Summary
Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.
Abstract
Oöcyten behoren tot de grootste en meest langlevende cellen in het vrouwelijk lichaam. Ze worden gevormd in de eierstokken tijdens de embryonale ontwikkeling en blijven gestopt in de profase van meiose I. De rusttoestand kan jaren duren totdat de eicellen een stimulans krijgen om te groeien en de competentie te krijgen om meiose te hervatten. Deze langdurige staat van arrestatie maakt hen uiterst vatbaar voor het accumuleren van DNA-schadelijke beledigingen, die de genetische integriteit van de vrouwelijke gameten en dus de genetische integriteit van het toekomstige embryo aantasten.
Daarom is de ontwikkeling van een nauwkeurige methode om DNA-schade op te sporen, die de eerste stap is voor het opzetten van DNA-schaderesponsmechanismen, van vitaal belang. Dit artikel beschrijft een gemeenschappelijk protocol om de aanwezigheid en voortgang van DNA-schade in profase-arrested eicellen gedurende een periode van 20 uur te testen. In het bijzonder ontleden we de eierstokken van muizen, halen we de cumulus-eicelcomplexen (COC's) op, verwijderen we de cumuluscellen uit de COC's en kweken we de eicellen in Μ2-medium dat 3-isobutyl-1-methylxanthine bevat om de staat van arrestatie te behouden. Daarna worden de eicellen behandeld met het cytotoxische, antineoplasmatische geneesmiddel, etoposide, om dubbelstrengsbreuken (DSB's) te veroorzaken.
Door immunofluorescentie en confocale microscopie te gebruiken, detecteren en kwantificeren we de niveaus van het kerneiwit γH2AX, de gefosforyleerde vorm van de histon H2AX. H2AX wordt gefosforyleerd op de plaatsen van DSB's na DNA-schade. Het onvermogen om de DNA-integriteit te herstellen na DNA-schade in eicellen kan leiden tot onvruchtbaarheid, geboorteafwijkingen en verhoogde percentages spontane abortussen. Daarom zijn het begrijpen van DNA-schaderesponsmechanismen en tegelijkertijd het vaststellen van een intacte methode voor het bestuderen van deze mechanismen essentieel voor reproductief biologisch onderzoek.
Introduction
Het proces van meiose in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren wordt vóór de geboorte in de eierstokken geïnitieerd. Het totale aantal eicellen wordt voornamelijk tijdens de embryogenese in de eierstokken vastgesteld. Eicellen komen in meiose en blijven bij fase I1 achter. Na het begin van de puberteit en de productie en endocriene werking van follikelstimulerend hormoon (FSH) en luteïniserend hormoon (LH), kunnen eicellen opnieuw beginnen en meiose voltooien2. Bij mensen kan profasestilstand tot 50 jaar duren3. De celdelingen na het intreden in meiose I zijn asymmetrisch, wat resulteert in de productie van een klein polair lichaam en een eicel die zijn grootte behoudt. De meeste cytoplasmatische componenten worden dus opgeslagen in het oöplasma tijdens vroege embryogenese4. Vervolgens komen de eicellen in meiose II, zonder hun kern te hervormen of hun chromosomen te decondenseren, en blijven ze in metafase II tot bevruchting5 tegenhouden.
Een uniek kenmerk dat eicellen onderscheidt van somatische cellen is de staat van stilstand in profase I, wanneer de eicel een intacte kern bezit (kiemblaasje [GV] arrestatie), aangeduid als de GV stadium6. Op basis van de chromatine-organisatie worden GV-stadium eicellen ingedeeld in twee categorieën: niet-omringde nucleolus (NSN) en omgeven nucleolus (SN)7,8. In NSN GV-stadium eicellen verspreidt het chromatine zich door het hele nucleaire gebied en is transcriptie actief, terwijl in SN-eicellen het chromatine een compacte ring vormt die de nucleolus omringt en transcriptie stil is9. Beide typen GV-stadium eicellen vertonen meiotische competentie; ze komen met dezelfde snelheid in meiose, maar de NSN-eicellen vertonen een lage ontwikkelingscapaciteit en kunnen zich niet verder ontwikkelen dan het tweecellige stadium embryo10.
De langdurige toestand van profase I-arrestatie verhoogt de incidentie van DNA-schadeaccumulatie11. Daarom zijn DNA-schaderesponsmechanismen in eicellen essentieel om de productie van gameten met genetische integriteit mogelijk te maken en om ervoor te zorgen dat het resulterende embryo een fysiologische chromosomale inhoud heeft.
Een centraal aspect van de DNA-schaderespons is DNA-reparatie. De belangrijkste routes voor DSB-reparatie in eukaryote cellen omvatten niet-homologe eindverbinding (NHEJ), homologe recombinatie (HR) en alternatieve NHEJ12,13,14,15. NHEJ is een sneller maar foutgevoeliger mechanisme, terwijl HR meer tijd nodig heeft om te worden voltooid, maar een hoge betrouwbaarheidheeft 16.
Er is te weinig kennis over de mechanismen die eicellen gebruiken voor DNA-schadeherstel. Studies hebben aangetoond dat DNA-schade geïnduceerd in volgroeide eicellen van zoogdieren door het gebruik van genotoxische middelen, zoals etoposide, doxorubicine of UVB- of ioniserende straling, geen invloed heeft op de timing en snelheid van exit uit profase I-arrestatie17. Eicellen kunnen GV-afbraak (GVBD) ondergaan, zelfs in de aanwezigheid van verhoogde niveaus van schade. Deze schade kan worden vastgesteld door de waarneming van γH2AX. Deze gefosforyleerde vorm van H2AX (γΗ2ΑΧ) is een DSB-marker, die zich op de plaats van breuken bevindt en fungeert als een steiger om reparatiefactoren en eiwitten te helpen accumuleren aan gebroken uiteinden18.
De afwezigheid van celcyclusstilstand na DNA-schade is te wijten aan een onvoldoende DNA-schadecontrolepunt waardoor eicellen met niet-hersteld DNA opnieuw meiose kunnen binnendringen. Na hoge niveaus van DNA-schade kan een controlepunt profasestilstand handhaven door de activering van een ATM / Chk1-afhankelijke route. De beperkte checkpointrespons op DSB's is te wijten aan de beperkte activering van ATM17,19. In de M-fase van meiose I heeft onderzoek aangetoond dat DNA-schade een spindelassemblagecontrolepunt (SAC) -geïnduceerd meiose I-controlepunt kan activeren, dat de activering van het E3 ubiquitine-ligase-anafasebevorderend complex / cyclosoom (APC / C) en dus M-fase-exit voorkomt. Bovendien overwint de ablatie van SAC-eiwitten de toestand van M-fasestop, wat het belang van de SAC bij de vaststelling van de meiose I chekpoint20 onderstreept.
Zoals eerder onderzoek duidelijk aantoont, kunnen DSB's geen robuust profasecontrolepunt in de eicellen van muizen induceren. Als dergelijke schade niet wordt hersteld, kan dit leiden tot embryo's die chromosomale afwijkingen dragen. Daarom is het belangrijk om de DNA-schaderespons in verschillende stadia van vrouwelijke gametogenese te bestuderen om de unieke paden die eicellen gebruiken om met potentiële genetische beledigingen om te gaan, beter te begrijpen.
Protocol
Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten (regio Ioannina, Griekenland) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen 2010/63/EU van de Raad van de Europese Gemeenschappen. Er werd geëxperimenteerd met betrekking tot de principes van de 3V's. Alle CD-1-muizen die voor de experimenten werden gebruikt, werden bewaard in de stallenfaciliteit van de Universiteit van Ioannina, Griekenland, in een kamer met gecontroleerde temperatuur (22 ° C) en vochtigheid (60%) en werden ad libitum gevoerd. Het dierenhuis heeft een vergunning voor het exploiteren van een faciliteit voor fokkerij (EL33-BIObr01), levering (EL33-BIOsup01) en experimenten (EL33BIO-exp01).
1. Bereiding van reagentia
- Verdun 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) poeder (zie de materiaaltabel) in dimethylsulfoxide (DMSO) (zie de materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 200 mM. Μake 10 μL aliquots, en bewaren bij −20 °C. Gebruik de oplossing binnen 1 maand.
OPMERKING: IBMX poeder wordt bewaard bij −20 °C. - Bereid alle immunofluorescentiebuffers voor en bewaar ze bij 4 °C.
- Bereid steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door één PBS-tablet (zie de tabel met materialen) te verdunnen in 200 ml ddH2Ο.
- Maak PHEM-buffer door 80 ml ddH 2 Ο, 0,59575 g HEPES, 1,81422 g PIPES, 0,38035 g EGTA en 0,04066 g MgCl2(zie de materiaaltabel) toe te voegen terwijl u roert met een magnetische roerder (zie de materiaaltabel) en voeg tegelijkertijd NaOH toe (zie de materiaaltabel) totdat de pH 6,9 bereikt (controleer met een pH/ORP-meter [zie de materiaaltabel]). Voeg vervolgens ddH2Ο toe aan een eindvolume van 100 ml.
- Bereid paraformaldehyde-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) buffer door PFA-poeder (zie de materiaaltabel) in PHEM-buffer te verdunnen terwijl u met een magneetroerder onder verhitting roert bij een eindconcentratie van 4% PFA. Filter vervolgens de buffer met een spuit en een filter van 0,2 μm (zie de materiaaltabel) en voeg 0,5% Tx-100 toe (zie de materiaaltabel). Bereid ongeveer 10 ml PFA-Tx-100 (0,4 g PFA, 50 μL Tx-100), wat voldoende is voor één experiment. Bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
LET OP: Draag handschoenen om PFA te hanteren en vermijd contact met huid en ogen. - Bereid de wasbuffer voor door runderserumalbumine (eindconcentratie: 0,5% m/v BSA) (zie de materiaaltabel) in PBS toe te voegen en mechanisch te roeren. Voeg 10% w/v NaN3-buffer (natriumazide) toe bij een verdunning van 1:1.000 om het risico op schimmel- en bacteriële besmetting te minimaliseren. Maak een 10% w/v NaN 3-buffer door 1 g NaN3-poeder (zie de materiaaltabel) toe te voegen aan 10 ml ddH 2 O; bewaar de NaN3-buffer bij kamertemperatuur.
- Bereid de blokkeringsbuffer voor door BSA (eindconcentratie: 3% w/v) toe te voegen aan PBS en mechanisch te roeren. Voeg 10% NaN3-buffer toe bij een verdunning van 1:1.000.
2. Verzameling van GV-eicellen uit ontlede eierstokken en inductie van DSB's
OPMERKING: Alle gereedschappen en oplossingen moeten steriel zijn. Het hanteren van eicellen wordt uitgevoerd met behulp van een mondpipet onder een stereomicroscoop (zie de tabel met materialen) en alle druppels zijn bedekt met minerale olie (zie de tabel met materialen en figuur 1E).
- Injecteer muizen intraperitoneaal met 7 internationale eenheden (IE) van drachtige merrie's serumgonadotrofine (PMSG) (zie de tabel met materialen) 46-48 uur voordat de muizen worden geruimd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Alle gebruikte muizen moeten 8-12 weken oud zijn. - Filter M2 kweekmedium (zie de materiaaltabel) met een spuit en een filter van 0,2 μm en voeg IBMX 200 mM toe aan een eindconcentratie van 200 μM in een 14 ml buis met ronde bodem (zie de materiaaltabel) om de eicellen te stoppen bij profase I. Bereid vervolgens druppels M2-IBMX-medium in een plastic weefselkweekschaal (zie de materiaaltabel) en plaats deze op een heet blok (zie de materiaaltabel) bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten vóór de isolatie van de eicel. Bewaar de M2 bij 4 °C.
- Offer de muizen op door cervicale dislocatie, ontleed de eierstokken en plaats ze in een buis met ronde bodem van 5 ml (zie de materiaaltabel) met M2-IBMX.
- Breng de eierstokken over naar een plastic deksel met 1,5 ml M2-IBMX, verwijder peri-ovarieel vetweefsel of eileidersegmenten en geef de COC's vrij door mechanische perforatie van de eierstokken met een naald van 27 G (zie de materiaaltabel en figuur 1A-C).
- Breng de COC's over in een kweekschaal met druppels M2-IBMX (elk ongeveer 25-30 μL) en verwijder de cumuluscellen door herhaaldelijk pipetteren met behulp van een glazen Pasteurpipet met smalle boring (zie de materiaaltabel en figuur 1D).
- Selecteer SN GV-stadium eicellen en breng ze over in een druppel (25 μL) M2-IBMX-medium op een heet blok bij 37 °C beschermd tegen licht (figuur 1F).
- Zoek naar SN-eicellen op basis van hun grotere omvang en centraal geplaatste kernen in tegenstelling tot NSN-eicellen, waarin de kernen perifeer21 zijn geplaatst. Observeer in ieder geval de DNA-configuratie onder een confocale microscoop voordat u de definitieve beslissing neemt over het type GV-eicel (SN of NSN).
- Induceer DSB's met behulp van etoposide (zie de tabel met materialen). Plaats de GV-fase eicellen in druppels (elk 25 μL) van het genotoxische middel gedurende 1 uur op het hete blok bij 37 °C in donkere omstandigheden.
OPMERKING: Etoposide is een topoisomerase II-remmer die DSB's introduceert in het DNA22. Bewaar de etoposide in 10 μL aliquots van 20 mg/ml bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. De geteste concentraties zijn 5 μg/ml, 20 μg/ml en 50 μg/ml. - Om de GV-stadium eicellen langdurig te stoppen, plaatst u de eicellen in druppels M16-kweekmedium (zie de materiaaltabel) aangevuld met 400 μM IBMX in een incubator (zie de materiaaltabel) bij 37 °C en 5% CO2. Bewaar de M16 bij 4 °C, filtreer het medium met een spuit en een filter van 0,2 μm en incubeer het gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
Figuur 1: Oöcytenisolatieproces . (A) Verwijdering van peri-ovarieel vetweefsel en overgebleven eileidersegmenten uit eierstokken in M2-medium met IBMX. Foto verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 1 mm. (B) Geïsoleerde eierstokken in M2 medium met IBMX. Beeld verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 1 mm. (C) Mechanische perforatie van eierstokken met behulp van een naald van 27 G in M2-medium met IBMX. Beeld verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 1 mm. (D) COC's die vrijkomen uit eierstokken na perforatie in M2-medium met IBMX. Beeld verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 100 μm. (E) Eicelverzameling met behulp van een mondpipet. F) Gedenudeerde eicellen, na verwijdering van de omringende cumuluscellen, in M2-medium met IBMX. Beeld verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Fixatie van eicellen en immunofluorescentie
OPMERKING: Het hanteren van eicellen wordt uitgevoerd met behulp van een mondpipet onder een stereomicroscoop en alle druppels zijn bedekt met minerale olie.
- Plaats de controle- en met etoposide behandelde GV-eicellen gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur in verschillende plastic weefselkweekschalen met PFA-Tx-100-buffer.
- Was de eicellen in drie verschillende druppels wasbuffer (elk 50 μL) op kamertemperatuur. Laat de eicellen 5 minuten in elke druppel zitten.
- Plaats de eicellen in druppels blokkerende buffer (elk 25 μL) gedurende 1 uur op een heet blok bij 37 °C.
- Bereid het primaire antilichaam voor dat γH2AX (konijnenfosfo-Η2ΑΧ) (Ser139) herkent (zie de materiaaltabel) (stockoplossing: 1 mg/ml). Gebruik een verdunning van 1:200 in de blokkeringsbuffer en plaats de eicellen gedurende een nacht in druppels primair antilichaam (elk 15 μl) bij 4 °C.
