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Biology

Aufzucht des Kohlweißlings (Pieris rapae) unter kontrollierten Bedingungen: Eine Fallstudie mit Schwermetalltoleranz

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65383
Automatic Translation
1, 1,2
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Summary

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht des Kohlweißlings unter kontrollierten Laborbedingungen mit einer künstlichen Ernährung vorgestellt, die eine präzise Manipulation der Ernährung in jungen Jahren und der Toxinexposition ermöglicht. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie die Schwermetalltoxizität mit diesem Protokoll untersucht werden kann.

Abstract

Der Kohlweißling (Pieris rapae) ist ein wichtiges System für die angewandte Schädlingsbekämpfungsforschung und die Grundlagenforschung in der Verhaltens- und Ernährungsökologie. Kohlweißling kann leicht unter kontrollierten Bedingungen mit einer künstlichen Ernährung aufgezogen werden, was ihn zu einem Modellorganismus der Schmetterlingswelt macht. In dieser Arbeit wird eine Manipulation der Schwermetallexposition verwendet, um grundlegende Methoden zur Aufzucht dieser Art zu veranschaulichen. Das allgemeine Protokoll veranschaulicht, wie Schmetterlinge im Freiland gefangen, dazu gebracht werden können, Eier in Gewächshauskäfige zu legen, und als Larven in künstliche Ernährung überführt werden können. Die Methoden zeigen, wie Schmetterlinge für eine Vielzahl von Forschungsfragen markiert, vermessen und untersucht werden können. Die repräsentativen Ergebnisse geben eine Vorstellung davon, wie künstliche Diäten, die in ihren Bestandteilen variieren, verwendet werden können, um die Leistung von Schmetterlingen im Vergleich zu einer Kontrolldiät zu bewerten. Genauer gesagt waren Schmetterlinge am tolerantesten gegenüber Nickel und am wenigsten tolerant gegenüber Kupfer, mit einer Toleranz von Zink irgendwo in der Mitte. Mögliche Erklärungen für diese Ergebnisse werden diskutiert, darunter die Hyperakkumulation von Nickel in einigen Senfwirtspflanzen und jüngste Hinweise bei Insekten, dass Kupfer giftiger sein könnte als bisher angenommen. Schließlich werden in der Diskussion zunächst Variationen des Protokolls und Anweisungen zur Fehlerbehebung dieser Methoden besprochen, bevor erörtert wird, wie zukünftige Forschung die in dieser Studie verwendete künstliche Ernährung weiter optimieren könnte. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen detaillierten Videoüberblick über die Aufzucht und Messung von Kohlweißling mit künstlicher Ernährung und bietet eine Ressource für den Einsatz dieses Systems in einer Vielzahl von Studien.

Introduction

Der Kleine Kohlweißling (Pieris rapae, im Folgenden "Kohlweißling") ist eine kosmopolitische Schädlingsart von Senfkulturen wie Kohl, Brokkoli und Raps 1,2,3. Gleichzeitig ist der Kohlweißling ein leistungsfähiges System für die Forschung in der Biologie und ein häufig verwendetes Schmetterlingsmodell, da er in kontrollierten Laborexperimenten leicht aufgezogen und manipuliert werden kann 4,5. Die Forschung an Kohlweißlingen hat wichtige Erkenntnisse in Bezug auf die Wirtssuche 6,7,8, die Nutzung von Nektarressourcen9,10,11, die Partnerwahl und sexuelle Selektion 12,13,14, die Entwicklung und Evolution von Flügelmustern15,16,17 und die Reaktionen auf neue und sich verändernde Umgebungen18,19. Viele dieser Erkenntnisse beruhen auf der Tatsache, dass Kohlweißling mit künstlichem Futter 4,20,21 gezüchtet werden kann, das präzise manipuliert werden kann, um schlechte Ernährungsbedingungen 22,23, ökologisch relevante Schadstoffwerte 24,25,26,27 oder Übergänge zu neuartigen Wirtspflanzen28,29 widerzuspiegeln . In der vorliegenden Arbeit werden anhand eines Experiments zur Schwermetallexposition grundlegende Methoden zur Aufzucht von Kohlweißlingen mit künstlicher Diät im Labor sowie wichtige Leistungsmaße von Larven und adulten Tieren veranschaulicht. Viele Aspekte dieser Methoden gelten auch für andere Schmetterlinge 30,31 und Motten32,33,34, die mit künstlicher Nahrung aufgezogen werden können.

In dieser Arbeit wird ein Experiment zur Metalltoleranz verwendet, um die allgemeinen Methoden zur Aufzucht von Kohlweißlingen zu veranschaulichen. Schwermetalle sind ein häufiger anthropogener Schadstoff, der durch den Abbau menschlicher Produkte, industrieller Prozesse und Altlasten durch die historische Verwendung in Pestiziden, Farben und anderen Produkten entsteht35,36,37,38. Viele Schwermetalle, darunter Blei, Kupfer, Zink und Nickel, können aus Boden und Wasser in das Pflanzengewebe gelangen 39,40,41,42, und Metalle im Staub können sich auf Pflanzenblättern ablagern 43,44,45, was zu mehreren Expositionswegen gegenüber phytophagen Insektenlarven führt. Eine frühe Schwermetallexposition kann negative Auswirkungen auf die Entwicklung der Tiere haben, insbesondere auf das Nervengewebe, und hohe Konzentrationen können tödlich sein 35,36,46,47,48. Eine Reihe von Studien hat die negativen Auswirkungen der Metallbelastung auf sich entwickelnde Insekten gezeigt, sowohl auf Schädlinge als auch auf nützliche Insekten 49,50,51. Die große Anzahl von Schwermetallschadstoffen und die Tatsache, dass sie häufig gleichzeitig in der menschlichen Umwelt vorkommen52, bedeutet, dass präzise Labormethoden erforderlich sind, mit denen Forscher sich entwickelnde Insekten unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen verschiedener Metalle aussetzen können, um ihre Umweltauswirkungen zu verstehen und abzumildern.

Die vorliegende Arbeit vergleicht die Auswirkungen gängiger Metalle auf das Überleben und die Entwicklung von Kohlweißlingen, wobei der Schwerpunkt auf Kupfer (Cu), Zink (Zn) und Nickel (Ni) liegt, drei häufige Schadstoffe in der menschlichen Umwelt. Zum Beispiel enthalten Kräuter von ländlichen Straßenrändern in Minnesota bis zu 71 ppm Zn, 28 ppm Cu und 5 ppm Ni53. Dieses Experiment manipuliert den Gehalt dieser Metalle in der künstlichen Ernährung von Kohlweißfaltern auf Konzentrationen, die den in der Umwelt beobachteten Werten entsprechen und diese übertreffen. Eine künstliche Diät wird verwendet, um die relative Toxizität dieser Metalle zu kontrastieren, indem vorhergesagt wird, dass Kohlweißling empfindlicher auf Metallschadstoffe reagieren würde, die kein integraler Bestandteil ihrer Physiologie sind (Nickel), im Vergleich zu denen, die, wenn auch in geringen Mengen, in Enzymen und Geweben (Kupfer und Zink; Abbildung 1). Durchgehend bietet dieser Text methodische Details und begleitende Videovisualisierungen, um die Aufzucht- und Forschungsmethoden dieses wichtigen Schmetterlingsmodellsystems zu veranschaulichen.

