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घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस चूहों में सूजन और उपास्थि हानि को कम करने के लिए ट्यूना हेरफेर

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65451
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम प्लास्टर-स्थिर-प्रेरित घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस चूहों पर किए गए ट्यूना हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रारंभिक परिणामों के आधार पर, यह सुझाव दिया गया कि विधि की प्रभावकारिता सूजन और उपास्थि के नुकसान में कमी पर निर्भर करती है।

Abstract

नैदानिक परीक्षणों से पता चलता है कि घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) के इलाज में ट्यूना हेरफेर प्रभावी है, जबकि इसके तंत्र की खोज के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इसलिए, घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के पशु मॉडल का हेरफेर महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल केओए चूहों पर ट्यूना हेरफेर के लिए एक मानक प्रक्रिया प्रदान करता है और केओए के लिए तुइना के तंत्र की प्रारंभिक खोज करता है। प्रेस और गूंधने की हेरफेर विधि (एक प्रकार का ट्यूना हेरफेर जो शरीर की सतह के विशिष्ट क्षेत्र को दबाने और गूंधने को संदर्भित करता है) चूहों के घुटने के जोड़ के आसपास 5 एक्यूपॉइंट पर लागू किया जाता है। हेरफेर के बल और आवृत्ति को उंगली के दबाव रिकॉर्डिंग द्वारा मानकीकृत किया गया था, और हेरफेर के दौरान चूहे की स्थिति प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है। हेरफेर के प्रभाव को श्लेष और उपास्थि में दर्द व्यवहार परीक्षणों और सूक्ष्म निष्कर्षों द्वारा मापा जा सकता है। केओए चूहों ने दर्द व्यवहार में महत्वपूर्ण सुधार दिखाया। ट्यूना समूह में श्लेष ऊतक भड़काऊ घुसपैठ कम हो गई थी, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) -α की अभिव्यक्ति काफी कम थी। नियंत्रण समूह की तुलना में, चोंड्रोसाइट्स एपोप्टोसिस ट्यूना समूह में कम था। यह अध्ययन केओए चूहों पर ट्यूना हेरफेर के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है और प्रारंभिक प्रमाण है कि ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव श्लेष सूजन को कम करने और चोंड्रोसाइट्स एपोप्टोसिस में देरी से संबंधित हो सकते हैं।

Introduction

घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) एक अपक्षयी बीमारी है जो मुख्य रूप से जोड़ों के दर्द में प्रकट होती है। फाइब्रोसिस, क्रैकिंग, अल्सरेशन और आर्टिकुलर कार्टिलेज का नुकसानइस बीमारी के मुख्य कारण हैं। केओए का उच्च प्रसार है और इसके परिणामस्वरूप रोगियों के दैनिक जीवन पर गहरा प्रभाव पड़ सकता है, जिससे गंभीर मामलों में विकलांगता हो सकती है। 45-84 वर्ष की आयु के लोगों में, केओए का प्रसार उम्र के साथ बढ़ता है, और 85 वर्ष और उससे अधिक आयु के लोगों में प्रसार 15% है, जिसमें महिलाओं में प्रबलता 2,3 है। इसके अलावा, केओए व्यक्ति और समाज दोनों पर एक गंभीर आर्थिक बोझ ला सकता है। एक सर्वेक्षण से पता चला है कि प्रति व्यक्ति केओए पर प्रत्यक्ष स्वास्थ्य देखभाल लागत $ 8,858 ± $ 5,120प्रति वर्ष तक पहुंच गई। समाज की उम्र बढ़ने के साथ, केओए एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य समस्या और एक प्रमुख सामाजिक मुद्दा बन गया है, साथ ही वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक सामयिक मुद्दा भी है।

साक्ष्य-आधारित अध्ययनों ने केओए5 के इलाज में ट्यूना हेरफेर की प्रभावशीलता को दिखाया है। ट्यूना हेरफेर दर्द से राहत दे सकता है और केओए रोगियों में शिथिलता में सुधार कर सकता है, जिसका तंत्र विरोधी भड़काऊ प्रभाव 6,7 से संबंधित है। विद्वानों ने पाया कि ट्यूना हेरफेर ने भड़काऊ कारकों इंटरल्यूकिन (आईएल) -β और 5-हाइड्रॉक्सीट्रिप्टामाइन की अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से रोक दिया और खरगोश केओए मॉडल8 में आर्टिकुलर कार्टिलेज के अध: पतन को धीमा कर दिया। यह सुझाव दिया गया कि टुइना घाव स्थल पर रक्त परिसंचरण और चयापचय को बढ़ावा दे सकता है, जिसने आईएल -1, आईएल -6 और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) -α जैसे भड़काऊ कारकों को साफ करने में मदद की, जिससे केओए9 के नैदानिक लक्षणों को कम किया जा सके। इसके अलावा, ट्यूना हेरफेर के माध्यम से जोड़ का निष्क्रिय आंदोलन आर्टिकुलर उपास्थि में श्लेष द्रव के प्रवेश और प्रसार को बढ़ावा दे सकता है और ऊतक पोषक तत्व चयापचय में सुधार कर सकताहै। अन्य अध्ययनों ने सुझाव दिया कि टुइना हेरफेर केओएरोगियों में बायोमेकेनिकल इंडेक्स में प्रभावी ढंग से सुधार कर सकता है। नरम ऊतकों पर लागू जोड़तोड़ अंगों पर तनाव वितरण में सुधार कर सकते हैं और संतुलन समारोह12,13 को बढ़ा सकते हैं। इसी समय, कुछ संयुक्त समायोजन जोड़तोड़ के साथ, निचले अंगों के संरेखण को असामान्य चाल14,15 को ठीक करने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है।

केओए के इलाज में ट्यूना हेरफेर की कार्रवाई के तंत्र का पता लगाया जाना बाकी है, और इसलिए, एक प्रयोगात्मक अध्ययन आवश्यक है। प्रयोगात्मक जानवरों में तुइना के आवेदन की कुंजी मॉडलिंग, पशु निर्धारण औरहस्तक्षेप विधियों का मानकीकरण है। मॉडलिंग विधि निर्धारित करती है कि प्रयोगात्मक जानवर रोग की विशेषताओं को प्रदर्शित कर सकता है या नहीं। इस बीच, उचित निर्धारण विधियां तुइना हेरफेर के हस्तक्षेप की सुविधा प्रदान कर सकती हैं और ट्यूना के प्रभाव को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित कर सकती हैं। हस्तक्षेप विधियों का मानकीकरण तुइना हेरफेर का सबसे कठिन हिस्सा है। 2010 में, चीनी एक्यूपंक्चर मानकों की मूल प्रणाली ने प्रयोगात्मक जानवरों के लिए एक्यूपंक्चर बिंदु मानकों का उल्लेख किया, जोपशु प्रयोगों में एक्यूपंक्चर और ट्यूना संचालन की संभावना प्रदान करता है। हालांकि, ट्यूना हेरफेर को मानकीकृत करने में अभी भी कठिनाइयां हैं। ट्यूना हेरफेर18 के कई प्रकार हैं। विशिष्ट हेरफेर की पसंद मुख्य रूप से इलाज की जाने वाली बीमारी और चिकित्सीय सिद्धांतों पर निर्भर करती है जो कलाकार पसंद करते हैं। केओए के लिए तुइना के अध्ययन में, पॉइंट-प्रेसिंग मैनिपुलेशन (अंगूठे या कोहनी के साथ विशिष्ट एक्यूपॉइंट को दबाना), यिझिचन पुशिंग मैनिपुलेशन (अंगूठे को घुमाकर एक धक्का हेरफेर), और दबाने और गूंधने वाले हेरफेर (जो उंगली या हथेली से शरीर की सतह के विशिष्ट क्षेत्र को दबाने और गूंधने को संदर्भित करता है) पर अधिक ध्यान दिया गया है।. प्रेस और गूंधने में हेरफेर सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले ट्यूना जोड़तोड़ में से एक है, जो चमड़े के नीचे के ऊतक20 को स्थानांतरित करने के लिए दबाने और गूंधने को जोड़ती है। एक्यूपॉइंट्स पर लागू प्रेस और गूंधने में हेरफेर रक्त परिसंचरण को बढ़ावा दे सकता है और दर्द से राहत दे सकता है और केओए19 पर ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव का प्रतिनिधित्व करता है।

