Summary
Opprettholde oocytgenomintegritet er nødvendig for å sikre den genetiske troskapen i det resulterende embryoet. Her presenterer vi en nøyaktig protokoll for å oppdage DNA-dobbeltstrengbrudd i pattedyrs kvinnelige kjønnsceller.
Abstract
Oocytter er blant de største og mest langlivede cellene i kvinnekroppen. De dannes i eggstokkene under embryonisk utvikling og forblir arrestert ved profasen av meiose I. Hviletilstanden kan vare i mange år til oocyttene får et stimulus til å vokse og få kompetanse til å gjenoppta meiose. Denne langvarige tilstanden av arrestasjon gjør dem ekstremt utsatt for akkumulerende DNA-skadelige fornærmelser, som påvirker den genetiske integriteten til de kvinnelige gameter og dermed den genetiske integriteten til det fremtidige embryoet.
Følgelig er utviklingen av en nøyaktig metode for å oppdage DNA-skade, som er det første trinnet for etablering av DNA-skaderesponsmekanismer, av avgjørende betydning. Dette papiret beskriver en felles protokoll for å teste tilstedeværelsen og fremdriften av DNA-skade i profasearresterte oocytter i løpet av en periode på 20 timer. Spesielt dissekerer vi museeggstokkene, henter cumulus-oocytkompleksene (COC), fjerner cumuluscellene fra COC-ene og dyrker oocyttene i Μ2-medium som inneholder 3-isobutyl-1-metylxanthin for å opprettholde arrestasjonstilstanden. Deretter behandles oocyttene med det cytotoksiske, antineoplasmatiske medikamentet, etoposid, for å skape dobbeltstrengbrudd (DSB).
Ved å bruke immunfluorescens og konfokal mikroskopi, oppdager og kvantifiserer vi nivåene av kjerneproteinet γH2AX, som er den fosforylerte formen av histonen H2AX. H2AX blir fosforylert på DSBs lokaliteter etter DNA-skade. Manglende evne til å gjenopprette DNA-integritet etter DNA-skade i oocytter kan føre til infertilitet, fødselsskader og økte frekvenser av spontane aborter. Derfor er forståelsen av DNA-skaderesponsmekanismer og samtidig etableringen av en intakt metode for å studere disse mekanismene avgjørende for reproduktiv biologisk forskning.
Introduction
Prosessen med meiose i pattedyrs kvinnelige kjønnsceller initieres i eggstokkene før fødselen. Det totale antall oocytter er etablert i eggstokkene primært under embryogenese. Oocytter går inn i meiose og forblir arrestert ved profase I1. Etter utbruddet av puberteten og produksjon og endokrin virkning av follikkelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH), kan oocytter gjenoppta og fullføre meiose2. Hos mennesker kan profasearrest vare i opptil 50 år3. Celledelingene etter inntreden i meiose I er asymmetriske, noe som resulterer i produksjon av en liten polar kropp og en oocyt som beholder sin størrelse. Dermed lagres de fleste cytoplasmatiske komponenter i ooplasma under tidlig embryogenese4. Deretter går oocyttene inn i meiose II, uten å reformere kjernen eller dekondensere kromosomene, og forblir arrestert i metafase II til befruktning5.
En unik egenskap som skiller oocytter fra somatiske celler er tilstanden av arrestasjon i profase I, når oocytten har en intakt kjerne (germinal vesikkel [GV] arrest), referert til som GV stadium6. Basert på kromatinorganisasjonen klassifiseres GV-stadium oocytter i to kategorier: ikke-omgitt nukleolus (NSN) og omgitt nukleolus (SN) 7,8. I NSN GV-stadium oocytter sprer kromatinet seg gjennom hele kjerneområdet, og transkripsjon er aktiv, mens kromatinet i SN-oocytter danner en kompakt ring som omgir nukleolus, og transkripsjonen er stille9. Begge typer GV-stadium oocytter viser meiotisk kompetanse; de går inn i meiose i samme hastighet, men NSN-oocyttene presenterer lav utviklingskapasitet og kan ikke utvikle seg utover tocellestadiet embryo10.
Den langvarige tilstanden av profase I-arrestasjon øker forekomsten av DNA-skadeakkumulering11. Derfor er DNA-skaderesponsmekanismer i oocytter avgjørende for å tillate produksjon av gameter med genetisk integritet og for å sikre at det resulterende embryoet har et fysiologisk kromosominnhold.