Protocol

Diese Forschung wurde im Rahmen der USDA-APHIS-Genehmigung P526P-13-02979 durchgeführt.

1. Sammlung experimenteller Schmetterlinge

  1. Fangen Sie erwachsene weibliche Schmetterlinge mit einem Insektennetz aus der Luft. Kohlweißling kommt in der Regel in offenen, gestörten Lebensräumen mit Nektarpflanzen und Wirtspflanzen (Familie Brassicaceae) vor.
    1. Suchen Sie, wenn die Sonne scheint und die Temperatur warm ist. Um Weibchen ins Visier zu nehmen, halten Sie Ausschau nach Individuen, die langsam und nahe am Boden flattern und auf Pflanzen landen, um die Blätter mit ihren Vordertarsen zu "trommeln" (zu schmecken).
  2. Setzen Sie die Weibchen in Käfige, um Eier zu ernten.
    HINWEIS: Weibchen, die im Feld gesammelt wurden, haben sich im Durchschnitt mit einem oder zwei Männchengepaart 12 und sollten kurz nach dem Fang mit der Ablage befruchteter Eier beginnen. Wildgefangene Weibchen brauchen natürliches Licht, um Eier zu legen und sich zu paaren, also stellen Sie den Käfig in ein Gewächshaus oder eine Fensterbank.
  3. Unterbringe Weibchen mit einer Wirtspflanze, um Eier zu ernten.
    HINWEIS: Weibchen akzeptieren eine Vielzahl von Wirtspflanzen, darunter Grünkohl, Rettich, Grünkohl, Kohl und Arabidopsis, stellen jedoch sicher, dass die Pflanzen nicht mit Pestiziden behandelt wurden.
    1. Präsentieren Sie die Wirtspflanzen entweder in Töpfen oder in Behältern mit Wasser, um den Blattdruck aufrechtzuerhalten, z. B. Grünkohlstängel in Blütenwasserröhrchen.
    2. Wenn der Forscher Eier sammeln und direkt in die Nahrung überführen möchte, verwenden Sie zuerst ein Gummiband, um ein Wirtspflanzenblatt an der Oberseite eines Plastikbechers mit Wasser zu befestigen, und spannen Sie dann ein Stück Parafilm um den Rand - Weibchen, die das Blatt berühren, legen Eier auf den Parafilm (siehe5).
  4. Stellen Sie sicher, dass der Käfig auch etwas enthält, um die relative Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, z. B. durch tägliches Gießen einer Topfpflanze oder Befeuchten eines Handtuchs, insbesondere unter trockenen Bedingungen. Wenn Topfpflanzen im Käfig gegossen werden, stellen Sie sicher, dass sich ein Handtuch unter dem Topf befindet, da Schmetterlinge im Wasser stecken bleiben können.
  5. Füttern Sie die Schmetterlinge mit einer 10%igen verdünnten Honigwasserlösung, die auf einem gelben Schwamm präsentiert wird, den Schmetterlinge schnell lernen, zu verwenden, insbesondere wenn sie mit erfahrenen Personen untergebracht sind.
    1. Um Schmetterlinge zu ermutigen, sich von Schwämmen zu ernähren, legen Sie sie direkt auf das Futterhäuschen, insbesondere nach leichtem Besprühen mit einer Wasserflasche, was oft dazu führt, dass sie ihren Rüssel herausstrecken.
    2. Um den Feeder aufzustellen, spülen Sie zuerst die gelben oder orangefarbenen Schwämme gründlich aus und schneiden Sie sie dann in kleine Quadrate, die in 60-mm-Kunststoff-Petrischalen passen. Wechseln Sie die Futterspender täglich und reinigen Sie die Schwämme in einer milden Bleichlösung, gefolgt von einer gründlichen Spülung, um Schimmelbildung zu verhindern.

2. Künstliche Diäten herstellen

  1. Verwenden Sie zunächst das Rezept in Tabelle 1 oder andere relevante Quellen, um das relevante Rezept für einen Versuch zu bestimmen. Nehmen Sie die erforderlichen Änderungen vor, die für die Fokusspezies oder das Experiment spezifisch sind. Drucken Sie ein Rezept aus, das Sie beim Abwiegen der Zutaten befolgen können.
  2. Wiegen Sie alle trockenen Zutaten, mit Ausnahme des Agars, in einen Behälter. Stellen Sie sicher, dass die Zutaten wieder an ihren jeweiligen Lagerort zurückgebracht werden, und beachten Sie, dass mehrere Zutaten bei 4 ° C gelagert werden. Geben Sie die vorgewogene, trockene Zutatenmischung mit 5 ml Leinsamenöl in einen Mixer.
  3. Befolgen Sie für jede Diätcharge die unten aufgeführten Schritte.
    1. 15 g feinmaschiges Agar mit 400 ml destilliertem Wasser in einem mindestens 1 l großen Becherglas mischen. Mikrowelle stellen, bis der Agar fast kocht, mit feinen Blasen in der gesamten Mischung, und rühren Sie die Mischung alle 30-60 s um, um ein Überkochen zu verhindern.
    2. Fügen Sie dieser heißen Agar-Mischung 400 ml destilliertes Wasser mit Wasserhahntemperatur hinzu, um es auf eine geeignete Temperatur zu bringen, um es mit den trockenen Zutaten zu mischen, da die Vitaminmischung hitzeempfindlich ist.
    3. Geben Sie die Agar-Agar-Mischung in den Mixer und mischen Sie sie gründlich, wobei Sie bei Bedarf die Ränder des Mixers abkratzen.
  4. Während sich der Agar erhitzt, stellen Sie mindestens vierzig Vier-Unzen-Diätbecher so auf die Theke, dass sich die Ränder berühren. Nachdem Sie die Diät gründlich gemischt haben, gießen Sie die Mischung aus dem Mixer in Diätbecher und stellen Sie sicher, dass die Diät den Boden jeder Tasse bedeckt.
  5. Nachdem die Diät abgekühlt ist, setzen Sie die Deckel auf die Becher, beschriften Sie die Diätbecher mit Diättyp, stapeln Sie sie auf Tabletts und lagern Sie sie bis zu 1 Monat bei 4 °C bis zur Verwendung.