इस प्रोटोकॉल में, केओए चूहों पर प्रेस और गूंधने के हेरफेर के संचालन का विस्तार से वर्णन किया जाएगा, जिसमें चयनित एक्यूपॉइंट, हेरफेर की तीव्रता और आवृत्ति और चूहे की शरीर की स्थिति शामिल है, ताकि भविष्य के शोध के लिए एक संदर्भ प्रदान किया जा सके।

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Protocol

इस अध्ययन ने शंघाई यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (वाईवाईएलएसी-2022-166) से संबद्ध एकीकृत पारंपरिक चीनी और पश्चिमी चिकित्सा के यूयांग अस्पताल की प्रयोगात्मक पशु नैतिकता समिति द्वारा आयोजित पशु नैतिकता समीक्षा को पारित किया है।

1. प्रायोगिक पशु तैयारी और समूहीकरण

  1. पशु तैयारी
    1. कमरे के तापमान (18-21 डिग्री सेल्सियस), आर्द्रता 40% -50%, 12 घंटे: 12 घंटे सर्कैडियन लय परिवर्तन पर 200-220 ग्राम के कुल 10 स्वस्थ एसपीएफ एसडी मादा चूहों को पालना। पशु नैतिक दिशानिर्देशों और दिशानिर्देशों के प्रासंगिक प्रावधानों के सख्त अनुपालन में दर्द से संबंधित पशु प्रयोगों का संचालन करें।
  2. जानवरों का समूहीकरण
    1. बेतरतीब ढंग से चूहों को टुइना समूह और नियंत्रण समूह में विभाजित करें। मॉडलिंग के बाद 21 दिनों के लिए ट्यूना समूह के चूहों को प्रेस और गूंधने के हेरफेर के साथ इलाज करें। नियंत्रण समूह के चूहों को एक ही ट्यूना कमरे में रखें और उन्हें एक साथ काले कपड़े के बैग में रखें, जबकि टुइना समूह का इलाज चल रहा है।