OPMERKING: Fosfo-Η2ΑΧ (γH2AX) is een veel voorkomende marker voor het detecteren van DSB's in zowel somatische cellen als GV-eicellen18,23. - Was de volgende dag de eicellen in drie verschillende druppels wasbuffer (elk 50 μL) op kamertemperatuur. Laat de eicellen 5 minuten in elke druppel zitten.
- Bereid het secundaire antilichaam, Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenantikonijn (zie de tabel met materialen) (stockoplossing: 2 mg / ml). Gebruik een verdunning van 1:200 in de blokkeringsbuffer en plaats de eicellen gedurende 1 uur in druppels secundair antilichaam (elk 15 μL) op een heet blok bij 37 °C beschermd tegen licht.
- Breng de eicellen over in druppels DRAQ7 (elk 25 μL) (stockoplossing: 0,3 mM; zie de tabel met materialen), een verrode fluorescerende DNA-kleurstof die alleen DNA kleurt in gepermeabiliseerde cellen. Gebruik een verdunning van 1:250 in de wasbuffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in donkere omstandigheden.
- Was de eicellen in drie verschillende druppels wasbuffer (elk 50 μL) op kamertemperatuur. Laat ze 5 minuten in elke druppel zitten en breng ze vervolgens over in kleine druppels (ongeveer 5 μL elk) wasbuffer in een petrischaal met glazen bodem van 35 mm (zie de materiaaltabel) voor confocale microscopie (figuur 2A).
OPMERKING: Het wassen van zowel de DNA-kleuring als het secundaire antilichaam wordt tegelijkertijd uitgevoerd.
4. Confocale microscopie
OPMERKING: Confocale microscopie moet onmiddellijk worden uitgevoerd om de vermindering van de fluorescentie-intensiteit na de plaatsing van de eicellen in glazen bodemschalen te voorkomen. Toegang tot een confocale microscoop (zie de tabel met materialen) met een gemotoriseerd podium is vereist.
- Microscoop opstelling
- Schakel in het confocale systeem de lasercontroller, de lasers, de microscoopcontroller, de lampen voor het doorgelaten licht en de pc in (figuur 2B, D).
- Open de confocale software en kies de 40x olielens.
- Plaats de schaal in de monsterhouder en probeer te focussen op de eicellen door het podium op XY- en Z-assen te bewegen met behulp van de joystick (figuur 2C).
- Scannen van de eicellen
- Stel het laservermogen, de versterking en de pinhole-grootte onafhankelijk in voor elk experiment om eventuele verzadiging te minimaliseren.
- Stel voor elke eicel het interessegebied in, met name in de kern bij het DNA-gebied. Definieer de randen van het DNA-gebied en pas de z-stapgrootte aan naar 3 μm. Start vervolgens het scannen.
- Sla de afbeeldingen voor elke cel op in de geselecteerde map.
- Wanneer het scannen is voltooid, sluit u de software af, schakelt u de computer uit en schakelt u de lasercontroller, de lasers, de microscoopcontroller en de lampen voor het doorgelaten licht uit.
Figuur 2: Confocale microscopie . (A) Vaste eicellen na het uitvoeren van het immunofluorescentieprotocol en DNA-kleuring, die zich in afzonderlijke druppels wasbuffer bevinden, bedekt met minerale olie, in een schaal met glazen bodem worden geplaatst en worden bereid voor confocale microscopiebeeldvorming. Elke druppel bevat een andere experimentele categorie. Beeld verkregen door de stereo microscoop oculairs. Schaalbalk = 1 mm/100 μm voor het ingezoomde gedeelte. (B) Glasbodemplaat geplaatst op het confocale microscoopstadium. (C) Brightfield-beeld van eicellen verkregen door middel van confocale microscopie. Schaalbalk = 100 μm. (D) Het confocale microscopiesysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Beeldvormende analyse
- Download Fiji ImageJ-win64 in de browser (https://imagej.net/software/fiji/downloads), open het en importeer de gegevens als TIFF-stapelbestanden.
