 추정하려면 암컷의 복부를 제거하고 1x PBS 완충액에 넣고 복부 쪽을 따라 슬릿을 자릅니다.
    1. 집게를 사용하여 큐티클에서 내장을 분리한 다음 장, 기관 및 기타 복부 내용물에서 난소를 당겨냅니다.
    2. 두 개의 난소 각각에 있는 4개의 말린 난소를 펴고 성숙한 난자, 노른자 및 껍질을 벗긴 난자가 미성숙 난포로 전환되는 위치를 확인합니다. 카운터를 사용하여 일반적으로 0-200개의 알 범위의 총 성숙한 알을 집계하는 데 도움이 됩니다.
  4. 해부된 암컷의 짝짓기 상태를 확인하려면 부르사 코풀라트릭스를 열고 그 안에 있는 정자를 분리합니다. 정자는 소화될 때 일반적으로 "꼬리"가 생기고 서로 중첩됩니다.

6. 사례 연구

참고: 2014년 야생에서 성체 암컷 양배추 흰나비를 채취하여 실험 개체군을 찾았습니다. 성인 여성은 캘리포니아 데이비스 근처에서 유래했습니다(N = 8명의 창립 여성).

  1. 나비 수용
    1. 온실의 자연 채광 아래 "BugDorm"메쉬 케이지 (61cm x 61cm x 61cm)에 암컷을 수용하십시오. 산란을 위해 숙주 식물 양배추 (Brassica oleracea)의 유기농 잎을 제공하십시오.
    2. 케이지의 습도를 유지하려면 매일 물을 주는 작은 화분(코스모스)을 각 케이지 안의 수건 위에 올려 놓으십시오.
    3. 새 달걀이 든 잎을 뚜껑에 구멍이 있는 473mL 플라스틱 컵에 옮겨 매일 달걀을 모으고 기후 챔버에 넣습니다.
    4. 나비에게 매일 바뀌는 작은 페트리 접시에 담긴 노란색 스폰지를 통해 접근할 수 있는 10% 꿀 물 용액(유기농 꿀을 증류수로 희석하여 만든)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하십시오.
  2. 인공 다이어트 준비
    1. 이전에 개발 된 나비목 식단의 변형을 사용하여 양배추 흰 유충을위한 인공 식단을 준비하십시오4. 한 배치의 식단에는 밀 배아 50g, 카제인 27g, 셀룰로오스 10g, 자당 24g, 양배추 가루 15g, 웨슨 소금 믹스 9g, 토룰라 효모 12g, 콜레스테롤 3.6g, Vanderzant 비타민 믹스 10.5g, 메틸 파라벤 1.1g, 소르빈산 1.5g, 아스코르브산 3g, 스트렙토마이신 0.175g( 재료 표 참조).
    2. 여러 다이어트 배치(표 1)를 위해 건조 성분을 미리 칭량하고 금속 용액과 혼합하기 위해 별도의 배치로 세분화하기 전에 식단 유형 전반에 걸쳐 균질성을 높이기 위해 철저히 혼합합니다.
    3. 아마인유와 해당 금속 혼합물이 있는 블렌더에 마른 재료를 넣습니다.
      참고: 아마인유는 과거 곤충 사료 공급업체에서 판매한 대로 본 실험에 사용되었습니다. 이제 유기농 아마씨 오일은 독점적으로 사용되며 동일한 식물에서 만들어 지지만 아마씨 오일의 상업적 공급 업체로서 첨가제를 함유 할 가능성이 적습니다.
    4. 준비된 식단을 118mL(4oz) 플라스틱 델리 컵에 붓습니다. 수용성 금속염을 사용하여 인공 식단에 초점 금속을 추가하십시오. 식물의 금속 함량(예: 니켈 축적 55,56,57 또는 식물의 길가 오염 58,59,60)과 다른 나비목 49,50,51의 금속 내성에 대한 사전 관찰을 기반으로 금속 농도를 목표로 합니다.
    5. 인공 식단에 추가하기 위해 해당 양을 복용하기 전에 500-1,000mL의 증류수에 금속염을 녹입니다. 예를 들어, 100ppm 니켈 다이어트를 만들기 위해 블렌딩하기 전에 인공 다이어트에 1M NiCl2 용액 317.6mL를 추가하여 최종 다이어트 농도가 100mg/g Ni 건조 중량(약 53mg/g 습윤 중량)이 되도록 합니다. 이 양은 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법을 기반으로 한 109.6ppm의 평균 측정 농도로 변환됩니다(표 2).