2. जानवरों का मॉडलिंग

  1. जानवर को एनेस्थेटकरना
    1. गैस एनेस्थीसिया के लिए आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें। चूहे को 3% की प्रेरण एकाग्रता के साथ प्रेरण बॉक्स में रखें। चूहे को नीचे रखने के बाद बॉक्स को हिलाएं और एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें जब चूहा रोलओवर प्रवण स्थिति में लौटने का कोई प्रयास नहीं करता है।
    2. चूहे को इंडक्शन बॉक्स से निकालें और एनेस्थेटिक मास्क में उसकी नाक ठीक करें। संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 2% तक समायोजित करें। एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें जब चूहा अपने पंजे को चुटकी लेते समय प्रतिक्रिया नहीं देता है। जब चूहों को एनेस्थेटाइज किया जाता है तो सूखापन को रोकने के लिए चूहों पर आंखों का मरहम लगाएं, क्योंकि पलकें बंद नहीं की जा सकती हैं।
  2. मॉडलिंग विधि21
    1. दाहिने पिछले अंग के बालों को हटाने के लिए शेविंग मशीन का उपयोग करें। चूहे के दाहिने टखने और कूल्हे के जोड़ के बीच एक मेडिकल कॉटन पैड रखें। गीले प्लास्टर की 5-6 परतों के साथ दाएं घुटने के जोड़ को 180 डिग्री विस्तार पर ठीक करें। सर्पिल टखने से शुरू होने वाली प्लास्टर पट्टी लपेटें और पिछले एक के 1/3 हिस्से को कवर करें। प्लास्टर को सुखाने और सख्त करने के लिए हेयर ड्रायर का इस्तेमाल करें।
    2. प्लास्टर पट्टी सूखने के बाद बाहरी रूप से डेन्चर बेस सामग्री के साथ प्लास्टर लपेटें और प्लास्टर को ठीक करने और इसे कुतरने से रोकने के लिए सख्त हो जाएं।
    3. नकली दांत को चिपचिपा बनाने के लिए इसे मिलाएं और मिश्रण को प्लास्टर के बाहर रखें (मिश्रण पट्टी के किनारे से अधिक नहीं होना चाहिए, चित्रा 1)। मिश्रण कठोर हो जाने के बाद, संज्ञाहरण मशीन को बंद कर दें और जानवर के स्वाभाविक रूप से जागने की प्रतीक्षा करें। चूहों के जागने से पहले संज्ञाहरण दुर्घटनाओं को रोकने के लिए चूहों की निगरानी करें।
    4. चूहे के दाहिने पिछले अंग पर प्लास्टर को उचित रूप से ठीक करें, क्योंकि एक तंग निर्धारण रक्त परिसंचरण को प्रतिबंधित करता है, जबकि एक ढीला निर्धारण गिर जाता है। टर्मिनल अंग में रक्त परिसंचरण का निरीक्षण करें। यदि टर्मिनल सिरा की सूजन या बैंगनी रंग का पता चलता है, तो परिसंचरण को बहाल करने में मदद करने के लिए प्लास्टर के हिस्से को तुरंत काट दें। प्लास्टर का रीमेक करें यदि यह टूट गया है और निचले अंग के विस्तार को बनाए रखने में विफल रहता है।
    5. लगातार स्थिरीकरण के 3 सप्ताह के बाद प्लास्टर को हटा दें। नकली दांत के आधार सामग्री को बाहर और प्लास्टर पट्टी को काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। चूहे के निचले अंग को नमकीन से कुल्ला करें और इसे धुंध से सुखाएं। यदि स्थानीय त्वचा के घाव हैं, तो आयोडोफोर के साथ निष्फल करें।
  3. मॉडल सत्यापन22
    1. एक्स-रे-आधारित सत्यापन
      1. मॉडलिंग के अंत के 1 दिन बाद दाहिने घुटने की एक्स-रे परीक्षा करें। 30 डिग्री पर हिप फ्लेक्सन, 0 डिग्री पर घुटने के विस्तार और 15 डिग्री पर हिप अपहरण के साथ लापरवाह स्थिति में एंटेरोपोस्टीरियर रेडियोग्राफ लें। पेटेला को सीधे घुटने के सामने रखें और रेडिएटर ट्यूब को घुटने के जोड़ से 110 मिमी डालें।
      2. दाएं पार्श्व डिक्यूबिटस स्थिति में पार्श्व रेडियोग्राफ लें, जिसमें दाएं कूल्हे का लचीलापन 30 डिग्री और दाएं घुटने का विस्तार 0 डिग्री पर हो। बाएं अंग हिप फ्लेक्सन को 70 डिग्री पर और घुटने को 45 डिग्री पर फ्लेक्सन करें, और रेडिएटर ट्यूब को घुटने के जोड़ से 110 मिमी दूर रखें। डिटेक्शन पैरामीटर को एक्सपोज़र वोल्टेज 50 केवी, वर्तमान 250 एमए, एक्सपोज़र खुराक 32 एमए और एक्सपोज़र समय 128 एमएस के रूप में सेट करें।
      3. सामान्य चूहों के एक्स-रे के साथ तुलना करें, जांचें कि मॉडलिंग घुटने का एक्स-रे किनारे पर ओस्टियोफाइट हाइपरप्लासिया के साथ संकरा संयुक्त स्थान दिखाता है।
    2. ओस्टियोआर्थराइटिस रिसर्च सोसाइटी इंटरनेशनल (ओएआरएसआई)स्कोरिंग 23
      1. चूहे को इच्छामृत्यु बॉक्स में रखें और प्रति मिनट 30% -70% पिंजरे की मात्रा की दर से सीओ2 का छिड़काव करें। यह पता लगाने के बाद कि चूहा गतिहीन है, सांस नहीं ले रहा है, और पुतली फैली हुई है, सीओ2 का उपयोग करना बंद कर दें। मृत्यु की पुष्टि करने के लिए एक और 2 मिनट के लिए देखें।
        नोट: मृत्यु की पुष्टि करने के लिए द्वितीयक रूप के रूप में सीओ2-आधारित इच्छामृत्यु के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था की जा सकती है। चूहे को मेज पर रखें और एक हाथ से उसकी पूंछ को पकड़ें। दूसरे हाथ के अंगूठे और तर्जनी से चूहे के सिर पर दबाएं। दरार की आवाज सुनते समय मृत्यु की पुष्टि करें, और चूहा एक ही समय में आंदोलन और दिल की धड़कन खो देता है।
      2. चूहे को एक फोम बोर्ड पर सिरिंज सुई के साथ लापरवाह स्थिति में ठीक करें, जिसमें दाहिने पिछले अंग को अपहरण और बाहरी रोटेशन में लचीला किया गया हो। सर्जिकल कैंची के साथ घुटने के जोड़ के आसपास की त्वचा को पिंच करें। त्वचा को काटकर और फिर चमड़े के नीचे की प्रावरणी को काटकर घुटने के जोड़ के आसपास की मांसपेशियों को उजागर करें।
      3. हड्डी की कैंची से फीमर और टिबिया डायफिसिस को काट दें और दाहिने घुटने के जोड़ को हटा दें। जोड़ के बाहर अतिरिक्त नरम ऊतकों, जैसे मांसपेशियों और स्नायुबंधन को धीरे से हटा दें।
      4. जोड़ को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 24-48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। 3 दिनों के लिए 10% फॉर्मिक एसिड समाधान में जोड़ को डिकैल्सिफाई करें जब तक कि हड्डी के ऊतकों को आसानी से सुई से बाहर नहीं निकाला जा सके।
      5. फ्यूम हुड में डिकैल्सीफाइड ऊतक को रखें और ट्रिम करें और इसे निर्जलीकरण मशीन में निर्जलीकरण बॉक्स में स्थानांतरित करें। 4 घंटे के लिए 75% इथेनॉल, फिर 2 घंटे के लिए 90% इथेनॉल, इसके बाद 1 घंटे के लिए 95% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल, 30 मिनट के लिए ताजा पूर्ण इथेनॉल का एक और दौर, 5-10 मिनट के लिए अल्कोहल बेंजीन, 5-10 मिनट के लिए जाइलीन, 5-10 मिनट के लिए ताजा जाइलीन का एक और दौर, 1 घंटे के लिए मोम, 1 घंटे के लिए ताजा मोम का एक और दौर, और निर्जलीकरण और पारदर्शी मोम विसर्जन के लिए 1 घंटे के लिए ताजा मोम का अंतिम दौर।
      6. फिर, एम्बेडिंग के लिए मशीन में ऊतक रखें। पैराफिन सेट होने के बाद मोम ब्लॉक को 4 μm के मोम स्लाइस में काटें और गर्म पानी में स्लाइस को समतल करें। स्लाइस को ग्लास स्लाइड पर रखें और सुखाएं। इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      7. उपास्थि के नमूने का निरीक्षण करें और इसे ओए कार्टिलेज हिस्टोपैथोलॉजी ग्रेड मूल्यांकन (तालिका 1)23) के अनुसार स्कोर करें। यदि मॉडलिंग के बाद चूहों का स्कोर सामान्य चूहों की तुलना में काफी अधिक है, तो मॉडलिंग सफल रही।

तालिका 1. ओए कार्टिलेज हिस्टोपैथोलॉजी ग्रेड मूल्यांकन। ग्रेड उपास्थि में गहराई की प्रगति है। कुल स्कोर = ग्रेड एक्स स्टेजिंग। सामान्य जोड़ों के लिए 0, गंभीर गठिया के लिए 24। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 1
चित्र 1. प्लास्टर में चूहे स्थिर हो गए। चूहों को एनेस्थेटाइज करने के बाद, उनके दाहिने निचले अंगों को प्लास्टर पट्टियों से लपेटा गया, हाइपरएक्सटेंडेड स्थिति में तय किया गया, और बाहर नकली दांत आधार सामग्री की एक परत के साथ कवर किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. तुइना हेरफेर

  1. आवेदन क्षेत्र
    1. चूहों के दाहिने पिछले अंग पर कुल 5 एक्यूपॉइंट का चयन करें, जिसमें एसटी 34, एसटी 35, एसपी 10, एक्स-एलई 4 और बीएल 40 शामिल हैं (चित्रा 2)। 24 में एक्यूपॉइंट पोजिशनिंग के सिद्धांतों के अनुसार एक्यूपॉइंट का पता लगाएं।
  2. आवेदन के लिए स्थिति
    1. एक काले कपड़े को 9 सेमी x 15 सेमी बैग में एक तरफ खोलने के साथ काटें और रस्सी से खोलने को कस लें। टुइना हेरफेर से पहले, धीरे से चूहे की पूंछ को खींचें ताकि इसे बैग में रखा जा सके और बैग के बाहर उसके पिछले अंगों को उजागर किया जा सके।
    2. चूहे को प्रवण स्थिति में रखने के लिए एक हाथ का उपयोग करें, उसकी पूंछ और पिछले पैर को पकड़ें, जबकि दूसरा हाथ एक विशिष्ट एक्यूपॉइंट पर दबाने और गूंधने के हेरफेर को लागू करता है (चित्रा 3)।
  3. Tuina हेरफेर
    1. प्रत्येक 2 मिनट के लिए दाएं पिछले अंग पर 5 एक्यूपॉइंट पर प्रेस और गूंधने का काम करें। लयबद्ध प्रेस और गूंधने के लिए चयनित एक्यूपंक्चर बिंदु पर कलाकारों के अंगूठे को रखें, त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों को एक गोलाकार गति में एक साथ चलाएं।
    2. हेरफेर की लगातार तीव्रता और आवृत्ति सुनिश्चित करने के लिए उंगली के दबाव रिकॉर्डिंग (न्यूटन में इकाइयों) का उपयोग करें। तीव्रता को 3-5 एन और आवृत्ति को 2 हर्ट्ज (चित्रा 4) के बीच रखें। 21 दिनों के लिए दिन में एक बार हेरफेर लागू करें।