OPMERKING: Open elk eicelbestand afzonderlijk. - Klik op afbeelding | Kleur | Splits kanalen om alle kanalen te splitsen.
- Klik op LUT (Look up Table) en kies de voorkeurskleuren voor elk kanaal.
- Klik op afbeelding | Kleur | Voeg kanalen samen om de kanalen voor γΗ2ΑΧ en DNA samen te voegen. Laat het brightfield-kanaal niet samengevoegd.
- In NSN-eicellen en in SN-eicellen met lage niveaus van DNA-schade wordt γΗ2ΑΧ gedetecteerd als foci in het DNA-gebied. Klik in dit geval op het commando " Multi-point" of point en selecteer elke γΗ2ΑΧ-focus die samenvalt met het DNA. Herhaal deze stap voor alle stapels.
- In SN-eicellen met hoge niveaus van DNA-schade wordt het γΗ2ΑΧ-signaal over het hele DNA-gebied verdeeld. Klik in dit geval op Afbeelding | Stapels | Z-project en selecteer met de opdracht Selecties uit de vrije hand het hele DNA-gebied.
- Om de γΗ2ΑΧ fluorescentie te meten, klikt u op Analyseren | Meet en kopieer de metingen naar een .xlsx bestand. Bereken vervolgens de gemiddelde fluorescentie, normaliseer de waarden en tel het aantal foci voordat u grafieken maakt.
- Klik op Analyseren | Schaal instellen om de schaal in te stellen en vervolgens op Analyseren | Hulpmiddelen | Schaalbalk om een schaalbalk aan de kanalen toe te voegen.
Representative Results
Met behulp van de hier gedemonstreerde procedure werden de eierstokken van muizen ontleed, het vet werd verwijderd en volgroeide GV-stadium eicellen werden verzameld. Vervolgens werden de cumuluscellen verwijderd door herhaaldelijk pipetteren met behulp van een smalle pipet en werden ze in verse druppels M2-IBMX-medium geplaatst en bedekt met minerale olie op een heet blok (37 °C) (figuur 1A-F). Drie verschillende etoposideconcentraties werden bereid (5 μg / ml, 20 μg / ml en 50 μg / ml) met behulp van een voorraadetoposideconcentratie van 20 mg / ml. De GV-stadium eicellen werden gedurende 1 uur in drie verschillende etoposideconcentraties geplaatst in druppels bedekt met minerale olie en beschermd tegen licht bij 37 °C. Vervolgens werd het immunofluorescentieprotocol gevolgd, zoals in detail beschreven in het protocolgedeelte, en werden de eicellen in glazen bodemschalen geplaatst en geobserveerd door confocale microscopie (figuur 2).
In de neocyten van het SN GV-stadium, onmiddellijk na DNA-schade, nam de aanwezigheid van γH2AX toe bij alle etoposideconcentraties (5 μg / ml, 20 μg / ml en 50 μg / ml), en de γH2AX werd verdeeld over het hele DNA-gebied (figuur 3). DSB-kwantificering en -schatting werden uitgevoerd door de γH2AX-fluorescentie-intensiteit op DNA-locaties te observeren. De γH2AX-fluorescentie nam proportioneel toe met toenemende etoposideconcentraties. Bovendien vertoonden de eicellen in het GV-stadium na langdurige profasestilstand (20 uur na behandeling met etoposide) het vermogen om het aantal γH2AX-foci en de intensiteit te verminderen, wat de aanwezigheid van actieve reparatieprocessen in de GV-stadium-gearresteerde eicellen impliceert (figuur 3E).
In tegenstelling tot de SN-eicellen, waarin de γH2AX-fluorescentie door het DNA werd verdeeld, werd in de NSN-eicellen γH2AX onmiddellijk na behandeling met etoposide bij 20 μg / ml in foci getoond. We schatten het aantal foci dat samenviel met het DNA-gebied, berekenden de fluorescentie van elke focus en presenteerden de gemiddelde fluorescentie van alle eicellen. Zowel de fluorescentie als het aantal foci vertoonden statistisch significante verschillen tussen de twee eicelcategorieën (figuur 4).
