Summary
Viene descritto un metodo di micropiastre basato sulla densità ottica per quantificare la crescita batterica a lungo termine in presenza di batteriofagi, adatto per actinomiceti e altri batteri a crescita lenta. Questo metodo include modifiche per ridurre l'evaporazione e la condensa del coperchio e il codice R per calcolare le metriche di infezione da virus, compresa l'area sotto la curva, il massimo di crescita e la virulenza relativa.
Abstract
I batteriofagi sono una parte fondamentale degli ambienti naturali e hanno una potente capacità di modellare le popolazioni batteriche. Per capire come i singoli fagi interagiscono con ospiti batterici a crescita lenta come gli actinomiceti, è necessario un metodo semplice e affidabile per quantificare la crescita batterica a lungo termine in presenza di fagi. I lettori di micropiastre spettrofotometriche consentono misurazioni ripetute ad alta produttività, ma l'incubazione di un piccolo volume per un tempo prolungato può presentare sfide tecniche. Questa procedura adatta una micropiastra standard a 96 pozzetti per consentire la co-coltura di fagi e batteri senza sottocampionamento per 96 ore, con la crescita batterica registrata ogni 8 ore utilizzando valori di assorbanza spettrofotometrici. Questi valori di densità ottica vengono analizzati utilizzando R per ottenere metriche di infezione, tra cui l'inibizione percentuale della crescita, la virulenza relativa e l'indice di Stacy-Ceballos. I metodi qui descritti forniscono un modo efficace per condurre e analizzare esperimenti sulla curva di crescita delle micropiastre di durata estesa e includono modifiche per ridurre l'evaporazione e la condensa del coperchio. Questi protocolli facilitano i saggi basati su micropiastre delle interazioni tra ospiti batterici a crescita lenta e i loro batteriofagi.
Introduction
I batteriofagi o fagi sono virus che infettano i batteri. Sono le entità biologiche più numerose del pianeta1, ed è generalmente accettato che i batteriofagi influenzano l'evoluzione batterica e i processi ecosistemici 2,3,4. Esistono diversi metodi per descrivere, misurare e analizzare l'intervallo di ospiti dei batteriofagi 8 e la dinamica dell'infezione5,6, inclusi metodi basati sull'agar come il metodo agar a doppio strato7 e i metodi di micropiastre basati sulla densità ottica 8,9,10,11,12. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi. A causa della loro efficienza, i test di placcatura che utilizzano il metodo dell'agar a doppio strato sono il "gold standard" per i saggi dell'intervallo ospite, ma questo metodo richiede tempo e manodopera9. I metodi rapidi a micropiastre, che restituiscono risultati in 24 ore o meno, danno risultati eccellenti per ospiti batterici a crescita rapida come Escherichia coli 9,10,11,12 ma sono troppo brevi per mostrare la progressione dell'infezione batteriofaga in ospiti batterici a crescita più lenta come gli actinomiceti 7,13,14,15.
Un test di micropiastre basato sulla densità ottica progettato per batteri a crescita rapida non può essere eseguito per i giorni multipli necessari per caratterizzare le dinamiche di infezione in un batterio ospite a crescita lenta senza che si verifichi l'evaporazione e dia densità batteriche artificialmente elevate. Pertanto, ottenere dati comparabili ad alto rendimento sulle dinamiche di infezione dei batteriofagi per le specie batteriche a crescita lenta richiede tecniche specializzate adattate per questi batteri.
Il metodo a micropiastre qui presentato riduce l'evaporazione, consentendo così ai batteri a crescita lenta di essere co-coltivati con un fago per un periodo prolungato di 96 ore e consentendo indagini sulle dinamiche di infezione dei fagi e sulla gamma dell'ospite. Questo metodo mostra anche l'indice di Stacy-Ceballos16, una metrica basata sulla densità ottica che consente confronti di virulenza tra diversi sistemi di virus ospite.
Protocol
Mentre questo protocollo è scritto per Gordonia terrae, è stato utilizzato con successo anche per Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta e Gordonia westfalica.
1. Preparazione dei batteri
- In un armadio di biosicurezza, utilizzare una buona pratica microbiologica17 per inoculare una singola colonia di Gordonia terrae CAG3 in un pallone sterile da 1 litro con 200 ml di brodo di calcio di lievito peptone18 (PYCa) contenente 0,01 mg/ml di cicloeximide (vedere la tabella dei materiali).
- Incubare il matraccio a 30 °C agitando a 250 giri/min fino a saturazione della coltura o per 3 giorni7.
- Diluire serialmente la coltura satura di G. terrae nel brodo di PYCa e spalmare 100 μL ciascuna delle diluizioni 10−4, 10−5 e 10−6 su piastre PYCa19,20. Conservare in frigorifero la coltura satura non diluita a 4 °C.
- Incubare le piastre di stesura invertite per 3 giorni a 30 °C.
- Dopo l'incubazione, identificare una "piastra numerabile", una piastra con 20-200 colonie. Conta il numero di colonie su quella piastra e calcola le unità formanti colonie per millilitro (ufc/ml)19,20.
- Diluire la coltura satura con brodo PYCa a 4,0 x 106 ufc/mL batteri.
2. Preparazione dei fagi
NOTA: I risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti con il fago Gordonia DelRio21, un batteriofago temperato isolato su G. terrae. Questi metodi sono stati utilizzati con successo anche con altri fagi di Gordonia .
- Iniziando con un batteriofago isolato, diluire serialmente il campione fagico nel tampone fagico7 in una diluizione 1 x 10−8 . Eseguire un test del titolo del fago agar a doppio strato7 infettando 0,3 mL della coltura satura di G. terrae con 10 μL di ciascuna diluizione fagica. Dopo un'incubazione a temperatura ambiente di 5-10 minuti, unire la miscela batterio-fago con 3 ml di agar superiore PYCa e versare sulle piastre di agar PYCa.
- Incubare le piastre invertite a 30 °C per 3 giorni o fino a quando non si formano le placche7.
- Dopo l'incubazione, identificare una "piastra numerabile", una piastra con 20-200 placche. Contare il numero di placche su quella piastra e calcolare le unità che formano la placca per millilitro (pfu / ml)7.
3. Preparazione della micropiastra
NOTA: Per questo metodo devono essere utilizzate micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Tutta la preparazione e il caricamento delle piastre devono essere completati in un armadio di biosicurezza e devono essere utilizzate buone pratiche microbiologiche17.
- Preparare la soluzione di rivestimento antiappannamento combinando 100 μL di Triton-X 100, 40 ml di isopropanolo al 100% e 160 ml di acqua deionizzata22. Mescolare per mescolare e conservare a temperatura ambiente.
- In un armadio di biosicurezza, aggiungere 6 ml di soluzione di rivestimento del coperchio alla superficie interna di un coperchio sterile a 96 pozzetti, tenendo il coperchio per i bordi e ruotandolo per assicurarsi che sia coperto dalla soluzione. Lasciare riposare la soluzione sul coperchio per 20 s, quindi versare la soluzione e capovolgere il coperchio su un tovagliolo di carta autoclavato ad angolo fino a quando il coperchio è completamente asciutto, che in genere richiede 35-45 minuti. Fare attenzione a tenere il coperchio per i bordi.
- Preparare 20 ml di agarosio allo 0,1% in acqua per ogni micropiastra da 96 pozzetti, microonde per sciogliere l'agarosio.
- Una volta che l'agarosio si è raffreddato a 50-60 °C, pipettare 100 μL di agarosio allo 0,1% in tutti gli spazi tra i pozzetti della piastra e 200 μL di agarosio nei pozzetti nella fila A e nella fila H e nella colonna 1, colonna 2, colonna 11 e colonna 1223 (figura 1).
4. Caricamento della piastra con batteri e fagi
NOTA: Tutta la preparazione e il caricamento delle piastre devono essere completati in un armadio di biosicurezza e deve essere utilizzata una buona pratica microbiologica17 .
- La piastra a 96 pozzetti conterrà 75 μL di 2,0 x 106 ufc/mL di batteri in ciascun pozzetto9. Diluire la coltura batterica 4,0 x 10 6 ufc/mL 1:1 con 2x brodo PYCa a 2,0 x 106 ufc/mL. Preparare 5 ml per piastra da 96 pozzetti.
- Diluire il lisato fagico usando il tampone fagico7 per ottenere 1 mL ciascuno di 2,0 x 106 pfu / mL, 2,0 x 105 ufc / ml e 2,0 x 104 ufc / mL concentrazioni. Ciò consentirà una molteplicità di infezioni (MOI) di 1, 0,1 e 0,01 all'interno della micropiastra9.
- Per caricare la micropiastra, prendere una piastra preparata con soluzione antiappannamento e agarosio e pipettare 75 μL dei batteri 2,0 x 106 ufc/mL nelle colonne 3-10, seguendo la Figura 1.
- Alle colonne 3 e 4, aggiungere 75 μL di tampone fagico sterile a ciascun pozzetto per fungere da controllo positivo senza fagi, seguendo la Figura 1, e pipettare su e giù per miscelare dopo ogni aggiunta. Aggiungere 75 μL del fago 2,0 x 10 6 pfu/mL alla colonna 5 e alla colonna6 , 75 μL del fago 2,0 x 105 pfu/ml alla colonna 7 e alla colonna 8 e 75 μL del fago 2,0 x 104 ufc/ml alla colonna 9 e alla colonna 10, pipettando su e giù per mescolare dopo ogni aggiunta.
- Nastro adesivo su entrambi i lati corti della piastra con nastro adesivo da 0,5 pollici per sigillare parzialmente la piastra consentendo lo scambio di gas.
5. Incubazione e misurazione dell'assorbanza
- Una volta che le piastre sono cariche di batteri e fagi, posizionarle su uno scuotitore a micropiastre a 250 giri / min e incubare a 30 ° C.
- Incubare le piastre per 96 h, effettuando una misura di densità ottica a 600 nm su un lettore di micropiastre ogni 8 h a partire dall'ora 16. Riportare le piastre nello shaker tra una misurazione e l'altra.
NOTA: Sono stati valutati periodi di misurazione di 4, h 6 h, 8 h e 12 h, a partire dall'ora 0, ed è stato determinato che un periodo di campionamento di 8 ore a partire da 16 h post-infezione catturava meglio le interazioni Gordonia-fagi. - Monitorare il coperchio per la condensa durante l'esperimento. Se si osserva condensa, sostituire il coperchio con un altro coperchio rivestito secondo il punto 3.2.
- Generare curve di controllo e di crescita infette seguendo la sezione 6 del protocollo.
6. Analisi dei dati
- Utilizzare un programma di fogli di calcolo per calcolare la deviazione media e standard per ogni diluizione fagica, seguendo il layout del foglio di calcolo nel repository GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- Crea curve di controllo e di crescita infetta e calcola le metriche di infezione usando R (vedi la tabella dei materiali) con i pacchetti DescTools 24, dplyr 25, ggplot226 e readxl27 e seguendo lo script R nel repository GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- AUCcon è l'area sotto la curva di controllo non infetta, mentre AUCinf è l'area sotto la curva infetta16. Calcolare l'AUC e quindi calcolare l'inibizione percentuale della crescita in base all'area sotto i valori della curva, PIAUC16, utilizzando la seguente equazione:
(1 - [AUCinf/AUCcon]) × 100 - Le linee orizzontali tratteggiate su ciascuna curva mostrano il picco di crescita, con il picco di crescita non infetto etichettato N asintoto (con) e il picco di crescita infetto etichettato Nasintoto (inf). Identificare i valoriasintotici N e quindi calcolare l'inibizione percentuale della crescita in base a questi valori di crescita di picco, PImax16, utilizzando la seguente equazione:
(1 - [N asintoto(inf)/ Nasintoto(con)]) × 100 - Calcolare l'indice di Stacy-Ceballos, ISC16, dai valori PIAUC e PImax , come segue:
(PIAUC × PImax) 0,5
Calcolare la virulenza relativa integrando l'indice di Stacy-Ceballos nel tempo16.
- AUCcon è l'area sotto la curva di controllo non infetta, mentre AUCinf è l'area sotto la curva infetta16. Calcolare l'AUC e quindi calcolare l'inibizione percentuale della crescita in base all'area sotto i valori della curva, PIAUC16, utilizzando la seguente equazione:
Representative Results
Un esperimento ha successo se la curva di crescita risultante mostra un aumento della popolazione batterica di controllo positivo nel tempo senza improvvisa fluttuazione nell'assorbanza. Esempi di un esperimento di successo in un MOI di 1 con e senza un'infezione fagica produttiva sono mostrati rispettivamente in Figura 2 e Figura 3. Un'infezione produttiva con un MOI di 0,01 è rappresentata nella Figura 4. Il modello di crescita di controllo positivo (curva verde) visto in tutte e tre le figure indica che i batteri stanno crescendo, non si stanno aggregando durante la crescita e non sono presenti contaminanti. L'aggregazione e la contaminazione sono indicate da un'assorbanza insolitamente elevata in un singolo punto temporale. Le deviazioni standard in genere aumentano nel corso di un esperimento; Tuttavia, un drastico aumento o deviazioni standard che si sovrappongono tra le curve di controllo e infette possono indicare contaminazione o aggregazione in uno o più pozzi.
La curva di crescita raffigurante un'infezione fagica produttiva, rappresentata dalla Figura 2, mostra una ridotta assorbanza batterica nel tempo nei pozzetti con l'aggiunta del fago. Questa riduzione della densità batterica non sarà osservata se il batterio è al di fuori dell'intervallo ospite del fago, come mostrato in Figura 3.
Le metriche di infezione sono mostrate per tutti gli esperimenti rappresentativi, con un I SC relativamente grande per le infezioni produttive in Figura 2 e Figura 4 e un ISC molto piccolo in Figura 3 per il fago che non ha infettato in modo efficiente il batterio ospite.
Figura 1: Layout delle micropiastre. Le aree grigie sono riempite con lo 0,1% di agarosio. I pozzetti vuoti nella colonna 3 e nella colonna 4 sono pozzetti di controllo positivi senza fagi contenenti solo tampone fagico e 2,0 x 106 ufc/mL batteri. I pozzetti punteggiati contengono fagi e 2,0 x 106 ufc/mL batteri; i punti grandi nella colonna 5 e nella colonna 6 indicano un MOI di 1 con fago 2,0 x 106 ufc/ml; i punti medi nella colonna 7 e nella colonna 8 indicano un MOI di 0,1 con fago 2,0 x 105 pfu/mL; e i piccoli punti nella colonna 9 e nella colonna 10 indicano un MOI di 0,01 con 2,0 x 104 pfu / mL fago. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Un esperimento di successo sulla curva di crescita con un fago a un MOI di 1 che infetta produttivamente il batterio ospite. I valori medi di assorbanza (± deviazione standard) sono mostrati per i batteri non infetti (verde) e i batteri con il fago aggiunto (blu). Abbreviazioni: AUC = area sotto la curva; PIAUC = inibizione percentuale della crescita calcolata dall'area sotto la curva; Nasintoto = valore di crescita di picco; PImax = inibizione percentuale della crescita calcolata dai valori di crescita di picco; ISC = indice di Stacy-Ceballos. Questo grafico rappresenta il fago temperato di Gordonia DelRio che infetta G. terrae, il batterio su cui è stato isolato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Un esperimento di successo sulla curva di crescita con un fago a un MOI di 1 che non infetta in modo efficiente il batterio ospite. I valori medi di assorbanza (± deviazione standard) sono mostrati per i batteri non infetti (verde) e i batteri con il fago aggiunto (blu). Abbreviazioni: AUC = area sotto la curva; PIAUC = inibizione percentuale della crescita calcolata dall'area sotto la curva; Nasintoto = valore di crescita di picco; PImax = inibizione percentuale della crescita calcolata dai valori di crescita di picco; ISC = indice di Stacy-Ceballos. Questo grafico rappresenta l'infezione da G. rubripertincta da DelRio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Un esperimento di curva di crescita di successo con un fago con un MOI di 0,01. I valori medi di assorbanza (± deviazione standard) sono mostrati per i batteri non infetti (verde) e i batteri con il fago aggiunto (blu). Abbreviazioni: AUC = area sotto la curva; PIAUC = inibizione percentuale della crescita calcolata dall'area sotto la curva; Nasintoto = valore di crescita di picco; PImax = inibizione percentuale della crescita calcolata dai valori di crescita di picco; ISC = indice di Stacy-Ceballos. Questo grafico rappresenta l'infezione da G. terrae da DelRio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Questo metodo di micropiastre basato sulla densità ottica consente di studiare la gamma dell'ospite batteriofago e la dinamica dell'infezione11 e mostra l'utilità dell'indice di Stacy-Ceballos16 come misura della virulenza dei batteriofagi. Mentre questo metodo potrebbe essere utilizzato con qualsiasi sistema batteriofago-ospite, è stato progettato specificamente per adattare i saggi di crescita rapida delle micropiastre 9,10,11 per l'uso con batteri a crescita più lenta come gli actinomiceti. I saggi rapidi a micropiastre non possono essere utilizzati per batteri a crescita lenta senza modifiche per affrontare l'evaporazione e la condensazione del coperchio. Questo metodo descrive queste modifiche necessarie e dimostra, per la prima volta, l'uso dell'indice di Stacy-Ceballos e delle relative metriche16 per descrivere l'infezione da batteriofagi.
L'evaporazione può essere una sfida sostanziale nei saggi della curva di crescita delle piastre a 96 pozzetti a più giorni; Questo metodo risolve il problema aggiungendo agarose ai pozzi di confine e agli spazi tra i pozzi. Il margine di agarosio, combinato con il trattamento antiappannamento22, fornisce l'umidità necessaria all'interno della micropiastra e consente misurazioni affidabili della densità ottica. Senza l'umidità aggiunta, l'evaporazione dell'effetto bordo sostanziale si verifica23 durante il lungo periodo di incubazione richiesto, portando a letture di densità ottica artificialmente elevate. Il trattamento antiappannamento del coperchio è una modifica necessaria perché la condensa del coperchio può anche elevare artificialmente i valori di densità ottica. Agitare le piastre durante il periodo di incubazione è una modifica raccomandata, poiché i batteri actinomicete possono aggregarsi durante la crescita, dando valori di densità ottica artificialmente elevati e riducendo efficacemente la molteplicità dell'infezione.
Il rapporto tra batteri e fagi negli esperimenti che caratterizzano la dinamica dell'infezione è critico, poiché ci deve essere abbastanza fago per mostrare un effetto di infezione, ma non così tanti che la popolazione batterica ospite si schianti immediatamente9 o la frequenza della lisogenia sia drammaticamente aumentata28. In questo metodo, il rapporto trovato più efficace per ottenere risultati coerenti era un MOI di 1, ma risultati utilizzabili sono stati ottenuti anche con MOI di 0,1 e 0,01. Quando si implementa questo metodo, si raccomanda di scegliere una concentrazione di batteri e testare più concentrazioni di fagi nell'intervallo MOI di 0,01-1 9,10,11.
Questa tecnica qui descritta consente di valutare le interazioni batteriofago-ospite per i batteri a crescita lenta in saggi a micropiastre ad alta produttività piuttosto che con sottocampionamento da un pallone di coltura più grande ad ogni intervallo di misurazione29. Inoltre, dimostrando come i saggi di crescita delle micropiastre 9,10,11 possono essere adattati, questa tecnica aumenta l'utilità di altri saggi batteriofagici basati su micropiastre per batteri a crescita lenta, tra cui la caratterizzazione dei fagi 5,6,12 e gli studi di evoluzione 30,31. Infine, questo metodo dimostra l'uso dell'indice di Stacy-Ceballos16 per descrivere l'infezione da batteriofagi. Questa metrica è stata inizialmente sviluppata con i dati di un sistema modello di virus archeal ed è calcolata da valori di densità ottica, dandogli così un'utilità diffusa tra diversi sistemi di virus.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NSF DBI Biology Integration Institute (BII) (premio n. 2119968; PI-Ceballos) e dal programma INBRE dell'Arkansas, con una sovvenzione del National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), P20 GM103429 del National Institutes of Health. Gli autori apprezzano anche il sostegno del Patterson Summer Undergraduate Research Program presso la Ouachita Baptist University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
| Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
| Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
| Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
| Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
| Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
| Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
| Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
| R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
| Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
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