Figure 2
चित्र 2. एक्यूपॉइंट की स्थिति। एसपी 10 चूहों में आंतरिक घुटने के जोड़ से 5 मिमी ऊपर स्थित है। एसटी 34 चूहों में बाहरी घुटने के जोड़ से 5 मिमी ऊपर स्थित है। एक्स-एलई 4 चूहों में घुटने के स्नायुबंधन के मध्यवर्ती पक्ष में स्थित है। एसटी 35 चूहों में घुटने के लिगामेंट के पार्श्व पक्ष में स्थित है। बीएल 40 अनुप्रस्थ पॉपलाइटल पट्टी के मध्य बिंदु पर स्थित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. चूहों पर टुइना हेरफेर लागू किया गया। चूहों को एक काले बैग में रखा गया था, जिसमें उनके पिछले अंग उजागर थे। कलाकार ने बाएं हाथ से चूहे की पूंछ को पकड़ लिया, जबकि दाएं हाथ ने हेरफेर किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. उंगली के दबाव रिकॉर्डिंग। एक उपकरण जो उंगली के दबाव के बल और आवृत्ति को रिकॉर्ड करता है, का उपयोग ट्यूना हेरफेर की प्रक्रिया में तीव्रता और आवृत्ति पर वास्तविक समय की प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है। (ए) दबाव सेंसर और ट्रांसमिशन उपकरण। (बी) उंगली दबाव रिकॉर्डिंग। (ग) तुइना हेरफेर के दौरान दर्ज बल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. दर्द व्यवहार परीक्षण

  1. मॉडलिंग से पहले और बाद में दर्द व्यवहार का परीक्षण करें, और 1 दिन बाद (डी 1), 7 दिन बाद (डी 7), 14 दिन बाद (डी 14) और 21 दिन बाद (डी 21) ट्यूना मैनिपुलेशन, जिसमें यांत्रिक वापसी सीमा और पंजा वापसी विलंबता परीक्षण शामिल हैं।
  2. मैकेनिकल निकासी सीमा (MWT)
    1. चूहों को 40 सेमी ऊंचे मंच पर स्थित 20 सेमी x 10 सेमी x 20 सेमी पारदर्शी टेम्पर्ड ग्लास क्यूबिकल में रखें जो 10 मिमी x 10 मिमी अपर्चर के आकार के साथ एक तार जाली से बना है। कमरे का तापमान 23 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस रखें।
    2. औपचारिक परीक्षण की शुरुआत में पर्यावरण के अनुकूलन की कमी के कारण परीक्षण परिणामों के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए व्यवहार परीक्षण चरण के दौरान प्रति दिन कम से कम 2 घंटे के लिए व्यवहार प्रयोगशाला में चूहों को व्यवस्थित करें। औपचारिक परीक्षण की शुरुआत से पहले चूहों को व्यवहार प्रयोगशाला में 30 मिनट के लिए रखें ताकि पर्यावरण के लिए उनके अनुकूलन को सुविधाजनक बनाया जा सके और विचलित कारकों को कम किया जा सके।
    3. एमडब्ल्यूटी को मापने के लिए इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे फाइबर का उपयोग करें। अपने पैर के केंद्र में फाइबर के साथ चूहे को उत्तेजित करें और फाइबर को वापस ले लें जब चूहा स्पष्ट आंदोलनों को दिखाता है जैसे कि पैर उठाना और टालना। मशीन स्वचालित रूप से इस समय अधिकतम दबाव मान (एन) रिकॉर्ड कर सकती है।
    4. वर्तमान उत्तेजना के कम से कम 15 सेकंड बाद उसी चूहे में अगली उत्तेजना शुरू करें। चूहों के पंजे में स्पर्श उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशीलता को रोकने के लिए प्रत्येक उत्तेजना के दौरान 5 सेकंड से अधिक न करें। परीक्षण को 5x दोहराएं जब तक कि तीन लगातार मापों के बीच का अंतर महत्वहीन न हो (10 N के भीतर)।
    5. बड़े अंतर (अधिकतम और न्यूनतम मान) वाले मानों को हटाएँ और शेष तीन मानों के औसत को यांत्रिक वापसी सीमा के रूप में लें।
  3. पंजा निकासी विलंबता (पीडब्ल्यूएल)
    1. चूहों को पारदर्शी टेम्पर्ड ग्लास के एक छोटे डिब्बे में 20 सेमी x 10 सेमी x 20 सेमी के आकार के साथ रखें। वेंटिलेशन छेद के साथ एक पारदर्शी ग्लास कवर के साथ डिब्बे के शीर्ष को कवर करें। पारदर्शी ग्लास प्लेट का तापमान 28-30 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जिस पर डिब्बे को रखा गया है।
    2. प्रत्येक औपचारिक परीक्षण की शुरुआत से पहले अनुकूलन करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए चूहों को इस वातावरण में व्यवस्थित करें। यदि चूहे डिब्बे में पेशाब करते हैं या शौच करते हैं, तो बाद में प्रकाश विकिरण गर्मी हस्तांतरण को प्रभावित करने से बचने के लिए इसे समय पर शोषक कागज से साफ करें।
    3. चूहे के पैर के केंद्र पर स्पॉटलाइट पर ध्यान केंद्रित करें और स्टार्ट बटन दबाएं। स्टॉप बटन दबाएं जब चूहा स्पष्ट व्यवहार दिखाता है जैसे कि पैर वापसी या पंजा चाटना और इस बिंदु पर समय रिकॉर्ड करें। चूहे की त्वचा को नुकसान से बचने के लिए स्पॉटलाइट विकिरण समय 20 सेकंड से अधिक नहीं होना चाहिए।
    4. संवेदीकरण को रोकने के लिए कम से कम 10 मिनट के बाद उसी चूहे पर अगला विकिरण करें। प्रत्येक चूहे पर 5x मापें।
    5. बड़े अंतर (अधिकतम और न्यूनतम मान) वाले मानों को हटा दें। पीडब्ल्यूएल के रूप में शेष मूल्यों का औसत लें।