      참고: 금속 수준은 미네소타 대학의 Research Analytical Labs에서 6개의 샘플로 추정했습니다.
  3. 정비
    1. 숙주 식물에서 수확한 알을 기후 챔버에서 23°C에서 14:10 광주기로 7일 동안 유지합니다. 그 후, 초기 두 번째 instar 애벌레를 인공 식단으로 옮깁니다.
    2. 옮길 때, 주어진 식물의 유충을 4가지 식단 유형에 걸쳐 균등하게 나누어 유충 배치를 식단 유형과 혼동하지 않도록 합니다. 유충(N = 총 346마리)을 118mL 다이어트 컵당 2마리로 옮겨 과밀로 인한 질병 발병률을 줄이고 성충이 결국 둘러쌀 수 있는 충분한 공간을 확보합니다.
    3. 양육 컵의 뚜껑에 구멍(뚜껑당 3개)을 뚫습니다. 컵을 신발장 크기의 플라스틱 통에 넣어 사육실의 위치가 체계적으로 영향을 미치지 않도록 다양한 식단이 산재되어 있습니다.
    4. 14:10 광주기에 23°C의 기후 챔버에 유충 컵을 보관합니다(습도를 약 50%-60%로 유지하기 위해 챔버 바닥에 물통이 있고 가정용 습도 센서로 모니터링됨). 컵에 곰팡이가 생기면 (이 사례 연구에서는 총 8 개의 컵) 챔버에서 컵을 제거하고 실험에서 해당 개인을 제거하십시오.
    5. 유충이 번데기를 타고 사육 컵에서 나오도록 합니다(N = 총 162개).
      참고: 이 연구의 사육 조건의 경우 난자 채취에서 성충 출현까지의 발달 시간은 평균 약 25-30일(예: 25,28일 범위)이었습니다.
    6. 번데기가 성충 출현에 접근함에 따라 매일 컵에 새로 닫힌 개체가 있는지 확인하고 마른 날개를 가진 성충을 제거하십시오. 끝이 가늘고 검은 색 샤피를 사용하여 뒷날개에 해당하는 개인 번호 (애벌레 이동시 할당)로 성인을 표시하십시오. 각 개인의 성별을 결정하고 글라신지 봉투에 번호 및 출현 날짜와 함께 표시하십시오. 성체 나비를 글라신지 봉투에 넣고 추가 처리가 이루어질 때까지 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 신흥 성인의 소수는 비행 및 성인 생존을 방해하는 날개 기형을 보입니다(5%-8%). 이러한 개인은 이러한 실험에 대한 생존 분석에서 제외됩니다.
  4. 측정 및 데이터 분석
    1. 두 번째 instar (애벌레가 식단에 놓였을 때)부터 성인 출현까지의 생존으로 생존을 측정합니다.
      참고: 본 연구는 다양한 식단에 대한 수행 척도로서 생존 및 발달 시간에 초점을 맞췄습니다.
    2. 발달 시간을 식이요법으로의 전환과 기후 챔버에서 성인의 출현 사이의 일수로 측정합니다.
    3. 데이터 분석을 위해 금속과 농도 간의 교호작용이 포함된 두 세트의 모형을 실행합니다.
      참고: 두 상호작용 모두 유의했기 때문에(NS 2,194 = 4.56, NS = 0.01 발달 시간 및 X2 = 12.1, NS = 0.002 생존), 연구는 각 금속에 대한 별도의 분석을 진행했습니다.
    4. 생존을 분석하려면 각 금속에 대해 카이제곱 검정을 실행하여 날개가 완전히 손상되지 않은 상태에서 성체까지의 생존에 대한 금속 선량(4가지 범주로 처리됨)의 영향을 검정합니다.
    5. 용량의 유의미한 효과가 감지되면 추적 카이제곱을 수행하여 각 수준을 대조군 식단과 비교합니다. 발달 시간(전이 시점부터 성인으로 출현할 때까지)을 분석하기 위해 발달 시기에 대한 성의 영향을 테스트합니다.
      참고: 이 실험에서 모든 금속에 대해 발달 시간(p > 0.10)에 대한 성별의 영향이 없었기 때문에 모델에서 고려 대상에서 제외했습니다.
    6. 각 금속에 대해 별도의 ANOVA를 실행하여 4가지 농도가 현상 시간에 미치는 영향을 테스트합니다. 또한 대조군을 기준으로 각 농도에 대해 t-검정을 실행하여 성능 효과가 나타나는 최소 농도를 확인합니다.
      참고: 이 연구에서는 모든 분석에 JMP v16을 사용했습니다. 모든 원시 데이터는 Mendeley61에서 사용할 수 있습니다.