3. Transfer und Aufzucht mit künstlicher Ernährung

  1. Hauswirtspflanzenblätter mit Schmetterlingseiern in 30-Unzen-Feinkostbechern mit Netzabdeckung in einer 24 °C Klimakammer. Überprüfen Sie nach 1 Woche die Becher - stellen Sie sicher, dass die Larven geschlüpft sind und im späten ersten oder frühen zweiten Stadium ein guter Zeitpunkt für die Umstellung auf die künstliche Nahrung.
  2. Übertragen Sie die Larven mit einem Pinsel in die künstliche Nahrung, desinfizieren Sie sie mit Bleichspray und einer Wasserspülung zwischen den Larvenbehältern. Übertragen Sie drei Larven in jeden 4-Unzen-Becher. Während die künstliche Ernährung energiereich ist und eine hohe Dichte von Larven unterstützen kann, sollten Sie es vermeiden, Larven in Becher zu packen, da sich Krankheiten und Schimmel in Bechern mit hoher Larvendichte ausbreiten können.
  3. Stellen Sie die Becher seitlich in einen Plastikbehälter, so dass Frass auf den Boden der Becher und weg von der Diät fällt, wodurch das Risiko von Schimmel und Krankheiten verringert wird.
    1. Bewahren Sie die Diätbecher unter kontrollierten Temperaturbedingungen mit niedrigen bis mäßigen Lichtverhältnissen auf. Überwachen Sie die Becher alle 1-2 Tage auf Schimmel und Krankheiten, indem Sie durch die durchsichtigen Becherdeckel schauen.
    2. Tassen mit Schimmel oder Krankheiten können unter Quarantäne gestellt oder eingefroren werden, um eine Ausbreitung auf andere Tassen zu verhindern.

4. Schlüpfen und Umgang mit Erwachsenen

  1. Lassen Sie die Larven sich verpuppen und in den Diätbechern schlüpfen. Wenn die erwachsenen Tiere schlüpfen, geben Sie ihnen ein paar Stunden Zeit, damit ihre Flügel ausgehärtet sind, bevor Sie sie zum Markieren entfernen. Entfernen Sie erwachsene Schmetterlinge mit sauberen Händen aus den Bechern, indem Sie sanft ihre Flügel greifen, und beachten Sie, dass es stabiler ist, alle vier Flügel näher an ihren Körper zu greifen.
  2. Um die Schmetterlinge zu markieren, halten Sie die Individuen am Kopf und am Brustkorb trocken und markieren Sie mit einem feinen Filzstift leicht eine Zahl auf ihrem Hinterflügel.
    1. Geschlechtsindividuen, die eine Kombination aus Flügelzeichnungen und Genitalien verwenden; Weibchen haben im Allgemeinen zwei schwarze Flecken auf dem Rückenvorderflügel und dunklere, gelbliche Hinterflügel, während Männchen im Allgemeinen einen kleineren schwarzen Fleck auf dem Rückenvorderflügel auf einem helleren weißen Hintergrund haben54.
    2. Da diese Färbung individuelle und saisonale Variationen aufweist, bestätigen Sie das Geschlecht anhand von Bauchmerkmalen - Männchen haben zwei Klammern am distalen Ende ihres Hinterleibs und einen schmaleren Hinterleib im Allgemeinen, während Weibchen eine einzige Genitalöffnung haben.
  3. Übertragen Sie die Erwachsenen in Wachspergaminumschläge, indem Sie den Umschlag mit einer Hand öffnen, den Schmetterling am Kopf und am Brustkorb festhalten, ihn in den Umschlag schieben und mit der anderen Hand die Flügel durch den Umschlag greifen.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle vier Flügel innerhalb des Umschlags normal geschlossen sind.
    2. Pflegen Sie die Schmetterlinge bis zu 1 Woche vor dem Experimentieren unter kalten Bedingungen (5-6 °C), aber lassen Sie sie mindestens 1 Tag akklimatisieren, wenn Sie sie aus dem Kühlschrank nehmen.

5. Leistungskennzahlen

  1. Um die Flügelmerkmale an toten Individuen zu messen, entfernen Sie die Flügel des Schmetterlings, indem Sie den Brustkorb in einer Hand halten und jeden Flügel mit einer Pinzette an seiner Basis entfernen. Legen Sie die Flügel flach in einen Leuchtkasten und machen Sie Fotos für spätere Messungen.
  2. Um Schätzungen der Fruchtbarkeit zu erhalten, sollten die erwachsenen Tiere in Paarungskäfigen untergebracht werden, wobei mindestens 1 Tag für die Fortpflanzungsreifung der Männchen und 1 Tag für die Paarung vorgesehen sind. Opfern Sie Weibchen zu festgelegten Zeitpunkten für die Eizählung durch Sektion oder sammeln Sie jeden Tag Eier auf Wirtspflanzen.
  3. Um die Eibelastung abzuschätzen, entfernen Sie den Hinterleib des Weibchens, legen Sie ihn in 1x PBS-Puffer und schneiden Sie einen Schlitz entlang der Bauchseite.
    1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Innereien von der Nagelhaut zu trennen, und ziehen Sie dann die Eierstöcke vom Darm, den Trachae und anderen Inhalten des Bauches weg.
    2. Entrollen Sie die vier gekräuselten Eizellen in jedem der beiden Eierstöcke und achten Sie darauf, wo reife, dotterte und geschälte Eizellen in unreife Follikel übergehen. Verwenden Sie einen Zähler, um die Gesamtzahl der reifen Eizellen zu zählen, die im Allgemeinen zwischen 0 und 200 Eiern liegen.
  4. Um den Paarungsstatus eines präparierten Weibchens zu bestimmen, öffnen Sie die Bursa copulatrix und trennen Sie die darin enthaltenen Spermatophoren. Wenn Spermatophoren verdaut werden, entwickeln sie in der Regel einen "Schwanz" und sind ineinander verschachtelt.

6. Fallstudie

HINWEIS: Ausgewachsene weibliche Kohlweißlinge wurden 2014 aus der Wildnis gesammelt, um die experimentellen Populationen zu gründen. Die erwachsenen Weibchen stammten aus der Nähe von Davis, Kalifornien (N = 8 Gründungsweibchen).