Confocale microscopie biedt informatie over het aantal en de intensiteit van foci in verschillende Z-stacks, waardoor de aanwezigheid van DNA-schade en de reparatiedynamiek op verschillende tijdstippen worden geïdentificeerd. Galvano-scanning biedt precisiescanning met een lage achtergrond en een betere analyse van de scanbeelden.
Figuur 3: Reductie van γH2AX in SN GV-stadium eicellen behandeld met drie verschillende etoposideconcentraties na langdurige GV-arrestatie. (A) γH2AX-fluorescentie in SN GV-stadium eicellen 0 h na behandeling met etoposide. De γH2AX neemt onmiddellijk na blootstelling toe bij alle etoposideconcentraties en de toename is concentratieafhankelijk (groen: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). De beelden zijn Z-stack projecties, en de helderheid / contrast zijn aangepast voor elk kanaal met behulp van Fiji / ImageJ. Schaalbalk = 10 μm. (B) Grafiek van de γH2AX-fluorescentie in SN GV-stadium eicellen 0 h na behandeling met verschillende etoposideconcentraties. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één eicel (het aantal eicellen wordt weergegeven in de grafiek), (ns = niet-significant, ** p < 0,005, **** p < 0,0001 , eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest). (C) γH2AX-fluorescentie in SN GV-stadium eicellen 20 h na behandeling met etoposide. γH2AX vermindert 20 uur na blootstelling bij alle etoposideconcentraties (groen: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). De afbeeldingen zijn Z-stack projecties en de helderheid / contrast is aangepast voor elk kanaal met behulp van Fiji / ImageJ. Schaalbalk = 10 μm. (D) Grafiek van de γH2AX-fluorescentie in SN GV-stadium eicellen 20 h na behandeling met verschillende etoposideconcentraties. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één eicel (het aantal eicellen wordt weergegeven in de grafiek), (ns = niet-significant, * p < 0,05 , ** p < 0,005, *** p < 0,0005, **** p < 0,0001, eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest). (E) Staafdiagram van de γH2AX fluorescentiereductie in SN GV-stadium eicellen na profasestilstand in met etoposiden behandelde eicellen. Het getal boven elke kolom geeft de procentuele daling van de γH2AX-fluorescentie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fosforylering van Η2ΑΧ in NSN GV-stadium eicellen na behandeling met etoposide bij 20 μg/ml. (A) Representatieve confocale beelden van één controle NSN GV-stadium eicel (groen: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). De afbeeldingen zijn Z-stack projecties en de helderheid / contrast is aangepast voor elk kanaal met behulp van Fiji / ImageJ. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve confocale beelden van één met etoposiden behandelde NSN GV-stadium eicel (groen: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). De eicellen werden 0 h na behandeling met etoposide gefixeerd. De afbeeldingen zijn Z-stack projecties en de helderheid/contrast is aangepast voor elk kanaal met behulp van Fiji/ImageJ. Schaalbalk = 10 μm. (C) De genormaliseerde γΗ2ΑΧ-fluorescentie in NSN GV-stadium oöcyten na behandeling met 20 μg/ml etoposide. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één eicel (het aantal eicellen wordt weergegeven in de grafiek), genomen uit twee onafhankelijke experimenten (**** p < 0,0001, ongepaarde niet-parametrische t-test, Mann-Whitney U-test). (D) Aantal γΗ2ΑΧ-foci in NSN GV-stadium eicellen na behandeling met 20 μg/ml etoposide. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één eicel (het aantal eicellen wordt weergegeven in de grafiek), genomen uit twee onafhankelijke experimenten (**** p < 0,0001, ongepaarde niet-parametrische t-test, Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Door de hier beschreven methode te gebruiken, detecteerden we DSB's in eicellen van zoogdieren. Deze methode maakt de detectie en studie van het DNA-reparatieproces in eicellen mogelijk. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor het analyseren van andere eiwitten die deelnemen aan fysiologische processen in eicellen van zoogdieren. Het is belangrijk om te bestuderen hoe eicellen reageren op potentiële DNA-schade om de oorzaak van vrouwelijke subfertiliteit bij mensen beter te begrijpen.