Representative Results

개요
인공 식단은 나비 성능에 대한 특정 식단 성분의 효과를 테스트하기 위해 표준 조건에서 양배추 흰 나비를 키우는 데 사용할 수 있습니다. 현재 연구에서는 오염된 지역에서 자라는 숙주 식물에서 발견되는 다양한 금속의 독성을 연구하기 위해 인공 사료를 사용했습니다(그림 1). 유충은 세 가지 다른 금속의 농도가 증가하는 식단에서 자랐습니다(그림 2, 프로토콜의 섹션 6에 제시된 구체적인 방법론적 세부 사항). 나비의 생존과 발달은 구리와 아연의 영향을 더 많이 받았고 니켈의 영향을 가장 적게 받았으며(그림 3 및 그림 4), 인공 사료로 키운 나비와 나방을 대상으로 한 다른 연구와 비슷한 민감도를 보였습니다(그림 5).

생존
나비 유충은 구리, 니켈, 아연 또는 대조군을 포함하는 인공 사료로 옮겨졌으며, 각 금속 유형은 세 가지 수준에서 농도가 다양했습니다(표 3). 독소의 복용량이 증가한 유충의 대표적인 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 니켈의 생존에 대한 금속 농도의 영향은 없었지만 구리와 아연 모두에 상당한 영향을 미쳤습니다(표 3 및 그림 3). 사후 카이제곱 비교는 아연이 가장 높은 수준의 아연에서만 대조군 식단에 비해 생존율 감소를 보였다는 것을 보여주었습니다(1,000ppm, 사후 비교 X12 = 8.41, p = 0.004; 그림 1). 구리는 또한 사용된 최고 수준(500ppm, X12 = 7.00, p = 0.008)에서만 생존율이 유의하게 감소한 것으로 나타났지만, 두 가지 가장 낮은 수준(50ppm 및 100ppm; 그림 3).

개발 시간
구리와 아연 농도가 발달 시간에 상당한 영향을 미쳤습니다(표 4 및 그림 4). 구리 농도가 증가함에 따라 개발 시간이 증가했으며 50ppm에서 시작하여 대조군과 상당한 편차가 있었습니다(p = 0.027; 그림 3). 아연 농도가 증가함에 따라 발달 시간이 증가했으며 100ppm에서 시작하여 대조군과 상당한 편차가 있었습니다(p = 0.03; 그림 4). 니켈을 증가시켜 발달 시간이 길어지는 경향이 있었습니다(p = 0.08; 표 4), 각 식단과 대조군의 비교는 100ppm에서 시작하여 유의한 효과를 보였다(p =0.022; 그림 4).