  1. Unterbringung der Schmetterlinge
    1. Bringen Sie die Weibchen in "BugDorm"-Netzkäfigen (61 cm x 61 cm x 61 cm) unter natürlichem Licht in einem Gewächshaus unter. Stellen Sie ein Bio-Blatt der Wirtspflanze Kohl (Brassica oleracea) für die Eiablage zur Verfügung.
    2. Um die Luftfeuchtigkeit in den Käfigen aufrechtzuerhalten, fügen Sie eine kleine Topfpflanze (Cosmos) hinzu, die täglich gegossen wird und in jedem Käfig auf ein Handtuch gelegt wird.
    3. Sammeln Sie täglich Eier, indem Sie Blätter mit neuen Eiern in 473-ml-Plastikbecher mit Löchern im Deckel umfüllen und in eine Klimakammer stellen.
    4. Geben Sie Schmetterlingen ad libitum Zugang zu einer 10%igen Honigwasserlösung (hergestellt durch Verdünnen von Bio-Honig mit destilliertem Wasser), die durch einen gelben Schwamm in einer kleinen Petrischale, die täglich gewechselt wird, zugänglich ist.
  2. Zubereitung künstlicher Diäten
    1. Herstellung von künstlichem Futter für Kohlweißlarven unter Verwendung von Modifikationen zuvor entwickelter Lepidoptera-Diäten4. Eine Charge Diät enthielt 50 g Weizenkeime, 27 g Kasein, 10 g Zellulose, 24 g Saccharose, 15 g Kohlmehl, 9 g Wesson-Salzmischung, 12 g Torula-Hefe, 3,6 g Cholesterin, 10,5 g Vanderzant-Vitaminmischung, 1,1 g Methylparaben, 1,5 g Sorbinsäure, 3 g Ascorbinsäure und 0,175 g Streptomycin (siehe Materialtabelle).
    2. Wiegen Sie die trockenen Zutaten für mehrere Diätchargen vor (Tabelle 1) und mischen Sie sie gründlich, um die Homogenität zwischen den Diättypen zu erhöhen, bevor Sie sie in separate Chargen zum Mischen mit Metalllösungen unterteilen.
    3. Die trockenen Zutaten mit Leinöl und der entsprechenden Metallmischung in einen Mixer geben.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurde Leinöl verwendet, da es von einem früheren Anbieter von Insektennahrung verkauft wurde. Jetzt wird ausschließlich Bio-Leinöl verwendet, das aus der gleichen Pflanze hergestellt wird, aber weniger wahrscheinlich Zusatzstoffe enthält als kommerzielle Anbieter von Leinöl.
    4. Gießen Sie die zubereitete Diät in 118 ml (4 oz) Plastikbecher. Verwenden Sie lösliche Metallsalze, um künstlichen Diäten Fokusmetalle hinzuzufügen. Streben Sie Metallkonzentrationen auf der Grundlage vorheriger Beobachtungen des Metallgehalts von Pflanzen (z. B. Nickelakkumulation 55,56,57 oder Kontamination von Pflanzen am Straßenrand 58,59,60) und der Toleranz von Metallen in anderen Schmetterlingen an 49,50,51.
    5. Lösen Sie Metallsalze in 500-1.000 ml destilliertem Wasser auf, bevor Sie die entsprechenden Mengen einnehmen, um sie zu künstlichen Diäten hinzuzufügen. Um beispielsweise die 100-ppm-Nickeldiät herzustellen, fügen Sie der künstlichen Diät vor dem Mischen 317,6 ml 1 M NiCl2-Lösung hinzu, um eine endgültige Diätkonzentration von 100 mg/g Ni-Trockengewicht (ca. 53 mg/g Nassgewicht) zu erhalten. Diese Menge entspricht einer durchschnittlichen gemessenen Konzentration von 109,6 ppm (Tabelle 2), die auf der Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma basiert.
      HINWEIS: Die Metallgehalte wurden von den Research Analytical Labs der University of Minnesota anhand von sechs Proben geschätzt.
  3. Instandhaltung
    1. Bewahren Sie die an Wirtspflanzen geernteten Eier in Klimakammern bei 23 °C bei 14:10 Photoperioden 7 Tage lang auf. Danach werden die Larven des frühen zweiten Stadiums in die künstliche Ernährung überführt.
    2. Verteilen Sie die Larven einer bestimmten Pflanze beim Transfer gleichmäßig auf die vier Futtertypen, um eine Verwechslung von Larvenchargen mit dem Ernährungstyp zu vermeiden. Übertragen Sie die Larven (N = 346 insgesamt) als zwei Individuen pro 118-ml-Diätbecher, um das Auftreten von Krankheiten durch Überfüllung zu verringern und ausreichend Platz für die Erwachsenen zu schaffen, um sich schließlich zu schließen.
    3. Stanzen Sie Löcher (drei pro Deckel) in die Deckel der Aufzuchtbecher. Stellen Sie die Becher für die Aufzucht in schuhkartongroße Plastikbehälter, wobei die verschiedenen Diäten eingestreut sind, um systematische Auswirkungen des Standorts in der Aufzuchtkammer zu vermeiden.
    4. Unterbringen Sie die Larvenbecher in Klimakammern bei 23 °C bei 14:10 Photoperioden (mit Wasserbehältern am Boden der Kammer, um die Luftfeuchtigkeit bei 50%-60% zu halten, überwacht mit einem Feuchtigkeitssensor zu Hause). Für den Fall, dass die Becher schimmeln (insgesamt etwa acht Becher in dieser Fallstudie), entfernen Sie die Becher aus der Kammer und entfernen Sie diese Personen aus dem Experiment.
    5. Lassen Sie die Larven sich verpuppen und in den Aufzuchtschalen schlüpfen (N = 162 insgesamt).
      HINWEIS: Für die Aufzuchtbedingungen in dieser Studie betrug die Entwicklungszeit von der Eiernte bis zum Schlüpfen der erwachsenen Tiere durchschnittlich etwa 25-30 Tage (zwischen 20-40 Tagen, z. B. 25, 28).
    6. Wenn sich die Puppen dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere nähern, überprüfen Sie die Becher täglich auf neu geschlossene Individuen und entfernen Sie erwachsene Tiere mit getrockneten Flügeln. Beschriften Sie die Altvögel auf ihren Hinterflügeln mit der entsprechenden individuellen Nummer (die beim Larventransfer vergeben wird) mit einem schwarzen Filzstift mit feiner Spitze. Bestimmen Sie das Geschlecht jedes Individuums und markieren Sie auf einem Pergaminumschlag die Anzahl und das Entstehungsdatum. Legen Sie die erwachsenen Schmetterlinge in Pergaminumschläge und lagern Sie sie bis zur Weiterverarbeitung bei -20° C.
      HINWEIS: Ein kleiner Teil der erwachsenen Tiere zeigt Flügeldeformitäten, die den Flug und das Überleben der erwachsenen Tiere beeinträchtigen würden (5%-8%); Diese Individuen werden für diese Experimente von Überlebensanalysen ausgeschlossen.
  4. Messung und Datenanalyse
    1. Messen Sie das Überleben als Überleben vom zweiten Stadium (als die Raupen auf Diät gesetzt wurden) bis zum adulten Schlüpfen.
      ANMERKUNG: Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf das Überleben und die Entwicklungszeit als Maß für die Leistung bei den verschiedenen Diäten.
    2. Messen Sie die Entwicklungszeit als die Anzahl der Tage zwischen der Umstellung auf die Nahrung und dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere in der Klimakammer.
    3. Führen Sie für die Datenanalyse zwei Sätze von Modellen aus, die Wechselwirkungen zwischen dem Metall und der Konzentration enthalten.
      ANMERKUNG: Da beide Wechselwirkungen signifikant waren (F 2.194 = 4,56, p = 0,01 für die Entwicklungszeit und X2 = 12,1, p = 0,002 für das Überleben), wurde die Studie mit einer separaten Analyse jedes Metalls fortgesetzt.
    4. Um das Überleben zu analysieren, führen Sie Chi-Quadrat-Tests für jedes Metall durch, um die Auswirkungen der Metalldosis (in vier Kategorien unterteilt) auf das Überleben bis zum Erwachsenenalter mit vollständig intakten Flügeln zu testen.
    5. Wenn ein signifikanter Effekt der Dosis festgestellt wird, führen Sie ein Folge-Chi-Quadrat durch, um jede Stufe mit der Kontrolldiät zu vergleichen. Um die Entwicklungszeit (vom Zeitpunkt des Transfers bis zum Schlüpfen als Erwachsener) zu analysieren, testen Sie, ob das Geschlecht Auswirkungen auf die Entwicklungszeit hat.
      ANMERKUNG: Da es in diesem Experiment keinen Einfluss des Geschlechts auf die Entwicklungszeit gab (p > 0,10), haben wir es aus der Berücksichtigung im Modell gestrichen.
    6. Führen Sie für jedes Metall eine separate ANOVA durch, um die Auswirkungen der vier Konzentrationen auf die Entwicklungszeit zu testen. Führen Sie außerdem t-Tests für jede Konzentration relativ zur Kontrolle durch, um die Mindestkonzentration zu bestimmen, bei der ein Leistungseffekt beobachtet wird.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde JMP v16 für alle Analysen verwendet. Alle Rohdaten sind auf Mendeley61 verfügbar.

Representative Results

Überblick
Künstliches Futter kann verwendet werden, um Kohlweißlinge unter Standardbedingungen zu züchten, um die Auswirkungen bestimmter Diätzutaten auf die Leistung von Schmetterlingen zu testen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Toxizität verschiedener Metalle in Wirtspflanzen, die in verschmutzten Gebieten wachsen, mittels künstlicher Diät untersucht (Abbildung 1). Die Larven wurden mit Futter aufgezogen, das steigende Konzentrationen von drei verschiedenen Metallen enthielt (Abbildung 2; spezifische methodische Details in Abschnitt 6 des Protokolls). Das Überleben und die Entwicklung von Schmetterlingen wurden stärker durch Kupfer und Zink und am wenigsten durch Nickel beeinflusst (Abbildung 3 und Abbildung 4), mit einer Sensitivität, die mit anderen Studien mit Schmetterlingen und Motten vergleichbar ist, die mit künstlicher Ernährung aufgezogen wurden (Abbildung 5).

Überleben
Die Schmetterlingslarven wurden in künstliche Futtersorten mit Kupfer, Nickel, Zink oder Kontrolle überführt, wobei jede Metallart in ihrer Konzentration auf drei Ebenen variierte (Tabelle 3). Ein repräsentatives Bild von Larven bei steigender Toxindosis ist in Abbildung 2 dargestellt. Es gab keinen Einfluss der Metallkonzentration auf das Überleben von Nickel, aber es gab einen signifikanten Effekt sowohl für Kupfer als auch für Zink (Tabelle 3 und Abbildung 3). Post-hoc-Chi-Quadrat-Vergleiche zeigten, dass Zink im Vergleich zur Kontrolldiät nur bei höchstem Zinkgehalt eine Abnahme des Überlebens zeigte (1.000 ppm, Post-hoc-Vergleich X12 = 8,41, p = 0,004; Abbildung 1). Kupfer zeigte auch nur bei den höchsten verwendeten Konzentrationen (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008) eine signifikante Verringerung des Überlebens, obwohl es bei den beiden niedrigsten Werten (50 ppm und 100 ppm; Abbildung 3).

Entwicklungszeit
Es zeigte sich ein signifikanter Einfluss der Kupfer- und Zinkkonzentration auf die Entwicklungszeit (Tabelle 4 und Abbildung 4). Mit zunehmender Kupferkonzentration kam es zu einer Verlängerung der Entwicklungszeit, wobei ab 50 ppm eine signifikante Abweichung von der Kontrolle auftrat (p = 0,027; Abbildung 3). Mit steigender Zinkkonzentration kam es zu einer Verlängerung der Entwicklungszeit, mit einer signifikanten Abweichung von der Kontrolle ab 100 ppm (p = 0,03; Abbildung 4). Es zeigte sich der Trend, dass die Erhöhung des Nickelgehalts zu längeren Entwicklungszeiten führt (p = 0,08; Tabelle 4), und Vergleiche der einzelnen Diäten mit der Kontrolle zeigten signifikante Effekte ab 100 ppm (p = 0,022; Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Beobachtete Konzentrationen von Fokusmetallen im Gewebe von Schmetterlingen und Wirtspflanzen. (Daten von62.) Kupfer-, Nickel- und Zinkgehalte werden für Pieris-Schmetterlingsgewebe (im Labor mit Pak Choi aufgezogen) und wild gesammeltem Senf (Bertorea sp.) angezeigt. Autos zeigen die Werte in Pflanzenblättern entlang stark befahrener Straßenan 53. Der Gehalt an Metallen in künstlichen Futtermitteln, die in dieser Studie verwendet wurden, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Punkte stellen Mittelwerte dar, und Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bild von Kohlweißlinglarven, die am selben Tag in künstliche Diäten mit steigender Konzentration eines Toxins überführt wurden. Dieses Bild zeigt Larven aus einer Dosis-Wirkungs-Studie (präsentiert in 28 mit getrocknetem Pflanzenmaterial für die giftige Pflanze Aristolochia). Foto von ESR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Variation des Überlebens bei Metalldiäten mit steigenden Konzentrationen. Sternchen zeigen eine signifikante Abweichung im Überleben im Vergleich zur Kontrolldiät an. Die genauen Metallkonzentrationen in den Futtermitteln sind in Tabelle 2 aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Auswirkungen der Metallkonzentration auf die Entwicklungszeit. Die Sternchen geben die niedrigste Metallkonzentration an, für die ein signifikanter Unterschied zur Kontrolle besteht (unter Verwendung eines t-Tests). Die genauen Metallkonzentrationen in den Futtermitteln sind in Tabelle 2 aufgeführt. Punkte stellen Mittelwerte dar, und Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Zusammenfassung der Metalltoleranz bei anderen Schmetterlingen. Dargestellt sind zusammengesetzte Überlebensdaten aus 11 bestehenden Studien 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Die Antwortvariable ist die Höhe (in ppm) der Metallkonzentration, bei der negative Auswirkungen auf das Überleben zuerst beobachtet werden. Schmetterlinge weisen auf die Ergebnisse dieser Studie hin und stellen fest, dass die Toleranzwerte für Nickel höher waren als die in dieser Studie gemessenen. Punkte stellen Mittelwerte dar, und Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bestandteil Wiegen als g Ml
Weizenkeim Trockene Zutaten 50
Zellulose Trockene Zutaten 10
Kohlmehl Trockene Zutaten 15
Casein Trockene Zutaten 27
Saccharose Trockene Zutaten 24
Wesson Salzmischung Trockene Zutaten 9
Torula-Hefe Trockene Zutaten 12
Cholesterin Trockene Zutaten 3.6
Vitamin-Mix Trockene Zutaten 10.5
Methyl-Paraben Trockene Zutaten 0.75
Sorbinsäure Trockene Zutaten 1.5
Ascorbinsäure Trockene Zutaten 3
Streptomycin Trockene Zutaten 0.175
Leinsamenöl Feuchte Zutaten 5
Agar Agar 15