5. नमूना तैयार करना

  1. 2.3.2.1 में वर्णित माउस पर इच्छामृत्यु करें।
  2. श्लेष झिल्ली की तैयारी
    1. अपहरण और बाहरी रोटेशन में दाहिने पिछले अंग के साथ फोम बोर्ड पर एक सिरिंज सुई के साथ चूहे को लापरवाह स्थिति में ठीक करें। सर्जिकल कैंची से घुटने के जोड़ के आसपास की त्वचा को पिंच करें और त्वचा को काटकर और फिर चमड़े के नीचे की प्रावरणी को काटकर चूहों के घुटने के जोड़ के आसपास की मांसपेशियों को उजागर करें।
    2. पेटेलर लिगामेंट को पेटेलर लिगामेंट के ऊपर मांसपेशी समूहों को पट्टी करने के लिए एक मील के पत्थर के रूप में लें। पेटेलर लिगामेंट (टिबियल ट्यूबरोसिटी पर) के अंत को सावधानी से दबाएं और जब लिगामेंट को नीचे से ऊपर की ओर पिन किया जाता है तो श्लेष झिल्ली का पता लगाएं।
    3. श्लेष ऊतक को नेत्र कैंची से सावधानीपूर्वक काट लें और रक्त और श्लेष द्रव को प्री-कूल्ड सेलाइन से धो लें। श्लेष झिल्ली को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में साफ धुंध के साथ ऊतक की सतह से पानी को अवशोषित करने के बाद कम से कम 48 घंटे के लिए ठीक करें।
    4. चरण 2.3.2.5- 2.3.2.6 के रूप में नमूना तैयार करें। चरण 2.3.2.7 में स्कोरिंग निष्पादित करें।
  3. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन धुंधला प्रदर्शन करना
    1. 20 मिनट के लिए जाइलीन के साथ पानी में डीवैक्स, 20 मिनट के लिए ताजा जाइलीन के एक और दौर के साथ बदलें, इसके बाद 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल के साथ इलाज करें, 5 मिनट के लिए ताजा निर्जल इथेनॉल के एक और दौर के साथ बदलें, फिर 5 मिनट के लिए मात्रा के अनुसार 90% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए मात्रा के अनुसार 80% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए मात्रा के अनुसार 70% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए मात्रा के अनुसार 70% इथेनॉल, और अंत में 5 मिनट के लिए आसुत पानी।
    2. स्लाइड को हेमटोक्सीलिन धुंधला घोल में 3-8 मिनट के लिए डुबोएं। स्लाइड को हटा दें और आसुत पानी से दाग को धो लें। इसे लगभग 30 सेकंड के लिए भेदभाव द्रव (1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल) में ले जाएं, ताकि स्लाइड हल्के नीले रंग में फीकी पड़ जाए। इसे आसुत पानी से धो लें, और 1-3 मिनट के लिए ईओसिन धुंधला घोल में रखें।
    3. 5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल वॉल्यूम अंश के साथ स्लाइड को निर्जलित करें, 5 मिनट के लिए ताजा 95% इथेनॉल के एक और दौर के साथ बदलें, इसके बाद 5 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल लें, 5 मिनट के लिए ताजा निर्जल इथेनॉल के एक और दौर के साथ बदलें।
    4. 5 मिनट के लिए जाइलीन जोड़कर स्लाइड को पारदर्शी बनाएं, इसे 5 मिनट के लिए ताजा जाइलीन के एक और दौर के साथ बदलें, और फिर इसे तटस्थ राल के साथ सील करें।
  4. कार्टिलेज पर टर्मिनल-डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफेरेज़-मध्यस्थता निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल)
    1. निर्जल इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 85% इथेनॉल और 75% इथेनॉल में उपास्थि के नमूने को निर्जलित करें जब तक कि डीवैक्सिंग हाइड्रेशन पूरा न हो जाए। 5 मिनट के लिए पीबीएस में भिगोदें। 10 मिनट के लिए 3% H 2 O2ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    2. प्रोटीन के वर्किंग घोल को ड्रॉपवाइज जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं। इसे नम रखने के लिए प्रति टुकड़ा 20 μL लेबलिंग बफर जोड़ें और काम करने वाले समाधान तैयार करने के बाद अतिरिक्त तरल को हिलाएं। प्रत्येक स्लाइड में 20 μL कार्यशील घोल जोड़ें और गीले बॉक्स में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. बंद समाधान के 50 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए बंद करें। फिर पतला बायोटिनीलेटेड एंटी-डिगॉक्सिन एंटीबॉडी (1: 100 तनुकरण) के 50 μL जोड़ें और एक गीले बॉक्स में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एसएबीसी एंटीबॉडी डाइल्यूनेट (1:100 कमजोर पड़ने) के 10 μL जोड़ें और गीले बॉक्स में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 10-15 मिनट के लिए डीएबी रंग विकास समाधान (1000 μL आसुत जल में अभिकर्मकों A, B और C के प्रत्येक 50 μL) जोड़ें। रंग का विकास तब पूरा होता है जब यह भूरा-पीला दानेदार होता है।
    5. 3 सेकंड के लिए हेमटोक्सीलिन के साथ फिर से दाग दें। ग्रेडिएंट निर्जलीकरण और पारदर्शी उपचार के बाद, कमरे के तापमान पर सुखाएं और स्लाइड को तटस्थ गम के साथ सावधानी से सील करें। बुलबुले और अतिप्रवाह गोंद छोड़ने से बचने के लिए ध्यान दें।
  5. आईएल -1 और टीएनएफ -α के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण
    1. स्लाइड्स को नियमित रूप से जाइलीन में डीवैक्स करें और उन्हें ग्रेडिएंट अल्कोहल में हाइड्रेट करें। 3% एच 2 ओ2के साथ वर्गों में अंतर्जात पेरोक्सीडेज को निष्क्रिय करें। स्लाइड धारक को 95 डिग्री सेल्सियस साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) में रखें और 20 मिनट से अधिक के लिए 95 डिग्री सेल्सियस से ऊपर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बॉक्स को बाहर निकालें और इसे कम से कम 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 5% सामान्य बकरी सीरम को इनक्यूबेट करें और अतिरिक्त तरल को हिलाएं। एंटीबॉडी के 150 μL जोड़ें मैं बूंद से गिरता हूं और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर खड़ा रहता हूं, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करता हूं। अगले दिन, 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से गर्म करें।
    3. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं। 3% बीएसए के साथ स्लाइड पर ऊतक को कवर करें और इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सील करें। एंटीबॉडी II की बूंद से 150 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें। प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं और डीएबी रंग विकास तरल ड्रॉपवाइज के 150 pL जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे धुंधला होने की डिग्री का निरीक्षण करें जब तक कि नमूना नग्न आंखों के लिए भी भूरा-पीला न हो जाए।
    4. तुरंत, 10 मिनट के लिए पीबीएस से धो लें। हेमटोक्सिलिन के साथ फिर से दाग लगाएं, ग्रेडिएंट अल्कोहल में निर्जलित करें, जाइलीन में स्लाइड पारदर्शी बनाएं, और तटस्थ गम के साथ सील करें।
  6. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. संबंधित प्रोटीन की सकारात्मक अभिव्यक्ति के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से दाग वाले खंड पीले या भूरे-पीले होते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल वर्गों के प्रत्येक समूह के लिए इमेज जे सॉफ्टवेयर द्वारा सकारात्मक अभिव्यक्ति की तीव्रता को स्कोर करें और औसत ऑप्टिकल घनत्व (एओडी) के मूल्यांकन मानदंडों का उपयोग करें, जो क्षेत्र द्वारा विभाजित आईओडी द्वारा गणना की जाती है।
    2. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। टी-टेस्ट का उपयोग करें यदि डेटा सामान्य वितरण और ची-स्क्वायर के अनुरूप है और गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग करें यदि वे सामान्य वितरण के अनुरूप नहीं थे। सामान्यीकृत आकलन समीकरणों द्वारा बार-बार माप डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