Et sentralt aspekt ved DNA-skaderesponsen er DNA-reparasjon. Hovedveiene for DSB-reparasjon i eukaryote celler inkluderer ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ), homolog rekombinasjon (HR) og alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ er en raskere, men mer feilutsatt mekanisme, mens HR krever mer tid for å fullføres, men har høy troskap16.
Det er ikke nok kunnskap om mekanismene som oocytter bruker for reparasjon av DNA-skader. Studier har vist at DNA-skade indusert i fullvoksne pattedyroocytter ved bruk av genotoksiske midler, som etoposid, doksorubicin eller UVB eller ioniserende stråling, ikke påvirker tidspunktet og utgangshastigheten fra profase I arrest17. Oocytter kan gjennomgå GV-nedbrytning (GVBD) selv i nærvær av forhøyede nivåer av skade. Denne skaden kan bestemmes ved observasjon av γH2AX. Denne fosforylerte formen av H2AX (γΗ2ΑΧ) er en DSB-markør, som ligger på bruddstedet og fungerer som et stillas for å hjelpe til med å reparere faktorer og proteiner for å akkumulere i ødelagte ender18.
Fraværet av cellesyklusstans etter DNA-skade skyldes et utilstrekkelig DNA-skadekontrollpunkt som gjør at oocytter med ureparert DNA kan gå inn i meiose igjen. Etter høye nivåer av DNA-skade kan et kontrollpunkt opprettholde profasearrest gjennom aktivering av en ATM / Chk1-avhengig vei. Den begrensede sjekkpunktresponsen til DSB skyldes begrenset aktivering av minibank17,19. I M-fasen av meiose I har forskning vist at DNA-skade kan aktivere et spindelmonteringskontrollpunkt (SAC) -indusert meiose I-kontrollpunkt, som forhindrer aktivering av E3 ubiquitin ligase anafasefremmende kompleks / syklosom (APC / C) og derfor M-fase utgang. Videre overvinner ablasjonen av SAC-proteiner tilstanden av M-fasearrest, og understreker dermed betydningen av SAC i etableringen av meiosen I chekpoint20.
Som tidligere forskning tydelig viser, kan ikke DSB indusere et robust profasekontrollpunkt i museoocytter. Hvis slike skader ikke repareres, kan det føre til at embryoer bærer kromosomale abnormiteter. Derfor er det viktig å studere DNA-skaderesponsen på forskjellige stadier av kvinnelig gametogenese for bedre å forstå de unike veiene som oocytter bruker for å takle potensielle genetiske fornærmelser.
Protocol
Alle museforsøk ble godkjent av de lokale myndighetene (Region of Ioannina, Hellas) og utført i samsvar med European Communities Council Directives 2010/63 / EU. Eksperimenter ble utført med hensyn til prinsippene for 3R-ene. Alle CD-1-musene som ble brukt til forsøkene ble holdt i dyrehusanlegget ved Universitetet i Ioannina, Hellas, i et rom med kontrollert temperatur (22 ° C) og fuktighet (60%) og ble matet ad libitum. Dyrehuset har konsesjon til å drive anlegg for avl (EL33-BIObr01), forsyning (EL33-BIOsup01) og forsøk (EL33BIO-exp01).
1. Fremstilling av reagenser
- Fortynn 3-isobutyl-1-metylxanthin (IBMX) pulver (se materialtabellen) i dimetylsulfoksid (DMSO) (se materialtabellen) til en endelig konsentrasjon på 200 mM. Μake 10 μL alikoter, og oppbevares ved -20 °C. Bruk løsningen innen 1 måned.
MERK: IBMX pulver oppbevares ved -20 °C. - Klargjør alle immunfluorescensbufferne og oppbevar dem ved 4 °C.
- Klargjør sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) ved å fortynne en PBS-tablett (se materialtabellen) i 200 ml ddH2Ο.
- Lag PHEM-buffer ved å tilsette 80 ml ddH 2 Ο, 0,59575 g HEPES, 1,81422 g RØR, 0,38035 g EGTA og 0,04066 g MgCl2(se materialtabellen) mens du rører med en magnetomrører (se materialtabellen), og tilsett samtidig NaOH (se materialfortegnelsen) til pH når 6,9 (sjekk med en pH / ORP-måler [se materialtabellen]). Deretter legger du ddH2Ο til et endelig volum på 100 ml.