Tabelle 1: Rezept für künstliche Ernährung. Dargestellt sind die Gewichte (und Mengen) der Inhaltsstoffe in einer Charge Kohlweißling-Schmetterlingsfutter. Die trockenen Zutaten (und das Leinsamenöl) werden getrennt von der Agar-Agar-Mischung zubereitet (in 400 ml kochendem Wasser aufgelöst und dann mit 400 ml Wasser bei Raumtemperatur auf eine kühlere Temperatur gebracht).

Art der Diät Kupfer (ppm) Nickel (ppm) Zink (ppm)
Kupfer-"100 ppm" 96.1 1.75 69.9
Nickel-"100 ppm" 7.29 109.6 68.9
Zink-"100 ppm" 7.96 1.06 186.2
Zink-"500 ppm" 6.51 1.16 708
Steuerung 5.89 0.59 59.3

Tabelle 2: Maße für Metalle in der Ernährung. Dargestellt sind die mittleren Gehalte an Kupfer, Nickel und Zink in einer Untergruppe der in der Studie verwendeten künstlichen Diäten. Der Name der Diät ("Typ" in der Analyse) wird auf der linken Seite angezeigt, wobei die Werte in Anführungszeichen die berechnete Stufe darstellen. Die Zielkonzentration wird in Anführungszeichen gesetzt. Eine Untergruppe der in der Studie verwendeten Diäten wurde analysiert, um sicherzustellen, dass die berechneten Werte mit den realisierten Werten übereinstimmten. Es sollte beachtet werden, dass es oft ein geringes Maß an Variation in der Zusammensetzung der Nahrungsbestandteile gibt und jede gemeldete Zeile nur eine Wiederholung darstellt.

Metal Pearson X32 P
Kupfer (n = 118) 17.82 0.0005
Nickel (N = 152) 3.45 0.33
Zink (N = 152) 12.52 0.006

Tabelle 3: Auswirkungen der Metallkonzentration auf das Überleben. Dargestellt sind die Ergebnisse eines Chi-Quadrat-Tests für jedes Metall, bei dem drei Metallkonzentrationen im Vergleich zu einer Kontrolldiät gegenübergestellt werden.

Metall F P
Kupfer (N = 61) F3,57 = 9,84 <0,0001
Nickel (N = 75) F3,71 = 2,35 0.079
Zink (N = 64) F3,60= 3.79 0.015

Tabelle 4: Auswirkungen der Metallkonzentration auf die Entwicklungszeit. Dargestellt sind die Ergebnisse der einzelnen ANOVAs für jedes Metall.

Datenverfügbarkeit:

Alle Daten sind auf Mendeley61 verfügbar.

Discussion

In dieser Studie wurden Kohlweißlinge (Pieris rapae) mit einer künstlichen Diät gezüchtet, um Unterschiede in der Schwermetalltoxizität zu untersuchen. Dabei liefert diese Studie allgemeine Methoden für die Aufzucht und Laboruntersuchungen dieses leicht zu manipulierenden Schmetterlingssystems. In dieser Diskussion werden zunächst allgemeinere Fragen zu den hier vorgestellten Methoden erörtert, dann unsere wissenschaftlichen Erkenntnisse besprochen und abschließend Überlegungen zu den Bestandteilen der künstlichen Ernährung angestellt.

Das hier besprochene Protokoll enthält Schritte einer allgemeinen Aufzuchtmethode für Kohlweißlinge, aber es gibt viele Punkte innerhalb dieses Protokolls, die optimiert werden können. Während beispielsweise in der hier vorgestellten Fallstudie Schwämme zum Fressen verwendet werden, hatten andere Forscher Glück mit Zahndochten und Seidenblumen, die mit Honigwasser gefüllt sind5. Während in der vorliegenden Studie Honigwasser als Lebensmittel verwendet wird, haben andere Forscher Zuckerlösungen und sogar Gatorade verwendet. Wenn Puppen gewogen oder zum Schlüpfen an andere Bedingungen gebracht werden müssen (z. B. Diapause und 1 Monat lang gekühlt lagern), kann der Forscher sie leicht aus den Bechern entfernen, indem er sie mit Wasser besprüht, um ihre Seidenaufsätze zu befeuchten, und sie mit einer Federzange greift und sie dann mit doppelseitigem Klebeband wieder aufhängt. Wenn Forscher mehr Flexibilität benötigen, wann erwachsene Schmetterlinge für erwachsenes Verhalten in Käfige gebracht werden, können sie mehrere Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden, müssen aber gefüttert werden. Alle paar Tage sollten die Schmetterlinge herausgenommen werden, um mit einer verdünnten Honigwasserlösung gefüttert zu werden. Bei Innenbeleuchtung kann dies durch die Verwendung eines Stifts erfolgen, um den Rüssel in das Essen einzurollen. Auf der Leistungsseite der Erwachsenen kann eine Vielzahl von Fitnessmaßnahmen an Kohlweißlingen durchgeführt werden. Die Körpergröße kann als nasse oder trockene Masse von Larven in bestimmten Stadien, Puppen oder Erwachsenen (geopfert oder in Pergaminhüllen gehalten) oder durch die Messung der Flügellänge im Programm ImageJ gemessen werden (siehe 12,24,25,28). Die Lebenszeitfruchtbarkeit von Weibchen kann durch tägliche Eisammlungen an Wirtspflanzen gemessen werden 25,69,70, und die Größe bestimmter Merkmale kann als Leistungsmaßstab gemessen werden; beispielsweise die Masse oder das Volumen des Gehirns oder einzelner Hirnregionen 62,71,72 oder der Masse- oder Proteingehalt des Brustkorbs oder des Flugmuskels 62,70. Schließlich können Erwachsene in Verhaltensstudien verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von Fragen zu testen, die die Auswirkungen von Ernährungsmanipulationen auf die Nahrungssuche oder die Wahl der Eiablage untersuchen27,73.