Het bestuderen van de DNA-schaderespons in eicellen van zoogdieren kan een uitdaging zijn vanwege de gevoeligheid van eicellen. Het hanteren van eicellen vereist specifieke temperaturen en CO 2- en O2-concentraties. Tegelijkertijd moeten de eicellen worden beschermd tegen licht. De behandeling moet worden uitgevoerd met behulp van glazen pipetten die niet toο smal zijn, omdat dit schadelijk kan zijn voor de eicellen, maar ook niet tot oxidiebreed, omdat dit de verdunning van het medium kan veroorzaken en dus de fixatieprocedure negatief kan beïnvloeden. In elke stap van fixatie worden verschillende druppels buffers gebruikt om het verdunningseffect te minimaliseren. Een alternatieve manier om DSB's waar te nemen is de Komeettest24. Hoewel deze techniek gevoeliger is, is het ingewikkelder. Tegelijkertijd is het met behulp van de komeettest niet mogelijk om het exacte DNA-gebied te detecteren waar de schade optreedt, en in cellen met overvloedige RNA-moleculen, zoals GV-stadium eicellen25, kan de achtergrond worden verhoogd, wat leidt tot een vals DNA-schadesignaal26.
Door het hier beschreven immunofluorescentieprotocol te gebruiken, kunnen we DSB's nauwkeurig detecteren en de reparatievoortgang in GV-stadium eicellen schatten, zoals aangegeven door de vermindering van γH2AX-fluorescentie in de loop van de tijd. Niettemin is een beperking van deze methode dat bepaalde antilichamen een niet-specifieke verdeling door het oöplasma kunnen vertonen, wat leidt tot afbeeldingen met hoge achtergrondfluorescentie. De PFA-Tx-100-buffer wordt gebruikt in plaats van sequentiële PFA en Tx-100, omdat we hebben waargenomen dat het het fixatieproces verbetert door de detectie van minder achtergrond- en niet-specifieke fluorescentie mogelijk te maken. Een tweede beperking van het gebruik van γH2AX voor DSB-detectie is dat schade na GVBD niet kan worden geschat vanwege de spontane fosforylering van γH2AX in meiose23.
In dit immunofluorescentieprotocol blijven de eicellen in een vloeistofbuffer en kunnen ze niet worden opgeslagen in dia's. Dit feit maakt het moeilijk om de vaste cellen dagen na de toevoeging van het secundaire antilichaam te behouden. Om beelden van goede kwaliteit te verkrijgen en geen signaal te verliezen, verdient het de voorkeur om de beeldvorming binnen enkele uren na de toevoeging van het secundaire antilichaam uit te voeren. Er moet ook worden opgemerkt dat het scannen van de kernen door de Z-as het signaal zwakker kan maken als gevolg van overbelichting. Om die reden verdient het de voorkeur om het laservermogen te verlagen en de snelheid van het scannen te verhogen.
Ten slotte is een andere beperking van het immunofluorescentieprotocol dat het alleen kan worden gebruikt voor vaste / niet-levende cellen. Daarom kunnen we alleen de aan- en afwezigheid van factoren op specifieke tijdstippen schatten zonder te weten of er fluctuaties zijn in hun concentratie of veranderingen in hun gedrag door de tijd heen. Dit probleem kan worden ondervangen door gebruik te maken van live-cell imaging en fluorescerend gelabelde markers.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We erkennen de steun voor dit werk van het project "Oprichting van 'capaciteitsopbouwende' infrastructuren in biomedisch onderzoek (BIOMED-20)" (MIS 5047236), dat wordt uitgevoerd in het kader van de actie "Versterking van de onderzoeks- en innovatie-infrastructuur", gefinancierd door het operationele programma "Concurrentievermogen, ondernemerschap en innovatie" (NSRF 2014-2020), en medegefinancierd door Griekenland en de Europese Unie (Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G.
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. , 202-212 (2021).