दर्द व्यवहार परीक्षण
एमडब्ल्यूटी के परिणामों से पता चला है कि मॉडलिंग के बाद दाहिने हिंद अंग का एमडब्ल्यूटी पहले की तुलना में काफी कम था (पी < 0.05)। नियंत्रण समूह की तुलना में, चूहों का एमडब्ल्यूटी टुइना (पी<0.05) के बाद काफी ऊंचा था। चित्र 5 और तालिका 2)।

Figure 5
चित्र 5. मैकेनिकल वापसी थ्रेशोल्ड टेस्ट के परिणाम (Equation 1, न्यूटन)। तुइना समूह और नियंत्रण समूह में प्रत्येक में 5 चूहे थे। अलग-अलग समय बिंदुओं पर चूहों का एमडब्ल्यूटी चित्र में दिखाया गया है। मॉडलिंग के बाद, चूहों के एमडब्ल्यूटी में काफी कमी आई, यह सुझाव देते हुए कि चूहों का दर्द बढ़ गया था, और केओए मॉडल सफलतापूर्वक तैयार किया गया था। इसके बाद, एमडब्ल्यूटी में धीरे-धीरे सुधार हुआ, जिससे दर्द से राहत मिली। सांख्यिकीय गणना के लिए सामान्यीकृत अनुमान समीकरण का उपयोग किया गया था। ट्यूना समूह और नियंत्रण समूह के बीच एमडब्ल्यूटी में अंतर मॉडलिंग के बाद की तुलना में 21 वें दिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था। दोनों समूहों के बीच तुलना डी 7, डी 14 और डी 21, * पी < 0.05 पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। इसके अलावा, तुइना समूह में चूहों में नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक एमडब्ल्यूटी होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2. मैकेनिकल निकासी सीमा (Equation 1, एन)। मॉडलिंग से पहले और बाद में तुलना, # p<0.05। तुइना समूह और नियंत्रण समूह के बीच तुलना, * पी<0.05। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पीडब्ल्यूएल के परिणामों से पता चला है कि मॉडलिंग के बाद दाहिने पिछले अंग का पीडब्ल्यूएल पहले की तुलना में काफी कम था (पी < 0.05)। नियंत्रण समूह की तुलना में, चूहों का एमडब्ल्यूटी टुइना (पी<0.001) के बाद काफी लंबा था। चित्र 6 और तालिका 3)।

Figure 6
चित्र 6. पंजा वापसी विलंबता परीक्षण के परिणाम (Equation 1, दूसरा)। तुइना समूह और नियंत्रण समूह में प्रत्येक में 5 चूहे थे। अलग-अलग समय बिंदुओं पर चूहों के पीडब्ल्यूएल को चित्र में दिखाया गया है। मॉडलिंग के बाद, चूहों के पीडब्ल्यूएल में काफी कमी आई, यह सुझाव देते हुए कि चूहों का दर्द बढ़ गया था, और केओए मॉडल सफलतापूर्वक तैयार किया गया था। सबसे पहले, ट्यूना समूह में पीडब्ल्यूटी का सुधार नियंत्रण समूह की तुलना में धीमा था। डी 7 के बाद, ट्यूना समूह में चूहों में तेजी से सुधार हुआ और डी 21 पर नियंत्रण समूह को पार कर गया। सांख्यिकीय गणना के लिए सामान्यीकृत अनुमान समीकरण का उपयोग किया गया था। ट्यूना समूह और नियंत्रण समूह के बीच एमडब्ल्यूटी में अंतर मॉडलिंग के बाद की तुलना में 21 वें दिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था। दोनों समूहों के बीच तुलना डी 7, डी 14 और डी 21, *** पी < 0.001 पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3. पंजा वापसी विलंबता (Equation 1, एस)। मॉडलिंग से पहले और बाद में तुलना, # p<0.05। Tuina समूह और नियंत्रण समूह के बीच तुलना, ***p<0.001. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

हिस्टोमॉर्फोलॉजिकल परख
नियंत्रण समूह में श्लेष झिल्ली का विश्लेषण करने पर, श्लेष ऊतक में भड़काऊ कोशिका घुसपैठ और रेशेदार ऊतक हाइपरप्लासिया देखा गया। श्लेष कोशिकाएं अव्यवस्थित थीं, और श्लेष ऊतक के चारों ओर केशिका हाइपरप्लासिया की एक छोटी मात्रा देखी गई थी (चित्रा 7)।

Figure 7
चित्र 7. श्लेष ऊतक का सूक्ष्म अवलोकन। (ए) नियंत्रण समूह में श्लेष ऊतक। श्लेष कोशिकाओं की अव्यवस्थित व्यवस्था आकृति में देखी जाती है। प्रसार वाहिकाओं को लाल तीर ों के साथ चिह्नित किया जाता है, और भड़काऊ कोशिकाओं को काले तीरों के साथ चिह्नित किया जाता है। (बी) तुइना समूह में श्लेष ऊतक। श्लेष कोशिकाओं को अधिक करीने से व्यवस्थित किया गया था। भड़काऊ कोशिकाएं मुख्य रूप से अंदर की ओर घुसपैठ करने के बजाय किनारों पर वितरित की जाती हैं। प्रसार वाहिकाओं को लाल तीर ों के साथ चिह्नित किया जाता है, और भड़काऊ कोशिकाओं को काले तीरों के साथ चिह्नित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ट्यूना समूह में, श्लेष कोशिकाओं को बड़े करीने से व्यवस्थित किया गया था, जिसमें सूजन कोशिका घुसपैठ, रेशेदार ऊतक हाइपरप्लासिया की एक छोटी मात्रा और ऊतक मार्जिन पर थोड़ी मात्रा में केशिका हाइपरप्लासिया दिखाई दे रही थी।

उपास्थि का विश्लेषण करने पर, यह देखा गया कि ट्यूना समूह में ट्यूनल धुंधला सकारात्मक क्षेत्र नियंत्रण समूह की तुलना में काफी छोटा था, यह दर्शाता है कि ट्यूना समूह में कम एपोप्टोटिक चोंड्रोसाइट्स थे (चित्रा 8)।

Figure 8
चित्र 8. कार्टिलेज का ट्यूनल धुंधला होना। (ए) नियंत्रण समूह में उपास्थि। आकृति का लाल भाग ट्यूनल धुंधला होने का सकारात्मक क्षेत्र है। (बी) तुइना समूह में उपास्थि। आकृति का लाल भाग ट्यूनल धुंधला होने का सकारात्मक क्षेत्र है। ट्यूना समूह में सकारात्मक क्षेत्र नियंत्रण समूह की तुलना में काफी छोटा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
टीएनएफ -α के लिए, दो समूहों के बीच श्लेष टीएनएफ -α अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण अंतर था, और ट्यूना समूह में अभिव्यक्ति नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम थी (तालिका 4)।

तालिका 4. सिनोवियम में टीएनएफ -α अभिव्यक्ति (Equation 1, * 10-2)। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो स्वतंत्र नमूना टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, * पी < 0.05। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

आईएल -1 के लिए, दो समूहों के बीच श्लेष आईएल -1 अभिव्यक्ति की मात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जैसा कि छवि जे के आंकड़ों द्वारा मापा गया था। हालांकि, तुइना समूह का औसत मूल्य सूक्ष्म रूप से कम था, जो कम अभिव्यक्ति को दर्शाता है (तालिका 5)।