Figure 1
그림 1: 나비 조직과 숙주 식물에서 관찰된 초점 금속 수준. (62의 데이터.) 구리, 니켈 및 아연의 수준은 Pieris 나비 조직(실험실에서 청경채에서 사육됨)과 야생에서 채집한 겨자(Bertorea sp.)에 대해 표시됩니다. 자동차는 교통량이 많은 도로(53)를 따라 식물 잎에서 볼 수 있는 수준을 나타냅니다. 이 연구에 사용된 인공 식단의 금속 수준은 표 1에 보고되어 있습니다. 점은 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 같은 날 독소 농도가 증가하는 인공 사료로 옮겨진 양배추 흰 유충의 이미지. 이 이미지는 용량-반응 연구의 유충을 보여줍니다(독성 식물 Aristolochia에 대한 건조 식물 재료를 사용하여 28에서 제시됨). ESR의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 농도가 증가하는 금속 식단에 따른 생존율의 변화. 별표는 대조군 식단에 비해 생존율의 상당한 편차를 나타냅니다. 식단의 정확한 금속 농도는 표 2에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 금속 농도가 개발 시간에 미치는 영향. 별표는 대조군에 비해 유의한 차이가 있는 가장 낮은 금속 농도를 나타냅니다(t-검정 사용). 식단의 정확한 금속 농도는 표 2에 나와 있습니다. 점은 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 다른 나비목의 금속 내성 요약. 11개의 기존 연구(49,50,51,56,63,64,65,66,67,68)에서 플롯된 복합 생존 데이터가 표시됩니다. 반응 변수는 생존에 대한 부정적인 영향이 처음 나타나는 금속 농도의 수준(ppm)입니다. 나비는 니켈에 대한 허용 오차 값이 이 연구에서 측정된 값보다 높다는 점에 주목하여 이 연구의 결과를 나타냅니다. 점은 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

성분 무게: g mL
밀 배아 건조 성분 50
셀 루 로스 건조 성분 10
양배추 가루 건조 성분 15
카제인 건조 성분 27
자당 건조 성분 24
웨슨 소금 믹스 건조 성분 9
토룰라 효모 건조 성분 12
콜레스테롤 건조 성분 3.6
비타민 믹스 건조 성분 10.5
메틸 파라벤 건조 성분 0.75
소르빈산 건조 성분 1.5
아스코르브산 건조 성분 3
스트렙토마이신 건조 성분 0.175
아마씨 기름 젖은 재료 5
한천 한천 15

표 1 : 인공 다이어트를위한 조리법. 표시된 것은 양배추 흰 나비 식단의 한 배치에 있는 재료의 무게(및 부피)입니다. 건조 성분 (및 아마씨 오일)은 한천 혼합물 (끓는 물 400mL에 용해 된 다음 실온의 물 400mL로 더 차가운 온도로 가져옴)과 별도로 준비됩니다.

다이어트 유형 구리 (ppm) 니켈 (ppm) 아연 (ppm)
구리-"100ppm" 96.1 1.75 69.9
니켈 - "100ppm" 7.29 109.6 68.9
아연-"100ppm" 7.96 1.06 186.2
아연-"500ppm" 6.51 1.16 708
제어 5.89 0.59 59.3

표 2 : 식단에서 금속의 측정. 연구에 사용된 인공 식단의 하위 집합에서 구리, 니켈 및 아연의 평균 수준이 표시됩니다. 다이어트 이름(분석에서 "유형")은 왼쪽에 표시되며 따옴표 안의 값은 계산된 수준입니다. 목표 농도는 따옴표로 표시됩니다. 연구에 사용된 식단의 하위 집합을 분석하여 계산된 값이 실현된 값으로 목표에 도달했는지 확인했습니다. 식이 성분의 구성에는 종종 약간의 차이가 있으며 보고된 각 선은 단 하나의 반복을 나타낸다는 점에 유의해야 합니다.

나tal 피어슨 X32 P
구리 (N = 118) 17.82 0.0005
니켈 (N = 152) 3.45 0.33
아연 (N = 152) 12.52 0.006

표 3: 금속 농도가 생존에 미치는 영향. 각 금속에 대한 카이제곱 검정의 결과를 나타낸 것으로, 대조군 사료와 비교하여 세 가지 금속 농도를 대조합니다.

금속 F P
구리 (N = 61) 에프3,57 = 9.84 <0.0001
니켈 (N = 75) 에프3,71 = 2.35 0.079
아연 (N = 64) 에프3,60= 3.79 0.015

표 4: 금속 농도가 현상 시간에 미치는 영향. 각 금속에 대한 개별 ANOVA의 결과가 표시됩니다.

데이터 가용성:

모든 데이터는 Mendeley61에서 사용할 수 있습니다.

Discussion

이 연구에서는 중금속 독성의 차이를 조사하기 위해 양배추 흰 나비 (Pieris rapae)를 인공 식단으로 키웠다. 그렇게 함으로써 이 연구는 이 조작하기 쉬운 나비 시스템에 대한 사육 및 실험실 연구를 위한 일반적인 방법을 제공합니다. 이 토론은 먼저 여기에서 검토한 방법에 대한 보다 일반적인 질문을 고려한 다음 인공 식단의 구성 요소에 대한 성찰로 결론을 내리기 전에 과학적 발견을 검토합니다.

여기에서 검토한 프로토콜은 양배추 흰 나비에 대한 일반적인 사육 방법의 단계를 제공하지만 이 프로토콜에는 조정할 수 있는 많은 사항이 있습니다. 예를 들어, 여기에 제시된 사례 연구는 먹이를 위해 스펀지를 사용하지만, 다른 연구자들은 꿀 물로 채워진 치과 심지와 실크 꽃으로 운이 좋았습니다5. 본 연구에서는 꿀 물을 음식으로 사용하지만 다른 연구자들은 설탕 용액과 게토레이를 사용했습니다. 번데기의 체중을 측정하거나 출현을 위해 다른 조건으로 옮겨야 하는 경우(예: 휴면을 유도하고 1개월 동안 냉장 보관해야 하는 경우) 연구원은 물을 뿌려 실크 부착물을 적시고 깃털 집게로 잡은 다음 양면 테이프를 사용하여 다시 걸어 컵에서 쉽게 제거할 수 있습니다. 연구자들이 성인 나비가 성인 행동을 위해 새장으로 옮겨 질 때 더 많은 유연성이 필요하다면 몇 주 동안 냉장고에 보관할 수 있지만 먹이를 주어야합니다. 며칠에 한 번씩 나비를 꺼내 묽은 꿀 물 용액을 먹여야합니다. 실내 조명 아래에서는 핀을 사용하여 코를 음식에 펼치면 됩니다. 성인 공연 끝에서 양배추 흰 나비에 대해 다양한 피트니스 조치를 취할 수 있습니다. 몸 크기는 특정 단계, 번데기 또는 성충 (희생되거나 글라신 봉투에 보관됨)에서 유충의 습식 또는 건조 덩어리로 측정하거나 프로그램 ImageJ (12,24,25,28 참조)에서 날개 길이 측정을 통해 측정 할 수 있습니다. 암컷의 평생 번식력은 숙주 식물 25,69,70에 대한 일일 난자 수집을 통해 측정할 수 있으며 특정 형질의 크기는 성능의 척도로 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌 또는 개별 뇌 영역(62,71,72)의 질량 또는 부피, 또는 흉부 또는 비행 근육(62,70)의 질량 또는 단백질 함량. 마지막으로, 성인은 먹이 찾기 또는 산란 선택에 대한 식단 조작의 효과를 조사하는 여러 질문을 테스트하기 위해 행동 연구에 사용될 수 있습니다27,73.

