Automatically Generated

Summary

En optisk densitetsbaseret mikroplademetode beskrives til kvantificering af langsigtet bakterievækst i nærvær af bakteriofager, egnet til actinomycetes og andre langsomt voksende bakterier. Denne metode inkluderer ændringer for at reducere fordampning og lågkondensering og R-kode til beregning af virusinfektionsmålinger, herunder arealet under kurven, vækstmaksimum og relativ virulens.

Abstract

Bakteriofager er en vigtig del af naturlige miljøer, og de har en stærk evne til at forme bakteriepopulationer. For at forstå, hvordan individuelle fager interagerer med langsomt voksende bakterieværter som actinomycetes, er der behov for en nem og pålidelig metode til kvantificering af langsigtet bakterievækst i nærvær af fager. Spektrofotometriske mikropladelæsere giver mulighed for gentagne målinger med høj kapacitet, men inkubation af et lille volumen i længere tid kan give tekniske udfordringer. Denne procedure tilpasser en standard 96-brønds mikroplade for at muliggøre samdyrkning af fager og bakterier uden delprøveudtagning i 96 timer, hvor bakterievæksten registreres hver 8. time ved hjælp af spektrofotometriske absorbansværdier. Disse optiske densitetsværdier analyseres ved hjælp af R for at give infektionsmålinger, herunder den procentvise væksthæmning, relativ virulens og Stacy-Ceballos-indekset. De metoder, der er skitseret her, giver en effektiv måde at udføre og analysere eksperimenter med mikropladevækstkurve med forlænget varighed og inkluderer ændringer for at reducere fordampning og lågkondensering. Disse protokoller letter mikropladebaserede analyser af interaktioner mellem langsomt voksende bakterieværter og deres bakteriofager.

Introduction

Bakteriofager eller fager er vira, der inficerer bakterier. De er de mest talrige biologiske enheder på planeten¹, og det er generelt accepteret, at bakteriofager påvirker bakteriel udvikling og økosystemprocesser ^2,3,4. Der findes flere metoder til at beskrive, måle og analysere bakteriofagværtsområde 8 og infektionsdynamik^5,6, herunder agarbaserede metoder såsom dobbeltlags agarmetode⁷ og optisk densitetsbaserede mikroplademetoder^8,9,10,11,12. Hver metode har sine egne fordele og ulemper. På grund af deres effektivitet er pletteringstest ved hjælp af dobbeltlags agarmetoden “guldstandarden” for værtsområdeanalyser, men denne metode er tids- og arbejdskrævende⁹. Hurtige mikroplademetoder, der returnerer resultater inden for 24 timer eller mindre, giver fremragende resultater for hurtigt voksende bakterieværter som Escherichia coli 9,10,11,12, men er for korte til at fremvise bakteriofaginfektionsprogression i langsommere voksende bakterieværter såsom actinomycetes^7,13,14,15.

Et optisk densitetsbaseret mikropladeassay designet til hurtigt voksende bakterier kan ikke køres i de flere dage, der kræves for at karakterisere infektionsdynamikken i en langsomt voksende værtsbakterie, uden at fordampning forekommer og giver kunstigt høje bakterietætheder. Opnåelse af sammenlignelige data med høj kapacitet om bakteriofaginfektionsdynamik for langsomt voksende bakteriearter kræver således specialiserede teknikker tilpasset disse bakterier.

Mikroplademetoden, der præsenteres her, reducerer fordampningen, hvilket gør det muligt at dyrke langsomt voksende bakterier sammen med en i en længere periode på 96 timer og muliggøre undersøgelser af faginfektionsdynamik og værtsområde. Denne metode viser også Stacy-Ceballos-indekset¹⁶, en optisk tæthedsbaseret metrik, der giver mulighed for virulenssammenligninger mellem forskellige værtsvirussystemer.

