Summary
En optisk tetthetsbasert mikroplatemetode er beskrevet for å kvantifisere langsiktig bakterievekst i nærvær av bakteriofager, egnet for actinomyceter og andre saktevoksende bakterier. Denne metoden inkluderer modifikasjoner for å redusere fordampning og lokkkondensasjon og R-kode for å beregne virusinfeksjonsberegninger, inkludert området under kurven, vekstmaksimum og relativ virulens.
Abstract
Bakteriofager er en viktig del av naturlige miljøer, og de har en kraftig evne til å forme bakteriepopulasjoner. For å forstå hvordan individuelle fager samhandler med langsomt voksende bakterielle verter som actinomycetes, er det nødvendig med en enkel og pålitelig metode for å kvantifisere langsiktig bakterievekst i nærvær av fager. Spektrofotometriske mikroplatelesere tillater gjentatte målinger med høy gjennomstrømning, men inkubering av et lite volum i lengre tid kan by på tekniske utfordringer. Denne prosedyren tilpasser en standard 96-brønns mikroplate for å tillate samdyrking av fager og bakterier uten sub-prøvetaking i 96 timer, med bakterieveksten registrert hver 8. time ved hjelp av spektrofotometriske absorbansverdier. Disse optiske tetthetsverdiene analyseres ved hjelp av R for å gi infeksjonsberegninger, inkludert prosentvis veksthemming, relativ virulens og Stacy-Ceballos-indeksen. Metodene som er skissert her, gir en effektiv måte å gjennomføre og analysere eksperimenter med mikroplatevekstkurve med lengre varighet og inkluderer modifikasjoner for å redusere fordampning og lokkkondensering. Disse protokollene letter mikroplatebaserte analyser av interaksjoner mellom langsomt voksende bakterielle verter og deres bakteriofager.
Introduction
Bakteriofager eller fager er virus som infiserer bakterier. De er de mest tallrike biologiske enhetene på planeten1, og det er generelt akseptert at bakteriofager påvirker bakteriell evolusjon og økosystemprosesser 2,3,4. Det finnes flere metoder for å beskrive, måle og analysere bakteriofagvertsområde 8 og infeksjonsdynamikk5,6, inkludert agarbaserte metoder som dobbeltlags agarmetode7 og optisk tetthetsbaserte mikroplatemetoder8,9,10,11,12. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper. På grunn av deres effektivitet er pletteringstester ved bruk av dobbeltlags agarmetoden "gullstandarden" for vertsområdeanalyser, men denne metoden er tids- og arbeidskrevende9. Raske mikroplatemetoder, som returnerer resulterer i 24 timer eller mindre, gir gode resultater for raskt voksende bakterielle verter som Escherichia coli 9,10,11,12, men er for korte til å vise bakteriofaginfeksjonsprogresjon i langsommere voksende bakterielle verter som actinomycetes7,13,14,15.
En optisk tetthetsbasert mikroplateanalyse designet for raskt voksende bakterier kan ikke kjøres i flere dager som kreves for å karakterisere infeksjonsdynamikk i en sakte voksende vertsbakterie uten at fordampning forekommer og gir kunstig høy bakterietetthet. Dermed krever innhenting av sammenlignbare data med høy gjennomstrømning om bakteriofaginfeksjonsdynamikk for saktevoksende bakteriearter spesialiserte teknikker tilpasset disse bakteriene.
Mikroplatemetoden som presenteres her reduserer fordampning, slik at saktevoksende bakterier kan dyrkes sammen med en i en lengre periode på 96 timer og muliggjør undersøkelser av faginfeksjonsdynamikk og vertsområde. Denne metoden viser også Stacy-Ceballos-indeksen16, en optisk tetthetsbasert beregning som muliggjør virulenssammenligninger mellom forskjellige vertsvirussystemer.
Protocol
Mens denne protokollen er skrevet for Gordonia terrae, har den også blitt brukt med hell for Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta og Gordonia westfalica.
1. Bakterier forberedelse
- I et biosikkerhetsskap, bruk god mikrobiologisk praksis17 for å inokulere en enkelt koloni av Gordonia terrae CAG3 i en 1 l steril forvirret kolbe med 200 ml peptongjærkalsiumbuljong18 (PYCa) inneholdende 0,01 mg / ml cykloheksimid (se materialfortegnelsen).