तालिका 5. सिनोवियम में आईएल -β अभिव्यक्ति (Equation 1, * 10-2)। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो स्वतंत्र नमूना टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह अध्ययन केओए चूहों पर ट्यूना हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। दर्द व्यवहार परीक्षणों और हिस्टोमॉर्फोलॉजिकल निष्कर्षों के माध्यम से, यह सुझाव दिया गया कि केओए चूहों पर लागू ट्यूना हेरफेर की ऐसी श्रृंखला श्लेष सूजन और उपास्थि एपोप्टोसिस को कम कर सकती है, जो केओए के पशु मॉडल पर ट्यूना हेरफेर का संदर्भ हो सकता है।

प्रोटोकॉल के दौरान कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाएं हैं। सबसे पहले, केओए मॉडल को प्रेरित करने के लिए एक उपयुक्त विधि चुनना महत्वपूर्ण है। केओए मॉडल को प्रेरित करने के लिए विभिन्न तरीके हैं, जिनमें संयुक्त गुहा इंजेक्शन 25, इंट्रा-आर्टिकुलर सर्जरी 26,27, संयुक्त ब्रेकिंग विधि 28,29 आदि शामिल हैं। चूंकि आक्रामक तरीकों से प्रेरित केओए मॉडल जोड़ों के पास घाव छोड़ देंगे, जो ट्यूना हेरफेर के प्रभाव में हस्तक्षेप कर सकते हैं, इसलिए हमने संयुक्त स्थिरीकरण की गैर-इनवेसिव विधि को चुना। संयुक्त स्थिरीकरण विधि को हाइपर-एक्सटेंशन और हाइपर-फ्लेक्सन निर्धारण में विभाजित किया जा सकता है। शांग एट अल ने इन दो निर्धारण विधियों के प्रभावों की तुलना की और पाया कि उपास्थि एपोप्टोसिस23 के प्रभाव में थोड़ा अंतर था। हालांकि, उनके प्रयोगात्मक विषय खरगोश थे, जो आकार में बड़े होते हैं और चूहों की तुलना में ठीक करने में अपेक्षाकृत आसान होते हैं। फ्लेक्सन स्थिति में स्थिर प्लास्टर चूहों के कुतरने के नीचे गिरने की अधिक संभावना है। इसलिए, हमने केओए को प्रेरित करने के लिए हाइपर-एक्सटेंशन निर्धारण की स्थिरीकरण विधि को चुना। हमने हे एट अल का उल्लेख किया और निर्धारण उपकरण30 के रूप में जीभ डिप्रेसर के साथ प्लास्टर पट्टी का उपयोग किया। हालांकि, चूहों की कुतरने की क्षमता अपेक्षा से अधिक मजबूत थी, और डिवाइस निर्धारण के रूप में काम नहीं कर सका। बाद में हमें एक प्रकार की नकली दांत आधार सामग्री मिली, जो प्लास्टर के बाहर एक ढालने योग्य लेकिन कठोर खोल बना सकती है, और चूहों द्वारा निर्धारण उपकरण की टूट-फूट को प्रभावी ढंग से कम कर सकती है। एक तंग निर्धारण निचले अंगों के रक्त परिसंचरण को प्रभावित करेगा, जबकि बहुत ढीला निर्धारण गिरना आसान होगा। इसलिए, मॉडलिंग के 3 सप्ताह के दौरान चूहों के निचले अंगों का परिसंचरण दैनिक रूप से देखा जाना चाहिए। निर्धारण तब जारी किया जाना चाहिए जब निचले अंग सूज जाते हैं और बैंगनी हो जाते हैं। ढीला होने पर निर्धारण को फिर से स्थापित करें, और चूहे अपने घुटनों को फ्लेक्स कर सकते हैं। इस अध्ययन के दौरान, चूहों को मॉडलिंग के दौरान सामाजिककरण से प्रतिबंधित नहीं किया गया था, लेकिन यह पाया गया कि वे एक-दूसरे को मुक्त होने में मदद करने के लिए एक-दूसरे के निर्धारण को चबाएंगे। शायद चूहों को अलग करने से बेहतर मॉडलिंग होती। हालांकि, अलगाव चूहों के अवसाद और रूढ़िवादी व्यवहार में योगदान कर सकता है।

हम मानते हैं कि तुइना हेरफेर का मुख्य बिंदु तीव्रता और आवृत्ति की स्थिरता रखना है। पिछले शोध ने निष्कर्ष निकाला कि पशु ट्यूना के लिए इष्टतम तीव्रता इसकी अधिकतम सहनीय तीव्रता31 का 80% होनी चाहिए। इस बिंदु पर, चूहों को यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त करने के संकेत दिखाने चाहिए, लेकिन दर्द या पंजे के पीछे हटने के कोई संकेत नहीं हैं। हमने चूहों की अधिकतम सहनीय तीव्रता का परीक्षण किया, जो लगभग 5-8 एन है। इसलिए, हम पुशिंग तीव्रता को 3-5 एन पर सेट करते हैं, जिससे बेहतर प्रभावकारिता हो सकती है। टुइना की पाठ्यपुस्तक के अनुसार, हेरफेर की आवृत्ति 2 हर्ट्ज है। पिछले अध्ययनों ने ट्यूना हेरफेर के लिए एक मानकीकरण निर्धारित नहीं किया है, और प्रयोग के दौरान विभिन्न एक्यूपॉइंट संचालित करने और बाएं और दाएं हाथों को बदलने के बाद तीव्रता और आवृत्ति भिन्न हो सकती है, जो परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकती है। इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली उंगली दबाव रिकॉर्डिंग प्रयोग के दौरान हेरफेर की तीव्रता और आवृत्ति का वास्तविक समय अवलोकन प्रदान करती है, जो हेरफेर की स्थिरता को बनाए रख सकती है। कुछ विद्वान टुइना हेरफेर का अनुकरण करने और इसे जानवरों पर लागू करने के लिए मशीनों का उपयोग करते हैं, जिसमें हेरफेर32 के मानकीकरण का लाभ है।

एक्यूपॉइंट के चयन के लिए, हमने वांग और लियू के अध्ययन का उल्लेख किया और हेरफेर33,34 की सुविधा के लिए घुटने के जोड़ के चारों ओर पांच एक्यूपॉइंट चुने। हमने केओए को प्रेरित करने के लिए प्लास्टर-स्थिर विधि को चुना, जो ज्यादातर मांसपेशियों के शोष और संयुक्त कठोरता35 के साथ समाप्त होता है। एसटी 34 और एसटी 35 पैर यांगमिंग पेट मेरिडियन से संबंधित हैं जो पारंपरिक चीनी चिकित्सा सिद्धांत में शोष (ज्यादातर कमजोरी और मांसपेशी शोष के रूप में प्रकट होता है) के इलाज में महत्वपूर्ण है और प्लास्टर-स्थिर विधि द्वारा प्रेरित केओए के लिए अच्छी अनुकूलन क्षमता है। एक्स-एलई 4 केओए के नैदानिक उपचार के लिए एक सामान्य एक्यूपॉइंट है, जो ज्यादातर एसटी 35 के साथ उपयोग किया जाता है। टैन एट अल ने पाया कि एसटी 35, एसटी 36, और ईएक्स-एलई 4 पर एक्यूपंक्चर और मोक्सीबसेशन श्लेष झिल्ली36 में भड़काऊ कारक अभिव्यक्ति को कम कर सकता है। एसपी 10 और बीएल 40 केओए 37,38 के लिए नैदानिक ट्यूना उपचार के मुख्य एक्यूपॉइंट हैं, और एसपी 10 का उपयोग केओए39 के लिए ट्यूना नुस्खे में सबसे अधिक बार किया जाता है।