Protocol

Mens denne protokol er skrevet til Gordonia terrae, er den også blevet brugt med succes til Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta og Gordonia westfalica. 1. Bakterie forberedelse I et biosikkerhedsskab skal du bruge god mikrobiologisk praksis17 til at inokulere en enkelt koloni af Gordonia terrae CAG3 i en 1 L steril forvirret kolbe med 200 ml peptongær calciumbouillon18 (PYCa) indeholdende 0,01 mg / ml cycloheximid (se materialetabellen). Kolben inkuberes ved 30 °C under omrystning ved 250 o/min, indtil kulturen er mættet, eller i 3 dage7. Serielt fortyndes den mættede G. terrae-kultur serielt i PYCa-bouillon og spredningspladen 100 μL hver af 10-4-, 10-5- og 10-6-fortyndingerne på PYCa-plader 19,20. Den ufortyndede mættede kultur opbevares i køleskab ved 4 °C. Spredepladerne inkuberes omvendt i 3 dage ved 30 °C. Efter inkubation identificeres en “tællelig plade”, en plade med 20-200 kolonier. Antallet af kolonier på pladen tælles, og de kolonidannende enheder pr. milliliter (cfu/ml) beregnes19,20. Fortynd den mættede kultur med PYCa bouillon til 4,0 x 106 cfu / ml bakterier. 2. Phage forberedelse BEMÆRK: De rapporterede repræsentative resultater blev opnået med Gordonia-fagen DelRio21, en tempereret bakteriofag isoleret på G. terrae. Disse metoder er også blevet anvendt med succes med andre Gordonia-fager . Begyndende med en isoleret bakteriofag, fortynd fagprøven serielt i fagbuffer7 til en 1 x 10-8 fortynding. Udfør en dobbeltlags agarfagtiteranalyse7 ved at inficere 0,3 ml af den mættede G. terrae-kultur med 10 μL af hver fagfortynding. Efter en 5-10 minutters stuetemperaturinkubation kombineres bakterie-fagblandingen med 3 ml PYCa topagar og hældes på PYCa agarplader. Pladerne inkuberes omvendt ved 30 °C i 3 dage, eller indtil plaques danner7. Efter inkubation identificeres en “tællelig plade”, en plade med 20-200 plaques. Tæl antallet af plaques på pladen, og beregn plakdannende enheder pr. milliliter (pfu/ml)7. 3. Fremstilling af mikroplader BEMÆRK: Fladbundede mikroplader med 96 brønde (se materialetabellen) skal bruges til denne metode. Al forberedelse og påfyldning af plader skal foregå i et biosikkerhedsskab, og god mikrobiologisk praksis17bør anvendes. Forbered antiduglågbelægningsopløsningen ved at kombinere 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol og 160 ml deioniseret vand22. Rør for at blande, og opbevar ved stuetemperatur. I et biosikkerhedsskab tilsættes 6 ml lågbelægningsopløsning til indersiden af et sterilt 96-brønds mikropladelåg, holder låget ved kanterne og roterer det for at sikre, at det er dækket af opløsningen. Lad opløsningen sidde på låget i 20 sekunder, hæld derefter opløsningen af, og vend låget på et autoklaveret køkkenrulle skråt, indtil låget er helt tørt, hvilket typisk tager 35-45 min. Pas på at holde låget ved kanterne. Forbered 20 ml 0,1% agarose i vand for hver 96-brønds mikroplade, mikrobølgeovn for at smelte agarose. Når agarosen er afkølet til 50-60 °C, pipetteres 100 μL 0,1 % agarose ind i alle mellemrummene mellem pladens brønde og 200 μL agarose i hullerne i række A og række H og kolonne 1, kolonne 2, kolonne 11 og kolonne 1223 (figur 1). 4. Ilægning af pladen med bakterier og BEMÆRK: Al pladeforberedelse og påfyldning skal udføres i et biosikkerhedsskab, og god mikrobiologisk praksis17 skal anvendes. 96-brøndspladen vil indeholde 75 μL 2,0 x 106 cfu/ml bakterier i hver brønd9. Fortynd 4,0 x 10 6 cfu/ml bakteriekultur 1:1 med 2x PYCa bouillon til 2,0 x 106 cfu/ml. Forbered 5 ml pr. 96-brøndplade. Fortynd faglysatet ved hjælp af fagbuffer7 for at fremstille 1 ml hver af 2,0 x 106 pfu / ml, 2,0 x 105 pfu / ml og 2,0 x 104 pfu / ml koncentrationer. Dette vil muliggøre en mangfoldighed af infektion (MOI) på 1, 0,1 og 0,01 inden for mikropladen9. For at fylde mikropladen skal du tage en plade, der er fremstillet med anti-tågeopløsning og agarose, og pipet 75 μL af 2,0 x 106 cfu / ml bakterier i kolonne 3-10, efter figur 1. I kolonne 3 og kolonne 4 tilsættes 75 μL steril fagbuffer til hvert hul for at fungere som en positiv kontrol uden efter figur 1, og pipetten op og ned for at blande efter hver tilsætning. Der tilsættes 75 μL af 2,0 x 10 6 pfu/ml i kolonne 5 og kolonne6 , 75 μL af 2,0 x 105 pfu/ml til kolonne 7 og kolonne 8 og 75 μL af 2,0 x 104 pfu/ml til kolonne 9 og kolonne 10, idet der pipetteres op og ned for at blandes efter hver tilsætning. Tape begge korte sider af pladen med 0,5 i mærkningstape for delvist at forsegle pladen, samtidig med at gasudveksling tillades. 5. Inkubations- og absorbansmåling Når pladerne er fyldt med bakterier og, anbringes de på en mikropladeryster ved 250 omdr./min. og inkuberes ved 30 °C. Pladerne inkuberes i 96 timer, idet der foretages en optisk densitetsmåling ved 600 nm på en mikropladelæser hver 8. time fra time 16. Sæt pladerne tilbage på rysteren mellem målingerne.BEMÆRK: Måleperioder på 4, h 6 timer, 8 timer og 12 timer blev vurderet, begyndende ved time 0, og det blev fastslået, at en 8 timers prøvetagningsperiode, der begyndte 16 timer efter infektion, bedst fangede Gordonia-faginteraktionerne. Overvåg låget for kondens under hele eksperimentet. Hvis der observeres kondens, skal låget udskiftes med et andet låg, der er belagt i henhold til trin 3.2. Generer kontrol- og inficerede vækstkurver efter protokolafsnit 6. 6. Analyse af data Brug et regnearksprogram til at beregne gennemsnits- og standardafvigelsen for hver fagfortynding ved at følge regnearklayoutet i Stacy-Ceballos-Index GitHub-lageret (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index). Opret kontrol- og inficerede vækstkurver, og beregn infektionsmålinger ved hjælp af R (se materialetabellen) med pakkerne DescTools 24, dplyr 25, ggplot226 og readxl 27 og følg R-scriptet i Stacy-Ceballos-Index GitHub-lageret (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).AUCcon er området under den ikke-inficerede kontrolkurve, mens AUCinf er området under den inficerede kurve16. Beregn AUC, og beregn derefter den procentvise væksthæmning baseret på arealet under kurveværdierne, PIAUC16, ved hjælp af følgende ligning:(1 – [AUCinf/AUCcon]) × 100 De stiplede vandrette linjer på hver kurve viser topvæksten, med den ikke-inficerede væksttop mærket N asymptote (con) og den inficerede væksttop mærket Nasymptote (inf). IdentificerN-asymptotværdierne, og beregn derefter procentvis væksthæmning baseret på disse maksimale vækstværdier, PImax16, ved hjælp af følgende ligning:(1 – [N asymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100 Stacy-Ceballos-indekset, ISC16, beregnes ud fra værdierne PIAUC og PImax på følgende måde:(PIAUC × PImax) 0.5Beregn relativ virulens ved at integrere Stacy-Ceballos-indekset over tid16.