- Forbered paraformaldehyd-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) buffer ved å fortynne PFA-pulver (se materialtabellen) i PHEM-buffer under omrøring med en magnetomrører under oppvarming ved en endelig konsentrasjon på 4% PFA. Deretter filtrerer du bufferen ved hjelp av en sprøyte og et 0,2 μm filter (se materialfortegnelsen), og tilsett 0,5 % Tx-100 (se materialfortegnelsen). Forbered ca. 10 ml PFA-Tx-100 (0,4 g PFA, 50 μL Tx-100), som er nok for ett eksperiment. Oppbevares ved 4 °C i maks 1 uke.
FORSIKTIG: Bruk hansker for å håndtere PFA, og unngå kontakt med hud og øyne. - Forbered vaskebuffer ved å tilsette bovint serumalbumin (endelig konsentrasjon: 0,5% w / v BSA) (se materialtabellen) i PBS, og agiter mekanisk. Tilsett 10 % w/v NaN3-buffer (natriumazid) ved en fortynning på 1:1 000 for å minimere risikoen for sopp- og bakteriekontaminering. Lag en 10% w / v NaN 3 buffer ved å tilsette 1 g NaN3 pulver (se materialtabellen) til 10 ml ddH2O; oppbevar NaN3-bufferen ved romtemperatur.
- Forbered blokkeringsbuffer ved å legge til BSA (endelig konsentrasjon: 3% w / v) i PBS og agitere mekanisk. Tilsett 10 % NaN3-buffer ved en fortynning på 1:1 000.
2. Innsamling av GV-oocytter fra dissekerte eggstokker og induksjon av DSB
MERK: Alle verktøy og løsninger skal være sterile. Oocytthåndtering utføres ved hjelp av en munnpipette under et stereomikroskop (se materialtabellen), og alle dråpene er dekket med mineralolje (se materialfortegnelse og figur 1E).
- Injiser mus intraperitonealt med 7 internasjonale enheter (IE) av drektig hoppes serumgonadotropin (PMSG) (se materialtabellen) 46-48 timer før du avliver musene ved cervikal dislokasjon.
MERK: Alle musene som brukes skal være 8-12 uker gamle. - Filtrer M2 kulturmedium (se materialtabellen) med en sprøyte og et 0,2 μm filter, og tilsett IBMX 200 mM til en endelig konsentrasjon 200 μM i et 14 ml rundbunnsrør (se materialtabellen) for å holde oocyttene arrestert ved profase I. Tilbered deretter dråper M2-IBMX-medium i en plastvevskulturskål (se materialtabellen), og legg den på en varm blokk (se materialtabellen) ved 37 ° C i minst 30 minutter før oocyttisolering. Oppbevar M2 ved 4 °C.
- Ofre musene ved cervikal dislokasjon, dissekere eggstokkene, og legg dem i et 5 ml rundbunnsrør (se materialtabellen) med M2-IBMX.
- Overfør eggstokkene til et plastlokk som inneholder 1,5 ml M2-IBMX, fjern eventuelt fettvev eller eggledersegmenter fra eggstokkene, og frigjør kombinasjonsp-pillene ved mekanisk perforering av eggstokkene med en 27 G nål (se materialfortegnelse og figur 1A-C).
- Overfør kombinasjonspaltene til en dyrkningsskål med dråper M2-IBMX (ca. 25-30 μL hver), og fjern cumuluscellene ved gjentatt pipettering ved hjelp av en Pasteur-pipette med smalboret glass (se materialfortegnelse og figur 1D).
- Velg SN GV-trinns oocytter, og overfør dem i en dråpe (25 μL) M2-IBMX-medium på en varm blokk ved 37 °C beskyttet mot lys (figur 1F).
- Se etter SN-oocytter basert på deres større størrelse og sentralt plasserte kjerner i motsetning til NSN-oocytter, hvor kjernene er plassert perifert21. I alle fall observere DNA-konfigurasjonen under et konfokalmikroskop før du tar den endelige avgjørelsen om typen GV-oocyt (SN eller NSN).
- Indusere DSB ved bruk av etoposid (se materialfortegnelse). Plasser GV-trinns oocytter i dråper (25 μL hver) av det genotoksiske middel i 1 time på den varme blokken ved 37 ° C under mørke forhold.