양육 프로토콜이 예상대로 작동하지 않는 경우 문제를 해결해야 하는 몇 가지 측면이 있습니다. 첫째, 빛의 수준이 정상적인 성인 행동을 이끌어 낼만큼 충분히 높은지 물어볼 수 있습니다. 실험실에서 개조한 Pieris 라인은 형광등 아래에서 알을 낳지만 야생형 라인에 작동하는 유일한 인공 조명은 강력한 광역 스펙트럼 온실 조명입니다. 온실, 창턱 또는 야외의 자연광은 짝짓기와 알을 낳는 행동을 유도하는 데 가장 효과적입니다. 둘째, 알이 부화하지 않거나 유충이 발달 초기에 죽어가는 경우 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 숙주 식물 재료는 유기농이어야 하며, 상점의 "유기농" 식물은 때때로 유충을 죽일 수 있는 화학 물질로 처리되므로 자신의 숙주 식물을 기르는 것이 가장 좋은 경우가 많습니다. 숙주 수용률이 낮 으면 질소 함량이 높은 어린 잎을 시도하여 개별 잎 대신 화분에 심은 식물을 제공하고 암컷이 짝짓기를하도록합니다. 암컷은 2 주령의 작은 새싹조차도 Brassica를 뿌릴 것입니다. 파라핀 방법은 알을 다른 조건으로 옮기는 데 효과적이지만 수용률은 전체 식물보다 낮은 경향이 있습니다. 셋째, 식단의 모든 구성 요소는 고품질이어야하며 만료되지 않아야합니다. 아마씨 기름은 매년 교체하고 냉장고에 보관해야합니다24,25. 밀 배아, 비타민 믹스 및 항생제도 시원하게 유지해야 합니다. 넷째, 다이어트 컵 설정을 조정하는 것을 고려할 수 있습니다. 1온스에서 15온스까지 다양한 종류의 일회용 플라스틱 컵을 사육에 사용할 수 있습니다. 우리는 4온스가 성인의 출현을 허용하기에 좋은 크기이며 기후 챔버에 잘 포장된다는 것을 발견했습니다. 뚜껑에 구멍을 뚫으면 공기 흐름이 가능하지만 구멍이 너무 많으면 습도가 낮은 조건에서 식단이 건조될 수 있으므로 이 숫자를 조정해야 할 수도 있습니다. 다섯째, 기후 챔버의 조건은 컵 조건과 함께 조정해야 할 수도 있습니다. 조건이 너무 건조하면 유충이 옮겨지기 전에 알을 낳은 숙주 식물이 말라 버릴 수 있으며, 나비가 나오기 전에 식단이 담긴 컵이 마를 수 있습니다. 반면에 조건이 너무 습하면 컵에 곰팡이와 질병이 생길 수 있습니다. 연구원은 메쉬 뚜껑을 사용하거나 뚜껑에 더 많거나 적은 구멍을 사용하여 컵의 공기 흐름을 조정해야 할 수도 있습니다. 또 다른 일반적인 문제는 컵의 온도 변화와 결로 현상을 일으킬 만큼 충분히 밝은 챔버 조명입니다. 조광기 조명을 사용하는 것은 애벌레 사육을 위한 쉬운 옵션입니다.