Wenn das Aufzuchtprotokoll nicht wie erwartet funktioniert, gibt es einige Aspekte, die behoben werden müssen. Zunächst kann man sich fragen, ob die Lichtverhältnisse hoch genug sind, um ein normales Verhalten von Erwachsenen hervorzurufen. Während im Labor angepasste Pieris-Linien unter fluoreszierendem Licht Eier legen, ist das einzige künstliche Licht, das für Wildtyp-Linien funktioniert, leistungsstarke Breitspektrum-Gewächshauslampen. Natürliches Licht in Gewächshäusern, Fensterbänken oder im Freien funktioniert am besten, um das Paarungs- und Eiablageverhalten hervorzurufen. Zweitens, wenn die Eier nicht schlüpfen oder wenn die Larven früh in der Entwicklung sterben, gibt es ein paar Dinge zu beachten. Das Material der Wirtspflanze muss organisch sein, wobei zu beachten ist, dass "biologische" Pflanzen aus Geschäften manchmal mit Chemikalien behandelt werden, die Larven abtöten können, so dass es oft am besten ist, eigene Wirtspflanzen aufzuziehen. Wenn die Akzeptanzrate des Wirts niedriger ist, können jüngere Blätter mit höherem Stickstoffgehalt ausprobiert werden, wobei Topfpflanzen anstelle von Einzelblättern präsentiert werden und sichergestellt wird, dass die Weibchen gepaart werden. Weibchen akzeptieren die Aussaat von Kohl, sogar kleine Sprossen, die 2 Wochen alt sind. Die Paraffinmethode eignet sich gut, um Eier unter verschiedenen Bedingungen zu überführen, aber es sollte beachtet werden, dass die Akzeptanzrate tendenziell niedriger ist als bei ganzen Pflanzen. Drittens müssen alle Bestandteile der Diät von hoher Qualität sein und dürfen nicht abgelaufen sein. Leinsamenöl sollte jährlich ausgetauscht und24,25 im Kühlschrank aufbewahrt werden. Auch Weizenkeime, die Vitaminmischung und Antibiotika sollten kühl gehalten werden. Viertens kann man in Betracht ziehen, das Diättassen-Setup zu optimieren. Für die Aufzucht kann eine beliebige Anzahl von Einweg-Plastikbechertypen verwendet werden, von 1 oz bis 15 oz. Wir haben festgestellt, dass 4 Unzen eine gute Größe sind, um das Schlüpfen von Erwachsenen zu ermöglichen, und sich gut in unsere Klimakammern packen lassen. Löcher in den Deckeln ermöglichen einen Luftstrom, aber zu viele Löcher können die Nahrung bei niedriger Luftfeuchtigkeit austrocknen, so dass diese Zahl möglicherweise angepasst werden muss. Fünftens müssen die Bedingungen in der Klimakammer möglicherweise in Kombination mit den Becherbedingungen angepasst werden. Wenn die Bedingungen zu trocken sind, können Wirtspflanzen mit Eiern austrocknen, bevor Larven übertragen werden können, und Becher mit Nahrung können austrocknen, bevor Schmetterlinge schlüpfen. Auf der anderen Seite, wenn die Bedingungen zu nass sind, können die Becher Schimmel und Krankheiten beherbergen. Forscher müssen möglicherweise den Luftstrom in den Bechern durch die Verwendung von Netzdeckeln oder mehr oder weniger Löchern in den Deckeln anpassen. Ein weiteres häufiges Problem sind Kammerleuchten, die hell genug sind, um Temperaturschwankungen in den Tassen und eine Bildung von Kondenswasser zu verursachen. Die Verwendung von Dimmleuchten ist eine einfache Option für die Larvenaufzucht.

In Bezug auf die Forschungsfragen in dieser Arbeit ergab diese Studie, dass Kohlweiß relativ empfindlicher auf Kupfer reagiert als auf Nickel oder Zink. Kupfer hatte signifikante negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit bei Konzentrationen von nur 50 ppm (Abbildung 3 und Tabelle 3) und auf das Überleben bei 500 ppm (Abbildung 4, Tabelle 4). Im Gegensatz dazu gab es keine negativen Auswirkungen von Nickel auf das Überleben (bis zu 500 ppm; Abbildung 3) oder negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit bei 100 ppm (Abbildung 4). Kohlweißlinge waren ziemlich tolerant gegenüber Zink, wobei Überlebenseffekte erst bei 1.000 ppm beobachtet wurden (Abbildung 3) und negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit ab 100 ppm (Abbildung 4). Aufgrund der relativ höheren Konzentrationen von Zink im Schmetterlingsgewebe und im Senf (ihrer Wirtspflanze; Abbildung 1) wurde erwartet, dass eine relativ größere Toleranz gegenüber Zink zu beobachten sein würde. Die Empfindlichkeit gegenüber Kupfer und die Toleranz gegenüber Nickel waren jedoch angesichts des sehr geringen Nickelgehalts im Schmetterlingsgewebe (Abbildung 1) und der Notwendigkeit von Kupfer als Mikronährstoff etwas unerwartet. Diese unerwarteten Ergebnisse werden im Folgenden erörtert, nachdem die Toleranz dieser Metalle bei anderen Schmetterlingen und Motten berücksichtigt wurde.

Um die vorliegenden Daten mit der bei anderen Schmetterlingen gemessenen Metallsensitivität zu vergleichen, wurden Daten aus bestehenden Studien zur Mindestkonzentration zusammengestellt, bei der Schwermetalle das Überleben negativ beeinflussten 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; Diese Studien konzentrierten sich auf Nachtfalter, insbesondere auf Schädlingsarten (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle in dieser Studie gemessenen Sensitivitätswerte liegen in der Nähe des Bereichs, der für diese anderen Arten gemessen wurde (Abbildung 5). Das Maß für die Nickeltoleranz in dieser Studie scheint jedoch höher zu sein als erwartet - während es bei 500 ppm keinen signifikanten Effekt auf das Überleben gab, fand die vorherige Studie an Pieris rapae auch eine sehr hohe Toleranz für Nickel (signifikante Effekte ab 1.000 ppm56), trotz niedriger Konzentrationen in ihrem Gewebe (Abbildung 1). Das Maß für die Kupfersensitivität in dieser Studie scheint auch für Studien an Lepidoptera am unteren Ende zu liegen. Während die Verwendung einer künstlichen Diät einen bequemen und kontrollierten Vergleich der relativen Metallsensitivität ermöglicht, ist es wichtig zu beachten, dass Komponenten der Diät die Messung der absoluten Metallsensitivität verändern können. Zum Beispiel könnte Vitamin C in der Nahrung metallinduzierten oxidativen Stress ausgleichen74, oder Antibiotika in der Nahrung könnten die Auswirkungen von Mikroben auf die Verarbeitung von Metallen verändern75. Ein interessanter zukünftiger Forschungszweig wäre die systematische Manipulation solcher Nahrungskomponenten, um die Auswirkungen auf die Metalltoxizität zu testen, insbesondere angesichts der Frage nach der funktionellen Rolle von Lepidoptera-Darmmikroben 76,77 und Nektarkomponenten, die antioxidative Eigenschaften haben könnten78. Darüber hinaus können unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse zwischen den Arten interspezifische Vergleiche erschweren, und künstliche Ernährungsmethoden sollten durch Manipulationen von Wirtspflanzen ergänzt werden.

Diese Schmetterlinge sind besonders tolerant gegenüber Nickel und empfindlich gegenüber Kupfer. Frühere Forschungen haben ergeben, dass viele Pflanzen aus der Familie der Senfgewächse, zu denen auch Pflanzen gehören, die von Pieridae bevorzugt werden, Nickel als Abwehrmechanismus gegen Pflanzenfresser überakkumulieren 55,56,63,79,80,81. Diese Hyperakkumulation beträgt über 1.000 ppm im Pflanzengewebe, was um Größenordnungen größer ist als bei den meisten Pflanzen (Abbildung 1). Es ist möglich, dass Pieris aufgrund der früheren Selektion durch solche Nickelakkumulatoren eine besonders hohe Toleranz für Nickel haben, wie bereits spekuliertwurde 26. Während Kupfer weniger häufig als Mikronährstoff in der Ernährung von Insekten untersucht wurde, gibt es einige Hinweise darauf, dass es eine geringe Rolle bei der Fortpflanzung und Immunität spielt, wenn auch hauptsächlich bei blutsaugenden Insekten (z. B. 82,83). Es ist möglich, dass Kupfer bei Schmetterlingen eine weniger wichtige physiologische Rolle spielt als bei anderen Tieren 84,85,86, was mit neueren Arbeiten übereinstimmt, die hervorheben, dass Kupfer als Schadstoff für Insekten ebenso besorgniserregend sein kann wie Blei, Cadmium und Quecksilber (z. B. 87,88,89). Während sich gezeigt hat, dass Pieris eine Kupferkontamination in niedrigen Konzentrationen vermeidet90, hat die Mobilität von Kupfer in Pflanzen (z. B. das Eindringen in Blätter und Blüten) es auch als besorgniserregende Metallverunreinigung gekennzeichnet91.

Während diese Ergebnisse interessante Daten über die relative Toxizität dieser Metalle für Kohlweißlinge liefern, zielt diese Arbeit auch darauf ab, als detaillierte visuelle Illustration von Methoden zur Aufzucht dieses leistungsstarken Systems von allgemeinem Nutzen zu sein. Kohlweißling ist in kontrollierten Laborexperimenten leicht zu züchten und zu manipulieren 4,5, was Studien zur Wirtssuche 6,7,8, zur Nahrungssuche 9,10,11 und zur sexuellen Selektion 12,13,14 erleichtert. Die Fähigkeit, diese Schmetterlinge mit einer künstlichen Ernährung zu züchten, ist der Schlüssel zur Schaffung gemeinsamer Gartenbedingungen für Vergleiche und zur Manipulation von Nährstoffen, Toxinen und sogar neuartigen Wirtspflanzen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese künstliche Ernährung nicht unbedingt die optimale künstliche Ernährung für diese Art ist und wahrscheinlich durch zukünftige Manipulationen verbessert werden könnte. Zum Beispiel wurde die Salzmischung in dieser Diät (und anderen Lepidoptera-Diäten) ursprünglich für Wirbeltiere entwickelt und hat einen höheren Kalziumgehalt als das, was die meisten Insekten benötigen92,93. So haben einige unserer Aufzuchtbemühungen maßgeschneiderte Salzmischungen mit niedrigerem Kalziumgehalt hergestellt (z. B. 62), und andere verwenden "Becks Salzmischung", die für viele Insektenarten besser geeignet ist94. In unseren eigenen Manipulationen fanden wir auch heraus, dass Schmetterlinge mit relativ weniger Weizenkeimen und relativ mehr Zellulose im Vergleich zu den ursprünglichen Konzentrationen besser abschnitten4. Ein Bereich, der weiterer Aufmerksamkeit bedarf, ist die Lipidquelle und -konzentration in der Ernährung. Frühere Arbeiten haben beispielsweise gezeigt, dass die Umstellung von Leinöl (das in dieser Studie verwendet wurde) auf Phospholipide die Paarungsraten und Wachstumsraten von Pieris bei künstlicher Ernährung erhöhte95. Die Supplementierung bestimmter Fettsäuren in der künstlichen Ernährung kann zusätzliche positive Auswirkungen haben96,97. Die Optimierung der künstlichen Ernährung von Pieris98,99 schafft Möglichkeiten, interessante Fragen zur Ernährungsökologie 100,101,102, zur Evolutionsökologie und zur Ökotoxikologie zu beantworten. Diese Ansätze der künstlichen Ernährung ermöglichen es den Forschern, Fragen zur Rolle bestimmter Lipide in der kognitiven Evolution 103, zur Voranpassung an Toxine28, zu Nahrungskomponenten, die die Toxizität von Schadstoffen reduzieren104, oder zu stöchiometrischen Wechselwirkungen zwischen Nährstoffen105 zu beantworten.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für die Unterstützung durch studentische Hilfskräfte während der Aufzucht für diese Arbeit, insbesondere Regina Kurandina und Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski half bei der Zusammenstellung von Literatur über die Toxizität von Metallen bei anderen Schmetterlingen. Diese Arbeit wurde durch ein Sommerforschungsstipendium des Department of Ecology, Evolution, and Behavior der University of Minnesota ermöglicht.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon - Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon - Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon - Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon - Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Heft 198
Aufzucht des Kohlweißlings (<em>Pieris rapae</em>) unter kontrollierten Bedingungen: Eine Fallstudie mit Schwermetalltoleranz
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Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E.… More

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E. Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. J. Vis. Exp. (198), e65383, doi:10.3791/65383 (2023).

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