MERK: Etoposid er en topoisomerase II-hemmer som introduserer DSB til DNA22. Etoposid skal oppbevares i 10 mikrol alikoter på 20 mg/ml ved romtemperatur beskyttet mot lys. Konsentrasjonene som er testet er 5 μg/ml, 20 μg/ml og 50 μg/ml. - For å holde GV-trinns oocytter arrestert i en lengre periode, plasser oocyttene i dråper M16 kulturmedium (se materialtabellen) supplert med 400 μM IBMX i en inkubator (se materialtabellen) ved 37 ° C og 5% CO2. Oppbevar M16 ved 4 °C, filtrer mediet med en sprøyte og et 0,2 μm filter, og inkuber det i minst 1 time før bruk.
Figur 1: Oocyttisolasjonsprosess . (A) Fjerning av fettvev fra peri-ovarier og rester av eggledersegmenter fra eggstokkene i M2 medium med IBMX. Fotografi oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skalastang = 1 mm. (B) Isolerte eggstokker i M2 medium med IBMX. Bilde oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skalastang = 1 mm. (C) Mekanisk perforering av eggstokkene ved bruk av en 27 G kanyle i M2 medium med IBMX. Bilde oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skalastang = 1 mm. (D) COCs frigjort fra eggstokkene etter perforering i M2 medium med IBMX. Bilde oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skalastang = 100 μm. (E) Oocyttsamling ved hjelp av en munnpipette. (F) Denuded oocytter, etter fjerning av de omkringliggende cumuluscellene, i M2 medium med IBMX. Bilde oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Oocytfiksering og immunfluorescens
MERK: Oocytthåndtering utføres ved hjelp av en munnpipette under et stereomikroskop, og alle dråpene er dekket med mineralolje.
- Plasser kontroll- og etoposidbehandlede GV-oocytter i forskjellige plastvevskulturretter med PFA-Tx-100-buffer i 40 minutter ved romtemperatur.
- Vask oocyttene i tre forskjellige dråper vaskebuffer (50 μL hver) ved romtemperatur. La oocyttene stå i 5 minutter i hver dråpe.
- Plasser oocyttene i dråper blokkerende buffer (25 μL hver) i 1 time på en varm blokk ved 37 °C.
- Klargjør det primære antistoffet som gjenkjenner γH2AX (kaninfosfo-Η2ΑΧ) (Ser139) (se materialfortegnelsen) (stamløsning: 1 mg/ml). Bruk en 1:200 fortynning i blokkeringsbuffer, og legg oocyttene i dråper med primærantistoff (15 μL hver) ved 4 °C over natten.
MERK: Phospho-Η2ΑΧ (γH2AX) er en vanlig markør for å oppdage DSB i både somatiske celler og GV-oocytter18,23. - Neste dag, vask oocyttene i tre forskjellige dråper vaskebuffer (50 μL hver) ved romtemperatur. La oocyttene stå i 5 minutter i hver dråpe.
- Klargjør det sekundære antistoffet, Alexa Fluor 488-konjugert geiteantikanin (se materialtabellen) (stamløsning: 2 mg/ml). Bruk en 1:200 fortynning i blokkeringsbuffer, og legg oocyttene i dråper sekundært antistoff (15 μL hver) i 1 time på en varm blokk ved 37 ° C beskyttet mot lys.
- Overfør oocyttene til dråper DRAQ7 (25 μL hver) (stamløsning: 0,3 mM; se materialtabellen), som er et langt rødt fluorescerende DNA-fargestoff som bare flekker DNA i permeabiliserte celler. Bruk en 1:250 fortynning i vaskebuffer i 10 minutter ved romtemperatur under mørke forhold.
- Vask oocyttene i tre forskjellige dråper vaskebuffer (50 μL hver) ved romtemperatur. La dem stå i 5 minutter i hver dråpe, og overfør dem deretter til små dråper (ca. 5 μL hver) vaskebuffer i en 35 mm petriskål med glassbunn (se materialfortegnelsen) for konfokalmikroskopi (figur 2A).
MERK: Vaskingen av både DNA-flekken og sekundært antistoff utføres samtidig.
4. Konfokal mikroskopi
MERK: Konfokalmikroskopi bør utføres umiddelbart for å unngå reduksjon i fluorescensintensiteten etter plassering av oocytter i glassbunnsretter. Tilgang til et konfokalmikroskop (se materialfortegnelsen) med motorisert stadium er nødvendig.
- Oppsett av mikroskop
- I konfokalsystemet, slå på laserkontrolleren, laserne, mikroskopkontrolleren, lampene for det overførte lyset og PCen (figur 2B, D).
- Åpne konfokalprogramvaren, og velg 40x oljelinse.
- Plasser fatet i prøveholderen, og prøv å fokusere på oocyttene ved å flytte scenen på XY- og Z-akser ved hjelp av joysticken (figur 2C).
- Skanning av oocytter
- Still lasereffekten, forsterkningen og pinhole-størrelsen uavhengig for hvert eksperiment for å minimere metning.
- For hver oocyt, sett interesseområdet, spesielt i kjernen i DNA-området. Definer grensene til DNA-området, og juster z-trinnstørrelsen til 3 μm. Start deretter skanningen.
- Lagre bildene for hver celle i den merkede mappen.
- Når skanningen er fullført, avslutter du programvaren, slår av datamaskinen og slår av laserkontrolleren, laserne, mikroskopkontrolleren og lampene for det overførte lyset.
Figur 2: Konfokal mikroskopi . (A) Faste oocytter etter å ha utført immunfluorescensprotokollen og DNA-farging, som er i separate dråper vaskebuffer, dekket med mineralolje, plassert i en glassbunnskål og forberedt for konfokalmikroskopiavbildning. Hver dråpe inneholder en annen eksperimentell kategori. Bilde oppnådd gjennom stereomikroskopokularene. Skalastang = 1 mm/100 μm for den innzoomede delen. (B) Glassbunnplate plassert på konfokalmikroskopstadiet. (C) Brightfield-bilde av oocytter oppnådd ved konfokal mikroskopi. Skala bar = 100 μm. (D) Det konfokale mikroskopisystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Imaging analyse
- Last ned Fiji ImageJ-win64 i nettleseren (https://imagej.net/software/fiji/downloads), åpne den og importer dataene som TIFF-stakkfiler.
MERK: Åpne hver oocyttfil separat. - Klikk på bildet | Farge | Split Channels for å dele alle kanalene.
- Klikk på LUT (Look up Table), og velg de foretrukne fargene for hver kanal.
- Klikk på bildet | Farge | Slå sammen kanaler for å slå sammen kanalene for γΗ2ΑΧ og DNA. La brightfield-kanalen være uslått sammen.
- I NSN-oocytter og i SN-oocytter med lave nivåer av DNA-skade detekteres γΗ2ΑΧ som foci i DNA-regionen. I dette tilfellet klikker du på " Multi-point" eller punktkommandoen , og velger hvert γΗ2ΑΧ-fokus som sammenfaller med DNA. Gjenta dette trinnet for alle stablene.
- I SN-oocytter med høye nivåer av DNA-skade fordeles γΗ2ΑΧ-signalet over hele DNA-regionen. I dette tilfellet klikker du på Bilde | Stabler | Z-prosjekt, og med kommandoen Frihåndsvalg, velg hele DNA-området.
- For å måle γΗ2ΑΧ fluorescens, klikk på Analyser | Mål opp, og kopier målingene til en .xlsx-fil. Deretter beregner du gjennomsnittlig fluorescens, normaliserer verdiene og teller antall foci før du lager noen grafer.
- Klikk på Analyser | Angi Skala for å angi skalaen og deretter på Analyser | Verktøy | Skalalinje for å legge til en skalalinje i kanalene.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren demonstrert her, ble musens eggstokker dissekert, fettet ble fjernet, og fullvoksne GV-stadium oocytter ble samlet. Deretter ble cumuluscellene fjernet ved repeterende pipettering ved hjelp av en smal pipette og plassert i friske dråper M2-IBMX medium og dekket med mineralolje på en varm blokk (37 ° C) (figur 1A-F). Tre ulike etoposidkonsentrasjoner ble fremstilt (5 μg/ml, 20 μg/ml og 50 μg/ml) ved bruk av en etoposidkonsentrasjon på 20 mg/ml. GV-trinns oocytter ble plassert i tre forskjellige etoposidkonsentrasjoner i 1 time i dråper dekket med mineralolje og beskyttet mot lys ved 37 ° C. Immunfluorescensprotokollen ble deretter fulgt, som beskrevet i protokollavsnittet i detalj, og oocytter ble lagt i glassbunnsfat og observert ved konfokalmikroskopi (figur 2).
I SN GV-stadium oocytter, umiddelbart etter DNA-skade, økte tilstedeværelsen av γH2AX ved alle etoposidkonsentrasjonene (5 μg / ml, 20 μg / ml og 50 μg / ml), og γH2AX ble fordelt over hele DNA-regionen (figur 3). DSB-kvantifisering og estimering ble utført ved å observere γH2AX-fluorescensintensiteten på DNA-steder. γH2AX-fluorescensen ble intensivert proporsjonalt med økende etoposidkonsentrasjoner. Videre, etter langvarig profasestans (20 timer etter etoposidbehandling), viste GV-stadium oocytter kapasiteten til å redusere γH2AX foci antall og intensitet, noe som antyder tilstedeværelsen av aktive reparasjonsprosesser i GV-trinnsarresterte oocytter (figur 3E).
I motsetning til SN-oocytter, hvor γH2AX-fluorescensen ble distribuert gjennom DNA, i NSN-oocyttene, ble γH2AX vist i foci umiddelbart etter behandling med etoposid ved 20 μg / ml. Vi estimerte antall foci som falt sammen med DNA-området, beregnet fluorescensen av hvert fokus og presenterte gjennomsnittlig fluorescens av alle oocytter. Både fluorescens og antall foci viste statistisk signifikante forskjeller mellom de to oocyttkategoriene (figur 4).
Konfokalmikroskopi gir informasjon om antall og intensitet av foci i forskjellige Z-stabler, og bidrar dermed til å identifisere tilstedeværelsen av DNA-skade og reparasjonsdynamikken på forskjellige tidspunkter. Galvano skanning gir presisjonsskanning med lav bakgrunn og bedre analyse av skanningsbildene.
Figur 3: Reduksjon av γH2AX i SN GV-stadium oocytter behandlet med tre forskjellige etoposidkonsentrasjoner etter langvarig GV-arrest. (A) γH2AX fluorescens i SN GV-stadium oocytter 0 timer etter etoposidbehandling. γH2AX øker umiddelbart etter eksponering ved alle etoposidkonsentrasjonene, og økningen er konsentrasjonsavhengig (grønn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bildene er Z-stack projeksjoner, og lysstyrken / kontrasten er justert for hver kanal ved hjelp av Fiji / ImageJ. Skalastang = 10 μm. (B) Graf over γH2AX-fluorescens i SN GV-stadium oocytter 0 timer etter behandling med distinkte etoposidkonsentrasjoner. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Hvert punkt representerer en oocytt (antall oocytter er vist i grafen), (ns = ikke-signifikant, ** p < 0,005, **** p < 0,0001, enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest). (C) γH2AX fluorescens i SN GV-stadium oocytter 20 timer etter etoposidbehandling. γH2AX reduserer 20 timer etter eksponering ved alle etoposidkonsentrasjoner (grønn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bildene er Z-stack-projeksjoner, og lysstyrken/kontrasten er justert for hver kanal ved hjelp av Fiji/ImageJ. Skalastang = 10 μm. (D) Graf over γH2AX-fluorescens i SN GV-stadium oocytter 20 timer etter behandling med distinkte etoposidkonsentrasjoner. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Hvert punkt representerer en oocytt (antall oocytter er vist i grafen), (ns = ikke-signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,005 , *** p < 0,0005, **** p < 0,0001, enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest). (E) Søylediagram over γH2AX fluorescensreduksjon i SN GV-stadium oocytter etter profasearrest i etoposidbehandlede oocytter. Tallet over hver kolonne indikerer den prosentvise nedgangen i γH2AX fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fosforylering av Η2ΑΧ i NSN GV-stadium oocytter etter behandling med etoposid ved 20 μg/ml. (A) Representative konfokale bilder av en kontroll NSN GV-stadium oocytt (grønn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bildene er Z-stack-projeksjoner, og lysstyrken/kontrasten er justert for hver kanal ved hjelp av Fiji/ImageJ. Skala bar = 10 μm. (B) Representative konfokale bilder av en etoposidbehandlet NSN GV-stadium oocytt (grønn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Oocyttene ble fiksert 0 t etter etoposidbehandling. Bildene er Z-stack-projeksjoner, og lysstyrke/kontrast er justert for hver kanal ved hjelp av Fiji/ImageJ. Skalastang = 10 μm. (C) Den normaliserte γΗ2ΑΧ-fluorescensen i NSN GV-stadium oocytter etter 20 μg/ml etoposidbehandling. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Hvert punkt representerer en oocytt (antall oocytter er vist i grafen), hentet fra to uavhengige eksperimenter (**** p < 0,0001, uparret ikke-parametrisk t-test, Mann-Whitney U-test). (D) Antall γΗ2ΑΧ foci i NSN GV-stadium oocytter etter 20 μg / ml etoposid behandling. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Hvert punkt representerer en oocytt (antall oocytter er vist i grafen), hentet fra to uavhengige eksperimenter (**** p < 0,0001, uparret ikke-parametrisk t-test, Mann-Whitney U-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Ved å bruke metoden beskrevet her, påviste vi DSB i pattedyrs oocytter. Denne metoden tillater deteksjon og studier av DNA-reparasjonsprosessen i oocytter. Den samme protokollen kan også brukes til å analysere andre proteiner som deltar i fysiologiske prosesser i pattedyrs oocytter. Det er viktig å studere hvordan oocytter reagerer på potensiell DNA-skade for bedre å forstå årsaken til kvinnelig subfertilitet hos mennesker.
Å studere DNA-skaderesponsen i pattedyrs oocytter kan være utfordrende på grunn av følsomheten til oocytter. Oocythåndtering krever spesifikke temperaturer og CO 2 og O2 konsentrasjoner. Samtidig må oocyttene beskyttes mot lys. Αll-håndtering bør gjøres ved å bruke glasspipetter som ikke er smale, da dette kan være skadelig for oocytter, men heller ikke toο bredt, da dette kan føre til fortynning av mediet og dermed påvirke fikseringsprosedyren negativt. I hvert fikseringstrinn brukes flere dråper buffere for å minimere fortynningseffekten. En alternativ måte å observere DSB på er Comet-analysen24. Selv om denne teknikken er mer følsom, er den mer komplisert. Samtidig, ved å bruke Comet-analysen, er det ikke mulig å oppdage det nøyaktige DNA-området der skaden oppstår, og i celler med rikelig RNA-molekyler, som GV-stadium oocytter25, kan bakgrunnen økes, noe som fører til et falskt DNA-skadesignal26.
Ved å bruke immunfluorescensprotokollen beskrevet her, kan vi oppdage DSB med nøyaktighet og estimere reparasjonsfremdriften i GV-stadium oocytter, som indikert ved reduksjonen i γH2AX fluorescens over tid. Likevel er en begrensning av denne metoden at visse antistoffer kan presentere uspesifikk fordeling gjennom ooplasma, og dermed føre til bilder med høy bakgrunnsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferen brukes i stedet for sekvensiell PFA og Tx-100, da vi har observert at den forbedrer fikseringsprosessen ved å tillate deteksjon av mindre bakgrunn og ikke-spesifikk fluorescens. En annen begrensning ved bruk av γH2AX for DSB-deteksjon er at skade ikke kan estimeres etter GVBD på grunn av spontan fosforylering av γH2AX i meiose23.
I denne immunfluorescensprotokollen forblir oocyttene i en væskebuffer og kan ikke lagres i lysbilder. Dette faktum gjør det vanskelig å bevare de faste cellene i flere dager etter tilsetning av sekundært antistoff. For å oppnå bilder av god kvalitet og ikke miste signalet, er det å foretrekke å utføre avbildningen innen få timer etter tilsetning av det sekundære antistoffet. Det skal også bemerkes at skanningen av kjernene gjennom Z-aksen kan gjøre signalet svakere på grunn av overeksponering. Av den grunn er det å foretrekke å senke lasereffekten og øke hastigheten på skanningen.
Til slutt er en annen begrensning av immunfluorescensprotokollen at den bare kan brukes til faste / ikke-levende celler. Derfor kan vi bare estimere tilstedeværelsen og fraværet av faktorer på bestemte tidspunkter uten å vite om det er noen svingninger i konsentrasjonen eller endringer i deres oppførsel gjennom tiden. Dette problemet kan løses ved å bruke levende cellebilder og fluorescerende merkede markører.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtte til dette arbeidet fra prosjektet "Etablering av 'kapasitetsbyggende' infrastrukturer i biomedisinsk forskning (BIOMED-20)" (MIS 5047236), som er implementert under handlingen "Forsterkning av forsknings- og innovasjonsinfrastrukturen", finansiert av det operative programmet "Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation" (NSRF 2014-2020), og delfinansiert av Hellas og EU (European Regional Development Fund).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G.
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. , 202-212 (2021).