이 논문의 연구 질문과 관련하여 이 연구는 양배추 흰자가 니켈이나 아연보다 구리에 상대적으로 더 민감하다는 것을 발견했습니다. 구리는 50ppm의 낮은 농도에서 발달 시간(그림 3 및 표 3)과 500ppm에서 생존에 상당한 부정적인 영향을 미쳤습니다(그림 4, 표 4). 대조적으로, 니켈이 생존에 미치는 부정적인 영향은 없었습니다(최대 500ppm; 그림 3) 또는 100ppm에서 개발 시간에 대한 부정적인 영향(그림 4). 양배추 흰자는 아연에 대해 상당히 내성이 있었으며 생존 효과는 1,000ppm(그림 3)에 불과했고 발달 시간은 100ppm(그림 4)에서 시작하여 부정적인 영향을 미쳤습니다. 나비 조직과 겨자(그들의 숙주 식물; 그림 1), 아연에 대한 상대적으로 더 큰 내성이 나타날 것으로 예상되었습니다. 그러나 구리에 대한 민감도와 니켈의 내성은 나비 조직의 니켈 수치가 매우 낮고(그림 1) 미량 영양소로서 구리가 필요하다는 점을 감안할 때 다소 예상치 못한 것이었습니다. 이러한 예상치 못한 발견은 다른 나비와 나방에서 이러한 금속의 내성을 고려한 후 아래에서 논의됩니다.

현재 데이터를 다른 나비목에서 측정된 금속 민감도와 비교하기 위해 중금속이 생존에 부정적인 영향을 미치는 최소 농도에 대해 기존 연구의 데이터를 수집했습니다 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; 이 연구는 나방, 특히 해충 종(Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.)에 초점을 맞췄습니다. 이 연구에서 측정된 모든 민감도 값은 이러한 다른 종에 대해 측정된 범위에 가깝습니다(그림 5). 그러나 이 연구에서 니켈 내성의 측정은 예상보다 높은 것으로 보입니다 - 500ppm에서 생존의 유의미한 영향은 없었지만, Pieris rapae에 대한 이전 연구에서도 니켈에 대한 매우 높은 내성을 발견했습니다(1,000ppm에서 시작하는 유의한 효과56), 자연적으로 조직에서 낮은 수준에도 불구하고(그림 1). 이 연구에서 구리 민감도의 측정은 나비목 연구에서도 낮은 것으로 보입니다. 인공 식단을 사용하면 상대적인 금속 민감도를 편리하고 통제된 비교가 가능하지만 식단의 구성 요소가 절대 금속 민감도 측정을 변경할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 식단에 포함된 비타민 C는 금속에 의한 산화 스트레스를 상쇄할 수 있으며74, 또는 식단에 포함된 항생제는 금속 가공에 대한 미생물의 영향을 변화시킬 수 있다75. 향후 연구의 흥미로운 라인은 특히 나비목 장내 미생물 76,77 및 항산화 특성을 가질 수 있는 과즙 성분의 기능적 역할에 대한 질문을 감안할 때 금속 독성에 대한 효과를 테스트하기 위해 이러한 식단 성분을 체계적으로 조작하는 것입니다78. 또한, 종에 따른 식이 요구 사항의 차이는 종간 비교를 어렵게 만들 수 있으며 인공 식단 기반 방법은 숙주 식물의 조작으로 보완되어야 합니다.

이 나비는 특히 니켈에 내성이 있고 구리에 민감합니다. 이전 연구에 따르면 Pieridae가 선호하는 식물을 포함하는 겨자과의 많은 식물은 초식 동물 55,56,63,79,80,81에 대한 방어 메커니즘으로 니켈을 과도하게 축적합니다. 이 과다 축적은 식물 조직에서 1,000ppm 이상이며, 이는 대부분의 식물에서 볼 수 있는 것보다 훨씬 더 큽니다(그림 1). Pieris는 이전에 추측 된 바와 같이 이러한 니켈 축전지에 의한 과거 선택으로 인해 니켈에 대해 특히 높은 내성을 가질 수 있습니다(26). 구리는 곤충 식단에서 미량 영양소로 덜 자주 연구되었지만 주로 혈액을 공급하는 곤충에서 번식과 면역에 작은 역할을 한다는 증거가 있습니다(예: 82,83). 구리는 다른 동물보다 나비에서 덜 중요한 생리학적 역할을 할 수 있으며(84,85,86), 구리가 납, 카드뮴 및 수은과 같은 곤충 오염 물질에 대해 어떻게 관련될 수 있는지를 강조하는 최근 연구와 일치합니다(예: 87,88,89). Pieris는 낮은 수준의 구리 오염을 피하는 것으로 나타났지만90, 식물에서 구리의 이동성(예: 잎과 꽃으로 이동)은 또한 우려되는 금속 오염 물질로 표시되었습니다91.