तुइना हेरफेर का एक कठिन हिस्सा चूहों का निर्धारण है। चूहे संघर्ष कर सकते हैं या हेरफेर से बच सकते हैं, जिससे प्रयोग करने की कठिनाई बढ़ जाती है। यद्यपि चूहे के इम्मोबिलाइज़र चूहों को गतिहीन कर सकते हैं और उनके पिछले अंगों को उजागर कर सकते हैं, केओए का विकास हिंद अंग फ्लेक्सन और विस्तार को सीमित करता है। इसलिए, इमोबिलाइज़र के साथ चूहों को बसाने से पिछले अंगों में दर्द और अपूर्ण जोखिम हो सकता है, जो ट्यूना हेरफेर को प्रभावित कर सकता है। हमने अंधेरे वातावरण के लिए चूहे की पसंद और बिलों की प्रवृत्ति के आधार पर एक एकल-निकास कपड़े का बैग तैयार किया। चूहा प्रवेश करने पर कपड़े की थैली बंद कर देता है, अर्थात, सिर और अग्रभाग बैग में स्थित होते हैं, और उसके पिछले अंग बाहर उजागर होते हैं। यह विधि चूहों के संघर्ष को प्रभावी ढंग से कम कर सकती है और तुइना के दौरान उन्हें शांत रख सकती है।

पूर्व-प्रयोग के परिणाम बताते हैं कि ट्यूना हेरफेर श्लेष ऊतक की भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम कर सकता है और चोंड्रोसाइट्स के एपोप्टोसिस को कम कर सकता है, इस प्रकार केओए के लिए उपचार के रूप में कार्य कर सकता है। हालांकि, इसे सत्यापित करने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता है।

इस प्रोटोकॉल की कई कमियां हैं। सबसे पहले, चूहों का छोटा आकार एक्यूपॉइंट को ठीक से पता लगाना मुश्किल बनाता है। चूहों पर एक्यूपॉइंट की तुलना में ऑपरेटर की उंगलियां बहुत बड़ी होती हैं, जो ट्यूना हेरफेर के प्रभाव को प्रभावित कर सकती हैं। हमने एक्यूपॉइंट को उत्तेजित करने की सटीकता बढ़ाने के लिए उंगलियों पर लगभग 2 मिमी व्यास का रबर कण जोड़ने पर विचार किया था। लेकिन कणों से दबाव की उच्च तीव्रता हो सकती है और स्थिरता को नियंत्रित करने में कठिनाई बढ़ सकती है। इसके अलावा, यह उंगली के दबाव रिकॉर्डिंग को नुकसान पहुंचाने की अधिक संभावना थी, इसलिए हमने इस विधि को नहीं चुना। दूसरा, हमारे अध्ययन ने श्लेष द्रव और चोंड्रोसाइट्स एपोप्टोसिस में भड़काऊ कारकों के परिवर्तन को नजरअंदाज कर दिया, जो अध्ययन की विश्वसनीयता को कमजोर कर सकता है। हम भविष्य में इस क्षेत्र में अनुसंधान को तेज करेंगे। तीसरा, प्रेस और गूंधने में हेरफेर ट्यूना जोड़तोड़ में से एक है, और केओए के इलाज में ट्यूना के प्रभावों को शामिल नहीं कर सकता है। जानवरों में लागू अन्य ट्यूना जोड़तोड़ को आगे पता लगाने की आवश्यकता है, जिसमें संयुक्त आंदोलन जोड़तोड़, और रगड़ हेरफेर शामिल हैं। इसके अलावा, सकारात्मक नियंत्रण हेरफेर की प्रभावशीलता को बेहतर ढंग से दिखाएगा, लेकिन यह इस अध्ययन में डिज़ाइन नहीं किया गया था, और हम इसे अनुवर्ती अध्ययन में जोड़ देंगे।

कुल मिलाकर, यह अध्ययन केओए चूहों पर ट्यूना हेरफेर के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, और हेरफेर की प्रभावशीलता को दर्द व्यवहार परीक्षणों और सूक्ष्म निष्कर्षों द्वारा सत्यापित किया गया है। प्रोटोकॉल प्रारंभिक साबित करता है कि ट्यूना के चिकित्सीय प्रभाव श्लेष सूजन को कम करने और चोंड्रोसाइट्स एपोप्टोसिस में देरी से संबंधित हो सकते हैं। केओए के लिए तुइना के तंत्र का पता लगाने के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

यह काम शंघाई क्रिटिकल क्लिनिकल स्पेशियलिटीज कंस्ट्रक्शन प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या: Shslczdzk04001) द्वारा समर्थित था; शंघाई विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग के नौकायन कार्यक्रम (अनुदान संख्या: 22YF1444300); पारंपरिक चीनी चिकित्सा के शंघाई विश्वविद्यालय के बजट के भीतर परियोजनाएं (अनुदान संख्या: 2021 एलके091)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absolute ethanol Supelco PHR1070 For making specimen
ALMEMO admeasuring apparatus ahlborn 2450-1 For Mechanical Withdrawal Threshold test
Anti-Digoxin antibody Sigma-Aldrich SAB4200669 For HE stain IHC or TUNEL
Anti-IL-1 beta abcam ab283818 For HE stain IHC or TUNEL
DAB Substrate kit Solarbio DA1010 For HE stain IHC or TUNEL
Denture base materials Shanghai New Century 20000356 For model making
eosin bioswamp  PAB180016  For HE stain IHC or TUNEL
Finger pressure recordings Suzhou Changxian Optoelectronic Technology CX1003w For Tuina manipulation
formic acid solution Sigma-Aldrich 695076 For decalcification
H2O2 Sigma-Aldrich 386790-M For HE stain IHC or TUNEL
hematoxylin bioswamp  PAB180015 For HE stain IHC or TUNEL
Isoflurane Shanghai Yuyan Scientific Instrument Company S10010533 For gas anesthesia
neutral resins bioswamp  PAB180017 For HE stain IHC or TUNEL
Paraformaldehyde Fix Solution Sigma-Aldrich 100496 For histology
PBS Sigma-Aldrich P3813 For HE stain IHC or TUNEL
Plantar Test Apparatus IITC Life Science / For Paw Withdrawal Latency test
plaster of Paris bandage WANDE 20150023 For model making
Proteinase K Sigma-Aldrich 124568 For HE stain IHC or TUNEL
TNF Alpha Monoclonal antibody Proteintech 60291-1-Ig For HE stain IHC or TUNEL
TUNEL  Servicebio GDP1042 For HE stain IHC or TUNEL
Wax Sigma-Aldrich 327204 For making specimen
xylene Shanghai Sinopharm Group 100092 For making specimen

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References

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चिकित्सा अंक 196
घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस चूहों में सूजन और उपास्थि हानि को कम करने के लिए ट्यूना हेरफेर
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Su, X., Song, P., Meng, F., Xu, W.,… More

Su, X., Song, P., Meng, F., Xu, W., Xing, H., Zhang, H. Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats. J. Vis. Exp. (196), e65451, doi:10.3791/65451 (2023).

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