Representative Results

Et eksperiment er vellykket, hvis den resulterende vækstkurve viser en stigning i den positive kontrolbakteriepopulation over tid uden pludselige udsving i absorbansen. Eksempler på et vellykket eksperiment ved en MOI på 1 med og uden en produktiv faginfektion er vist i henholdsvis figur 2 og figur 3. En produktiv infektion ved en MOI på 0,01 er repræsenteret i figur 4. Det positive kontrolvækstmønster (grøn kurve), der ses i alle tre figurer, indikerer, at bakterierne vokser, de klumper sig ikke sammen under væksten, og der er ingen forurenende stoffer til stede. Klumpning og kontaminering indikeres ved usædvanlig høj absorbans på et enkelt tidspunkt. Standardafvigelser øges typisk i løbet af et eksperiment; En drastisk stigning eller standardafvigelser, der overlapper mellem kontrolkurven og de inficerede kurver, kan imidlertid indikere kontaminering eller sammenklumpning i en eller flere brønde. Vækstkurven, der viser en produktiv faginfektion, repræsenteret ved figur 2, viser reduceret bakteriel absorbans over tid i brønde med fagen tilsat. Denne reduktion i bakterietæthed ses ikke, hvis bakterien er uden for fagens værtsområde, som vist i figur 3. Infektionsmålinger vises for alle de repræsentative eksperimenter, med en relativt stor I SC for de produktive infektioner i figur 2 og figur 4 og en meget lille ISC i figur 3 for fagen, der ikke effektivt inficerede værtsbakterien. Figur 1: Mikropladelayout. De grå områder er fyldt med 0,1% agarose. De tomme brønde i kolonne 3 og kolonne 4 er positive kontrolhuller uden fager, der kun indeholder fagbuffer og 2,0 x 106 cfu/ml bakterier. De stiplede brønde indeholder og 2,0 x 106 cfu / ml bakterier; de store prikker i kolonne 5 og kolonne 6 angiver en MOI på 1 med 2,0 x 106 pfu/ml de mellemstore prikker i kolonne 7 og kolonne 8 angiver en MOI på 0,1 med 2,0 x 105 pfu/ml og de små prikker i kolonne 9 og kolonne 10 angiver en MOI på 0,01 med 2,0 x 104 pfu/ml. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Et vellykket vækstkurveeksperiment med en ved en MOI på 1, der produktivt inficerer værtsbakterien. De gennemsnitlige absorbansværdier (± standardafvigelse) vises for uinficerede bakterier (grøn) og bakterier med fagen tilsat (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = procentvis væksthæmning beregnet ud fra arealet under kurven; Nasymptote = maksimal vækstværdi; PImax = procent væksthæmning beregnet ud fra de maksimale vækstværdier; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne graf repræsenterer den tempererede Gordonia- DelRio inficerer G. terrae, bakterien den blev isoleret på. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Et vellykket vækstkurveeksperiment med en ved en MOI på 1, der ikke effektivt inficerer værtsbakterien. De gennemsnitlige absorbansværdier (± standardafvigelse) vises for uinficerede bakterier (grøn) og bakterier med fagen tilsat (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = procentvis væksthæmning beregnet ud fra arealet under kurven; Nasymptote = maksimal vækstværdi; PImax = procent væksthæmning beregnet ud fra de maksimale vækstværdier; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne graf repræsenterer G. rubripertincta infektion af DelRio. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Et vellykket vækstkurveeksperiment med en ved en MOI på 0,01. De gennemsnitlige absorbansværdier (± standardafvigelse) vises for uinficerede bakterier (grøn) og bakterier med fagen tilsat (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = procentvis væksthæmning beregnet ud fra arealet under kurven; Nasymptote = maksimal vækstværdi; PImax = procent væksthæmning beregnet ud fra de maksimale vækstværdier; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne graf repræsenterer G. terrae infektion af DelRio. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne optiske tæthedsbaserede mikroplademetode tillader undersøgelse af bakteriofagværtsområde og infektionsdynamik¹¹ og viser nytten af Stacy-Ceballos-indekset¹⁶ som et mål for bakteriofagvirulens. Mens denne metode kunne bruges med ethvert bakteriofagværtssystem, blev det designet specielt til at tilpasse hurtige mikropladevækstassays 9,10,11 til brug med langsommere voksende bakterier såsom actinomycetes. Hurtige mikropladeanalyser kan ikke bruges til langsomt voksende bakterier uden ændringer for at adressere fordampning og lågkondensering. Denne metode beskriver disse nødvendige ændringer og demonstrerer for første gang brugen af Stacy-Ceballos-indekset og relaterede målinger¹⁶ til at beskrive bakteriofaginfektion.