- Inkuber kolben ved 30 °C med risting ved 250 o / min til kulturen er mettet eller i 3 dager7.
- Serielt fortynne den mettede G. terrae-kulturen i PYCa-buljong, og spre platen 100 μL hver av 10-4, 10-5 og 10-6 fortynningene på PYCa-platene 19,20. Sett den ufortynnede mettede kulturen i kjøleskap ved 4 °C.
- Inkuber spredningsplatene snudd i 3 dager ved 30 °C.
- Etter inkubasjon, identifiser en "tellbar plate", en plate med 20-200 kolonier. Tell antall kolonier på den platen, og beregn kolonidannende enheter per milliliter (cfu / ml) 19,20.
- Fortynn den mettede kulturen med PYCa-buljong til 4,0 x 106 cfu / ml bakterier.
2. forberedelse
MERK: De rapporterte representative resultatene ble oppnådd med Gordonia-fagen DelRio21, en temperert bakteriofag isolert på G. terrae. Disse metodene har også blitt brukt med andre Gordonia-fager .
- Begynn med en isolert bakteriofag, seriell fortynn fagprøven i fagbuffer7 til en 1 x 10-8 fortynning. Utfør en dobbeltlags agarfagtiteranalyse7 ved å infisere 0,3 ml av den mettede G. terrae-kulturen med 10 μL av hver fagfortynning. Etter en 5-10 min romtemperaturinkubasjon, kombiner bakteriefagblandingen med 3 ml PYCa toppagar, og hell på PYCa-agarplater.
- Inkuber platene snudd ved 30 °C i 3 dager eller til plakk dannes7.
- Etter inkubering, identifiser en "tellbar plate", en plate med 20-200 plaketter. Tell antall plakk på platen, og beregn plakkdannende enheter per milliliter (pfu/ml)7.
3. Forberedelse av mikroplate
MERK: Flatbunnede 96-brønns mikroplater (se materialfortegnelsen) bør brukes til denne metoden. All platepreparering og lasting må gjøres i et biosikkerhetsskap, og god mikrobiologisk praksis17skal brukes.
- Forbered anti-dugglokkbeleggløsningen ved å kombinere 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol og 160 ml avionisert vann22. Rør for å blande, og oppbevar ved romtemperatur.
- I et biosikkerhetsskap, legg til 6 ml lokkbeleggløsning på innsiden av et sterilt 96-brønns mikroplatelokk, hold lokket ved kantene og roter det for å sikre at det dekkes av løsningen. La løsningen sitte på lokket i 20 s, hell deretter løsningen av, og snu lokket på et autoklavert papirhåndkle i vinkel til lokket er helt tørt, noe som vanligvis tar 35-45 min. Vær forsiktig med å holde lokket ved kantene.
- Forbered 20 ml 0,1% agarose i vann for hver 96-brønns mikroplate, mikrobølgeovn for å smelte agarose.
- Når agarosen er avkjølt til 50-60 °C, piper 100 μL av 0,1 % agarose inn i alle mellomrommene mellom brønnene på platen og 200 μL agarose inn i brønnene i rad A og rad H og kolonne 1, kolonne 2, kolonne 11 og kolonne 1223 (figur 1).
4. Legge platen med bakterier og
MERK: All plateklargjøring og lasting må gjøres i et biosikkerhetsskap, og god mikrobiologisk praksis17 skal brukes.
- 96-brønnsplaten vil inneholde 75 μL 2,0 x 106 cfu/ml bakterier i hver brønn9. Fortynn 4,0 x 10 6 cfu / ml bakteriekultur 1: 1 med 2x PYCa buljong til 2,0 x 106 cfu / ml. Forbered 5 ml per 96-brønnsplate.
- Fortynn faglysatet med fagbuffer7 for å lage 1 ml hver av 2,0 x 106 pfu / ml, 2,0 x 105 pfu / ml og 2,0 x 104 pfu / ml konsentrasjoner. Dette vil tillate en mangfold av infeksjon (MOI) på 1, 0,1 og 0,01 i mikroplaten9.
- For å legge mikroplaten, ta en plate som ble tilberedt med antiduggløsning og agarose, og pipet 75 μL av 2,0 x 106 cfu / ml bakterier i kolonne 3-10, etter figur 1.
- Til kolonne 3 og kolonne 4, tilsett 75 μL steril fagbuffer til hver brønn for å tjene som en ikke-fagpositiv kontroll, etter figur 1, og pipette opp og ned for å blande etter hver tilsetning. Tilsett 75 μL av fagen på 2,0 x 10 6 pfu/ml til kolonne 5 og kolonne6 , 75 μL av fagen på 2,0 x 105 pfu/ml til kolonne 7 og kolonne 8, og 75 μL av fagen 2,0 x 104 pfu/ml til kolonne 9 og kolonne 10, og pipetter opp og ned for å blande etter hver tilsetning.
- Teip begge kortsidene av platen med 0,5 i merkingstape for delvis å forsegle platen mens du tillater gassutveksling.
5. Inkubasjons- og absorbansmåling
- Når platene er lastet med bakterier og fager, plasser dem på en mikroplate shaker ved 250 o / min, og inkuber ved 30 ° C.
- Inkuber platene i 96 timer, ta en optisk tetthetsmåling ved 600 nm på en mikroplateleser hver 8. time fra time 16. Sett platene tilbake til risteren mellom målingene.
MERK: Måleperioder på 4, h 6 timer, 8 timer og 12 timer ble vurdert, som begynte ved time 0, og det ble bestemt at en 8 timers prøvetakingsperiode som begynte ved 16 timer etter infeksjon best fanget Gordonia-faginteraksjonene. - Overvåk lokket for kondens gjennom hele eksperimentet. Hvis det observeres kondens, skift lokket tilbake med et annet lokk belagt i henhold til trinn 3.2.
- Generer kontroll og infiserte vekstkurver etter protokollseksjon 6.
6. Dataanalyse
- Bruk et regnearkprogram til å beregne gjennomsnittet og standardavviket for hver fagfortynning, ved å følge regnearkoppsettet i Stacy-Ceballos-Index GitHub-depotet (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- Opprett kontroll- og infiserte vekstkurver, og beregn infeksjonsberegninger ved hjelp av R (se materialfortegnelsen) med pakkene DescTools 24, dplyr 25, ggplot226 og readxl 27 og etter R-skriptet i GitHub-repositoriet Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- AUCcon er arealet under den uinfiserte kontrollkurven, mens AUCinf er arealet under smittekurven16. Beregn AUC, og beregn deretter prosentvis veksthemming basert på arealet under kurveverdiene, PIAUC16, ved hjelp av følgende ligning:
(1 - [AUCinf/AUCcon]) × 100 - De stiplede horisontale linjene på hver kurve viser toppveksten, med den uinfiserte veksttoppen merket N asymptote (con) og den infiserte veksttoppen merket Nasymptote (inf). Identifiser Nasymptote-verdiene, og beregn deretter prosentvis veksthemming basert på disse toppvekstverdiene, PImax16, ved hjelp av følgende ligning:
(1 - [N asymptote (inf) / Nasymptote (con)]) × 100 - Beregn Stacy-Ceballos-indeksen,I SC16, fra PIAUC - og PImax-verdiene , som følger:
(PIAUC × PImaks) 0,5
Beregn relativ virulens ved å integrere Stacy-Ceballos-indeksen over tid16.
- AUCcon er arealet under den uinfiserte kontrollkurven, mens AUCinf er arealet under smittekurven16. Beregn AUC, og beregn deretter prosentvis veksthemming basert på arealet under kurveverdiene, PIAUC16, ved hjelp av følgende ligning:
Representative Results
Et eksperiment er vellykket hvis den resulterende vekstkurven viser en økning i den positive kontrollbakteriepopulasjonen over tid uten plutselige svingninger i absorbans. Eksempler på et vellykket eksperiment ved en MOI på 1 med og uten en produktiv faginfeksjon er vist i henholdsvis figur 2 og figur 3. En produktiv infeksjon ved en MOI på 0,01 er representert i figur 4. Det positive kontrollvekstmønsteret (grønn kurve) sett i alle tre figurene indikerer at bakteriene vokser, de klumper seg ikke under vekst, og ingen forurensninger er tilstede. Klumping og forurensning indikeres av uvanlig høy absorbans på et enkelt tidspunkt. Standardavvik øker vanligvis i løpet av et eksperiment; En drastisk økning eller standardavvik som overlapper mellom kontrollkurven og infiserte kurver kan imidlertid indikere forurensning eller klumping i en eller flere brønner.
Vekstkurven som viser en produktiv faginfeksjon, representert ved figur 2, viser redusert bakteriell absorbans over tid i brønner med tilsatt. Denne reduksjonen i bakteriell tetthet vil ikke bli sett hvis bakterien er utenfor fagens vertsområde, som vist i figur 3.
Infeksjonsmål er vist for alle representative eksperimenter, med en relativt stor I SC for produktive infeksjoner i figur 2 og figur 4 og en svært liten ISC i figur 3 for fagen som ikke effektivt infiserte vertsbakterien.
Figur 1: Mikroplateoppsett. De grå områdene er fylt med 0,1% agarose. De blanke brønnene i kolonne 3 og kolonne 4 er fagpositive kontrollbrønner som kun inneholder fagbuffer og 2,0 x 106 cfu/ml bakterier. De stiplede brønnene inneholder og 2,0 x 106 cfu/ml bakterier; de store prikkene i kolonne 5 og kolonne 6 indikerer en MOI på 1 med 2,0 x 106 pfu/ml; de mellomste prikkene i kolonne 7 og kolonne 8 indikerer en MOI på 0,1 med 2,0 x 105 pfu/ml; og de små prikkene i kolonne 9 og kolonne 10 indikerer en MOI på 0,01 med 2,0 x 104 pfu/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et vellykket vekstkurveeksperiment med en ved en MOI på 1 som produktivt infiserer vertsbakterien. De gjennomsnittlige absorbansverdiene (± standardavvik) er vist for uinfiserte bakterier (grønne) og bakterier med fagen tilsatt (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = prosent veksthemming beregnet fra området under kurven; Nasymptote = topp vekstverdi; PImax = prosent veksthemming beregnet fra toppvekstverdiene; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne grafen representerer den tempererte Gordonia-fagen DelRio som infiserer G. terrae, bakterien den ble isolert på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et vellykket vekstkurveeksperiment med en ved en MOI på 1 som ikke effektivt infiserer vertsbakterien. De gjennomsnittlige absorbansverdiene (± standardavvik) er vist for uinfiserte bakterier (grønne) og bakterier med fagen tilsatt (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = prosent veksthemming beregnet fra området under kurven; Nasymptote = topp vekstverdi; PImax = prosent veksthemming beregnet fra toppvekstverdiene; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne grafen representerer G. rubripertincta infeksjon av DelRio. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Et vellykket vekstkurveeksperiment med en ved en MOI på 0,01. De gjennomsnittlige absorbansverdiene (± standardavvik) er vist for uinfiserte bakterier (grønne) og bakterier med fagen tilsatt (blå). Forkortelser: AUC = areal under kurven; PIAUC = prosent veksthemming beregnet fra området under kurven; Nasymptote = topp vekstverdi; PImax = prosent veksthemming beregnet fra toppvekstverdiene; ISC = Stacy-Ceballos indeks. Denne grafen representerer G. terrae infeksjon av DelRio. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne optiske tetthetsbaserte mikroplatemetoden tillater undersøkelse av bakteriofagvertsområde og infeksjonsdynamikk11 og viser nytten av Stacy-Ceballos-indeksen16 som et mål på bakteriofagvirulens. Selv om denne metoden kan brukes med et hvilket som helst bakteriofag-vertssystem, ble den designet spesielt for å tilpasse raske mikroplatevekstanalyser 9,10,11 for bruk med langsommere voksende bakterier som actinomycetes. Raske mikroplateanalyser kan ikke brukes til saktevoksende bakterier uten modifikasjoner for å adressere fordampning og lokkkondensering. Denne metoden beskriver disse nødvendige modifikasjonene og demonstrerer for første gang bruken av Stacy-Ceballos-indeksen og relaterte beregninger16 for å beskrive bakteriofaginfeksjon.
Fordampning kan være en betydelig utfordring i flerdagers 96-brønns platevekstkurveanalyser; Denne metoden løser dette problemet ved å legge agarose til grensebrønnene og mellomrommene mellom brønnene. Agarosemarginen, kombinert med antidugglokkbehandling22, gir den nødvendige fuktigheten i mikroplaten og muliggjør pålitelige optiske tetthetsmålinger. Uten den ekstra fuktigheten oppstår betydelig kanteffektfordampning23 i løpet av den lange inkubasjonsperioden som kreves, noe som fører til kunstig høye optiske tetthetsavlesninger. Antidugglokkbehandlingen er en nødvendig modifikasjon fordi lokkkondensering også kunstig kan heve de optiske tetthetsverdiene. Risting av platene i inkubasjonsperioden er en anbefalt modifikasjon, da actinomycete-bakterier kan klumpe seg under vekst, noe som gir kunstig høye optiske tetthetsverdier og effektivt reduserer infeksjonsmangfoldet.
Forholdet mellom bakterier og i eksperimenter som karakteriserer infeksjonsdynamikk er kritisk, da det må være nok til å vise en infeksjonseffekt, men ikke så mange at vertsbakteriepopulasjonen umiddelbart krasjer9 eller frekvensen av lysogeni økes dramatisk28. I denne metoden var forholdet som ble funnet å være mest effektivt for å oppnå konsistente resultater en MOI på 1, men brukbare resultater ble også oppnådd med MOI på 0,1 og 0,01. Ved implementering av denne metoden anbefales det å velge en konsentrasjon av bakterier og teste flere fagkonsentrasjoner i MOI-området 0,01-1 9,10,11.
Denne teknikken beskrevet her gjør det mulig å vurdere bakteriofag-vert-interaksjoner for langsomt voksende bakterier i mikroplateanalyser med høy gjennomstrømning i stedet for med delprøvetaking fra en større kulturkolbe ved hvert måleintervall29. Videre, ved å demonstrere hvordan mikroplatevekstanalyser 9,10,11 kan tilpasses, øker denne teknikken nytten av andre mikroplatebaserte bakteriofaganalyser for langsommere voksende bakterier, inkludert fagkarakterisering5,6,12 og evolusjonsstudier 30,31. Endelig demonstrerer denne metoden bruken av Stacy-Ceballos-indeksen16 for å beskrive bakteriofaginfeksjon. Denne beregningen ble opprinnelig utviklet med data fra et arkeisk virusmodellsystem og beregnes ut fra optiske tetthetsverdier, noe som gir den utbredt nytte på tvers av forskjellige virussystemer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et NSF DBI Biology Integration Institute (BII) stipend (pris nr. 2119968; PI-Ceballos) og ved Arkansas INBRE-programmet, med tilskudd fra National Institute of General Medical Sciences, (NIGMS), P20 GM103429 fra National Institutes of Health. Forfatterne setter også pris på støtten fra Patterson Summer Undergraduate Research Program ved Ouachita Baptist University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
| Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
| Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
| Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
| Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
| Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
| Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
| Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
| R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
| Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
References
- Mushegian, A. R. Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer. Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).
- Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. Interactions between bacterial and phage communities in natural environments. Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).
- Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. Phage life cycles behind bacterial biodiversity. Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).
- Weitz, J. S., et al.
- Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. High-throughput analysis of growth differences among phage strains. Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).
- Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence. PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).
- Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home (2012).
- Martinez-Soto, C. E., et al. PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods. Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).
- Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach. PLoS One. 14 (5), e0216292 (2019).
- Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence. Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).
- Sørensen, P. E., et al. Classification of in vitro phage-host population growth dynamics. Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).
- Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity. Biochemical Engineering Journal. 161, 107652 (2020).
- Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).
- Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).
- Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro. BMC Research Notes. 12 (1), 519 (2019).
- Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough. Journal of General Virology. 102 (1), 001515 (2021).
- Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).
- Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units (2023).
- Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf (2006).
- Mathes, H. N., et al. Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas. Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323 (2023).
- Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers. PLoS One. 16 (1), 0245205 (2021).
- Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect (2011).
- Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=DescTools (2023).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2023).
- Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2 (2023).
- Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=readxl (2023).
- Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118 (2021).
- Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice. Communications Biology. 5, 48 (2022).
- Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol. Viruses. 11 (3), 241 (2019).
- Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli. PeerJ. 4, e2060 (2013).