이러한 결과는 양배추 흰 나비에 대한 이러한 금속의 상대적 독성에 대한 흥미로운 데이터를 제공하지만, 이 논문은 또한 이 강력한 시스템을 기르는 방법에 대한 자세한 시각적 설명으로 일반적으로 사용되는 것을 목표로 합니다. 양배추 흰자는 통제된 실험실 실험에서 쉽게 기르고 조작할 수 있습니다.4,5 숙주 찾기 6,7,8, 먹이 찾기 9,10,11 및 성 선택12,13,14에 대한 연구를 용이하게 합니다. 인공 식단에서 이 나비를 기르는 능력은 비교를 위한 일반적인 정원 조건을 만들고 영양분, 독소 및 새로운 숙주 식물을 조작하는 데 중요합니다. 그러나 이 인공 식단이 반드시 이 종에 대한 최적의 인공 식단은 아니며 향후 조작을 통해 개선될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 이 식단(및 기타 나비목 식단)의 소금 혼합은 원래 척추동물을 위해 개발되었으며 대부분의 곤충이 필요로 하는 것보다 더 높은 칼슘 수치를 가지고 있습니다92,93. 따라서, 우리의 사육 노력 중 일부는 칼슘 수치가 낮은 맞춤형 소금 혼합물(예: 62)을 만들었고, 다른 것들은 많은 곤충 종에 더 적합할 수 있는 "Beck's salt mix"를 사용했다94. 우리 자신의 조작에서, 우리는 나비가 원래 농도에 비해 상대적으로 적은 밀 배아와 상대적으로 더 많은 셀룰로오스로 더 잘 수행된다는 것을 발견했다4. 더 많은 주의가 필요한 영역 중 하나는 식단의 지질 공급원과 농도입니다. 예를 들어, 과거 연구에 따르면 아마인유(이 연구에서 사용됨)에서 인지질로 전환하면 인공 식단에서 Pieris의 짝짓기 속도와 성장률이 증가한 것으로 나타났습니다95. 인공 식단에서 특정 지방산을 보충하면 추가적인 긍정적 인 효과가 나타날 수 있습니다96,97. Pieris98,99의 인공 식단을 최적화하면 영양 생태 학100,101,102, 진화 생태학 및 생태 독성학에 대한 흥미로운 질문을 해결할 수 있습니다. 이러한 인공식이요법을 통해 연구자들은 인지진화(cognitive evolution)103, 독소에 대한 사전 적응(pre-adaptation)28, 오염물질(pollutants)의 독성을 감소시키는 식이성분(diet components)104, 또는 영양소(nutrients)105 사이의 화학량론적 상호작용(chemichiometric interaction)에서 특정 지질의 역할에 대한 질문을 할 수 있다.

Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 이 일을 위해 양육하는 동안 학부 조교들, 특히 Regina Kurandina와 Rhea Smykalski의 지원에 감사드립니다. Carolyn Kalinowski는 다른 나비목의 금속 독성에 관한 문헌을 편집하는 데 도움을 주었습니다. 이 연구는 미네소타 대학의 생태, 진화 및 행동학과 여름 연구 보조금으로 가능했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon - Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon - Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon - Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon - Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B

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References

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생물학 문제 198
통제 된 조건에서 양배추 흰 나비 (<em>Pieris rapae</em>) 키우기 : 중금속 내성 사례 연구
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