Fordampning kan være en betydelig udfordring i flerdages 96-brønds pladevækstkurveassays; Denne metode løser dette problem ved at tilføje agarose til grænsebrøndene og mellemrummene mellem brøndene. Agarosemargenen kombineret med antiduglågsbehandlingen²² giver den nødvendige fugtighed i mikropladen og giver mulighed for pålidelige optiske densitetsmålinger. Uden den tilsatte fugtighed forekommer der betydelig fordampning med kanteffekt²³ i løbet af den lange inkubationsperiode, der kræves, hvilket fører til kunstigt høje aflæsninger af optisk densitet. Antiduglågsbehandlingen er en nødvendig ændring, fordi lågkondensering også kunstigt kan hæve de optiske densitetsværdier. Rystning af pladerne i inkubationsperioden er en anbefalet modifikation, da actinomycete-bakterier kan klumpe under vækst, hvilket giver kunstigt høje optiske densitetsværdier og effektivt reducerer infektionsmangfoldigheden.

Forholdet mellem bakterier og i eksperimenter, der karakteriserer infektionsdynamik, er kritisk, da der skal være nok til at vise en infektionseffekt, men ikke så mange, at værtsbakteriepopulationen straks styrter⁹ eller hyppigheden af lysogeni øges dramatisk²⁸. I denne metode viste forholdet sig at være mest effektivt til at opnå konsistente resultater en MOI på 1, men brugbare resultater blev også opnået med MOI’er på 0,1 og 0,01. Ved implementering af denne metode anbefales det at vælge en koncentration af bakterier og teste flere fagkoncentrationer i MOI-området 0,01-1 9,10,11.

Denne teknik, der er beskrevet her, gør det muligt at vurdere bakteriofag-værtsinteraktioner for langsomt voksende bakterier i mikropladeanalyser med høj kapacitet snarere end med delprøveudtagning fra en større dyrkningskolbe ved hvert måleinterval²⁹. Ved at demonstrere, hvordan mikropladevækstassays 9,10,11 kan tilpasses, øger denne teknik endvidere nytten af andre mikropladebaserede bakteriofagassays til langsommere voksende bakterier, herunder fagkarakterisering^5,6,12 og evolutionsundersøgelser ^30,31. Endelig demonstrerer denne metode brugen af Stacy-Ceballos-indekset¹⁶ til at beskrive bakteriofaginfektion. Denne måling blev oprindeligt udviklet med data fra et arkæologisk virusmodelsystem og beregnes ud fra optiske densitetsværdier, hvilket giver den udbredt anvendelighed på tværs af forskellige virussystemer.

Materials

Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating