Här presenterar vi ett protokoll för utveckling och validering av god laboratoriesed vid kompatibel detektion av adenoassocierade virala vektorer i mänskliga tårar genom dropp digital polymeraskedjereaktion till stöd för klinisk utveckling av genterapivektorer.
Användningen av virala vektorer för att behandla genetiska sjukdomar har ökat avsevärt de senaste åren, med över 2000 studier registrerade hittills. Adenoassocierade virala (AAV) vektorer har funnit särskild framgång vid behandling av ögonrelaterade sjukdomar, vilket exemplifieras av godkännandet av voretigene neparvovec-rzyl. För att få ut nya terapier på marknaden begär tillsynsmyndigheter vanligtvis kvalificerade eller validerade biosheddingstudier för att utvärdera frisättningen av vektorn i miljön. Inga officiella riktlinjer för utveckling av molekylbaserade analyser för att stödja sådana sheddingstudier har dock släppts av United States Food and Drug Administration, vilket gör att utvecklare kan bestämma bästa praxis för sig själva. Syftet med detta protokoll är att presentera ett validerbart protokoll för detektion av AAV-vektorer i mänskliga tårar genom droppdigital polymeraskedjereaktion (ddPCR) till stöd för kliniska biosheddingstudier. Detta manuskript diskuterar nuvarande industrimetoder för molekylär analysvalidering och visar att metoden överträffar de målanalysacceptanskriterier som för närvarande föreslås i vitböcker. Slutligen diskuteras steg som är kritiska i utförandet av alla ddPCR-analyser, oavsett applikation.
Genterapidefinitionerna varierar, men inducerar i allmänhet en avsiktlig och ofta förväntad permanent växling av en specifik DNA-sekvens i det cellulära genomet för att modifiera eller manipulera uttrycket av en gen eller för att ändra de biologiska egenskaperna hos en levande cell för ett kliniskt ändamål 1,2. Virala vektorer används alltmer som fordon för genterapi på grund av deras effektivitet av transduktion, med en rapport som tyder på att över 70% av nuvarande kliniska prövningar av genterapi använder virala vektorer3. Intresset för virala vektorer för genterapi har ökat stadigt. Kvartalsrapporten för kvartal 4 2022 om gen-, cell- och RNA-terapilandskapet från American Society of Gene and Cell Therapy rapporterade att under 2022 ökade gen-, cell- och RNA-terapipipelinen från preklinisk till förregistrering med 7%, vilket innebär att det totala antalet terapier under utveckling uppgår till 3 726, varav 2 053 (55%) var genterapier4. United States Food and Drug Administration (USA FDA) har för närvarande godkänt 27 cell- och genterapier för klinisk användning hos människor, varav fem specifikt använder virala vektorer5.
Adenoassocierade virus (AAV) har fått särskilt intresse som fordon för genterapi. En nyligen genomförd metaanalys avslöjade att det har gjorts cirka 136 kliniska prövningar som undersöker användningen av AAV under de senaste två decennierna6. Dessutom är tre av de fem USA FDA-godkända genterapierna AAV-baserade. Detta beror på deras mycket redigerbara natur, breda värdområde som kan justeras baserat på användning av specifika naturligt förekommande eller artificiellt konstruerade vektorer, låg patogenicitet och toxicitet hos människor och generellt låg immunogenicitet 7,8. AAV har också framgångsrikt använts för att behandla ögonsjukdomar i en godkänd klinisk miljö. Voretigene neparvovec-rzyl är en AAV2-baserad terapi som godkändes av amerikanska FDA 2017 och av Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) 2018 för behandling av biallelisk RPE65-mutationsassocierad retinal dystrofi9.
Med ökande intresse för utvecklingen av AAV-baserade terapier kommer behovet av regulatorisk vägledning om analyser. Noggrann detektion och kvantifiering av vilken virusvektor som helst är en integrerad del av upptäckten, tillverkningen och prekliniska/kliniska testfaser av produktutvecklingen. FDA har börjat utfärda vissa riktlinjer för genterapier, bland annat om kemi, tillverkning och kontroll för mänskliga genterapiprövningar av nya läkemedelsansökningar10, långtidsuppföljning efter administrering av genterapi 11, replikationskompetent retrovirustestning 12 och rekommendationer för mikrobiella vektorer som används i genterapier 13. EMA har också släppt en rad riktlinjer för utveckling av genterapiprodukter som i allmänhet överensstämmer med FDA: s rekommendationer, även om vissa skillnader finns14. Det är viktigt att notera att även om dessa riktlinjer inte fastställer rättsligt verkställbara ansvarsområden, utom när specifika bestämmelser refereras, ger de klarhet om det aktuella tänkandet från tillsynsmyndigheter om ämnet och deras förväntningar på analyser som krävs för läkemedelsansökningar och myndighetsgodkännande.
FDA rekommenderar specifikt att studier bör genomföras för att bedöma distribution, persistens och clearance av en vektor från administreringsstället för att rikta in sig på okulära och icke-okulära vävnader, intraokulära vätskor och blod15. Dessa har formen av biodistributions- och utsöndringsstudier. Biodistributionsstudier utvärderar exponering genom att undersöka hur en produkt sprids i en patients kropp från administreringsstället. Shedding utvärderar specifikt frisättningen av produkten från patienten till miljön och ökar möjligheten att överföra vektorn till obehandlade individer16. FDA ger rekommendationer för utformningen av biodistributions- och utsöndringsstudier med avseende på frekvensen av provinsamling, varaktigheten av provinsamlingen, typer av prover som samlas in och lagringsförhållandena.
Dessutom rekommenderar FDA användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR eller realtids-PCR) för kvantitativ detektion av vektorgenomer på grund av dess enkla prestanda, högkapacitetsformat, snabba vändningstider och analyskänslighet. Det finns dock en relativ brist på rekommendationer för design och prestandabedömning av molekylära metoder jämfört med de som finns för små och stora molekyler. Många av riktlinjerna för sådana studier är svåra att tillämpa på molekylära metoder på grund av den unika och komplexa utformningen av både produkterna och analyserna själva, vilket väcker frågor om lämpligheten av de tillgängliga plattformarna för de rekommenderade bedömningarna och lämpliga metoder för analysvalidering. Hittills har FDA inte krävt formell validering av PCR-baserade analyser, även om EMA har infört detta krav17. Mot bakgrund av detta tomrum har olika grupper och workshops utfärdat vitböcker och rekommendationer som tillverkare och kontraktsforskningsorganisationer har försökt följa 18,19,20,21,22,23,24,25. De flesta av dessa rekommendationer är skrivna specifikt med qPCR-analyser i åtanke, med förslag eller ändringar för nya plattformar, såsom droplet digital PCR (ddPCR), som endast ingår som anses relevanta. Nyare rekommendationer har fokuserat på överväganden för ddPCR-analyser, men har till stor del fokuserat på deras tillämpningar på vektorgenomkvantifiering i en tillverkningsmiljö snarare än i de komplexa biologiska matriser som påträffats i biosheddingstudier.
Beroende på klinisk tillämpning och mål kan ddPCR föredras framför qPCR som stöd för biodistributions- och utsöndringsstudier på grund av ddPCR:s ökade känslighet och förmåga att hantera matrisinterferens jämfört med qPCR. Dessutom, på grund av uppdelningen av prover i cirka 20 000 droppar, kan noggrann kvantifiering av kopieringsantalet uppnås utan användning av en standardkurva med hjälp av Poisson-statistik, vilket förenklar metodutveckling och validering. Målet med detta protokoll är att beskriva ett standardiserat tillvägagångssätt för utveckling och validering av en ddPCR-baserad metod för detektion av AAV-vektorer i tårar som samlats in från ögonytan till stöd för kliniska biosheddingstudier.
Det finns flera steg i ddPCR-protokollet som är avgörande för korrekt utförande av analysen. Det första kritiska steget är design och optimering av primers och sond. I allmänhet rekommenderas användning av hydrolyssondbaserad kemi över färgämnesbaserad kemi (t.ex. SYBR Green) i en preklinisk eller klinisk miljö på grund av deras överlägsna specificitet. Dessutom är valet av förstärkningsmål kritiskt. Vanligtvis är transgenen av intresse för vektorn riktad. I tidigare prekliniska stadier eller i vektorer där det kanske inte är möjligt att skilja vektortransgen kontra genomiskt DNA kan det dock vara lämpligt att använda standardiserade vektormål. Till exempel kan man rikta in sig på den inverterade terminalupprepningsregionen, promotorn, poly-A-svansen eller korsningarna mellan segmenten mellan dessa vektorkomponenter. Valet av mål varierar beroende på vektordesign. Traditionella qPCR-primer- och sonddesignstrategier och programvara är vanligtvis lämpliga för ddPCR. Designparametrar som förväntas ge en konsekvent glödgningstemperatur (till exempel 60 °C) bör väljas för att minska mängden optimering som krävs. Det har också rekommenderats att designa, beställa och utvärdera minst tre olika uppsättningar för varje mål. Man bör sedan välja den uppsättning som visar den största specificiteten (ingen amplifiering i den negativa kontrollbrunnen eller i en matris av relaterat mål-DNA) och känslighet (dvs. detektionsgräns)20.
Om det är fördelaktigt att kunna överföra analysen mellan qPCR och ddPCR rekommenderas att man optimerar analysförhållandena med qPCR först och identifierar förhållanden för den valda uppsättningen som resulterar i amplifieringseffektivitet på 90%-110% med en R2-≥ 0,98. DDPCR som slutpunktsmetod är dock vanligtvis mindre känslig än qPCR på grund av variationer i amplifieringseffektivitet. Det rekommenderas åtminstone att man kör en termisk temperaturgradient i glödgnings-/förlängningssteget för att täcka temperaturer över och under de förväntade glödgningstemperaturerna och för att utvärdera separationen mellan regn och fluorescerande amplitud mellan de negativa och positiva droppklustren som en funktion av temperaturen. Om arbetsytan tillåter rekommenderar vi att du har enskilda dedikerade arbetsstationer för förberedelse av huvudblandning, malltillägg och förstärkning. Om möjligt bör dessa fysiskt åtskiljas genom ett enkelriktat arbetsflöde med inbyggda tekniska kontroller, såsom kontrollerad åtkomst och differenslufttryck, för att minska risken för korskontaminering och falska positiva resultat. Om detta inte är möjligt måste extrem försiktighet iakttas för att förhindra korskontaminering.
Det finns två steg i detta protokoll som kan verka ovanliga för dem som är mer vana vid utveckling av qPCR-analys. Den första är införandet av ett restriktionsenzym i PCR-masterblandningen. Under ddPCR-amplifiering termocyklas varje droppe till slutpunkt. I en korrekt optimerad analys resulterar detta i två populationer av droppar, en uppsättning som visar en konsekvent hög nivå av fluorescerande signaler – de positiva – och en annan som konsekvent visar en låg nivå av fluorescerande signal – negativen. Om PCR-interferens inträffar kan det desynkronisera initieringen av PCR-amplifiering, vilket resulterar i att droppen inte når en förstärkningsplatå och därmed inkonsekventa fluorescerande slutpunkter. I detta fall kommer dropparna att fördelas mellan negativen och positiva, vilket resulterar i ett fenomen som kallas ddPCR-regn. Detta kan leda till felaktig kvantifiering av målet och inkonsekvent och subjektivt tillämpade tröskelvärden. Vår rekommendation att sätta tröskeln något över NTC: s signal, vilket bör minimera effekterna av regn i den slutliga kvantifieringen eftersom alla droppar fortfarande anses vara positiva, även om de inte är helt cyklade till slutpunkten. AAV har en mycket komplex sekundär struktur som, beroende på förstärkningsmålet, kan minska tillgängligheten till primers och prober, vilket resulterar i PCR-störningar och därmed regn. Införandet av restriktionsenzymet i masterblandningen klyver denna sekundära struktur för att öka tillgången till primrar och sonder, vilket minskar regnet, vilket därigenom kan förbättra analysens noggrannhet. Effekterna av införandet av ett restriktionsenzym i ddPCR-reaktionen har beskrivits tidigare25,32. Vilket restriktionsenzym som helst kan användas, så länge det bekräftas att det inte skär inom målförstärkningsregionen. Inga förmatsmältningssteg eller alternativa buffertkompositioner krävs.
Det andra ovanliga steget är beredningen av tårprovet innehållande AAV. I detta protokoll användes ett 1:10 (eller högre) förhållande av tårar och därefter upphettades provet. Typiskt, när tårar samlas in via ett kapillärrör, vilket är en allmänt använd uppsamlingsmetod, kan i genomsnitt cirka 10,0 μL samlas in33. Utspädningen bidrar till att åtgärda den begränsade provvolymen och ger tillräckligt med material för dubbelborrningstestning. Även om detta minskar den teoretiska detektionsgränsen, bör den robusta känsligheten hos ddPCR fortfarande resultera i detektion av alla utom ett extremt få antal vektorpartiklar. Detta tillvägagångssätt skapar dessutom en “backup” -brunn om en oväntat skulle misslyckas. I detta fall, eller i fall av otillräcklig provvolym för att köra två brunnar, kan Poisson-felet användas för att bedöma precisionen. I fall där koncentrationen ligger under detektionsgränsen skapar den dessutom en möjlighet att slå samman brunnsdata för att bestämma en koncentration. Det är nödvändigt att frigöra AAV-vektorerna från virala kapsider för ddPCR-detektering. Vissa metoder för kvantifiering av AAV har inkluderat ett proteinas K-matsmältningssteg för att avlägsna viruskapsiden34,35,36. Alla naturligt förekommande AAV-serotyper har smälttemperaturer vid eller under cirka 90 °C, varav de flesta faller under 80 °C. Därför verkar detta vara en onödig inkludering37. Uppvärmning ensam verkar vara tillräcklig för att frigöra vektor-DNA.
Dessutom är ddPCR i allmänhet mindre mottaglig för PCR-hämmare som kan finnas i ett prov som kan påverka en qPCR-analys. Om ett specifikt DNA-isoleringssteg ingår skulle detta också kräva specifik validering, vilket undviks i detta protokoll. Proverna späds före upphettning på grund av kinetiken för diffusion av vektorgenomerna i en vätska. Under uppvärmningen och efterföljande kylningsprocess kan de positiva och negativa sinnessträngarna i det enkelsträngade DNA-genomet glödgas tillsammans för att producera en dubbelsträngad intermediär om koncentrationerna är tillräckligt höga. Utspädning före upphettning minskar koncentrationerna och gör det matematiskt osannolikt att tillräckligt många dubbelsträngade intermediärer bildas för att ha en negativ effekt på kvantifieringens noggrannhet. Det bör noteras att de syntetiska DNA-fragment eller linjäriserade plasmider som används som kvalitetskontroller inte får genomgå detta uppvärmningssteg. Eftersom dessa är dubbelsträngade skulle uppvärmning resultera i omvandling till enkelsträngade intermediärer. Efter oberoende partitionering av dessa enkelsträngade QC i droppar förväntas detta resultera i en tvåfaldig ökning av QC-koncentrationen i förhållande till den nominella koncentrationen. Alternativt, om QC ska värmas upp för att standardisera metoden, måste detta beaktas vid beredning och tilldelning av en nominell koncentration.
Slutligen, när det gäller provberedning, rekommenderar många protokoll också införandet av ett DNase-behandlingssteg för att avlägsna eventuellt oinkapslat vektor-DNA. Detta steg är kritiskt i fall där det inte är önskvärt att kvantifiera fritt DNA associerat med vektorpreparatet (t.ex. vid kvantifiering för doseringsändamål). Men i samband med biodistribution och biosheddingstudier vill man vanligtvis veta var något vektor-DNA har rest, oavsett om det är inkapslat eller inte. Därför föreslås det att vanligtvis inte utföra ett DNase-behandlingssteg under sådana studier. Om det bedöms vara nödvändigt att inkludera ett DNase-steg bör detta steg vara före utspädning och upphettning.
I detta dokument presenteras data som är representativa för tillvägagångssättet för bedömning av metodens dynamiska omfång, känslighet, noggrannhet och precision inom ramen för en ändamålsenlig, god laboratoriesed som överensstämmer med valideringen. Den nuvarande bristen på vägledning om detta ämne gör att validerande laboratorier kan bestämma målanalyskriterier för sig själva, i linje med nuvarande branschtänkande. Olika grupper har ställt både högre och lägre målkriterier än vad som användes i denna studie: 19,20,21,22,23,24,25. Målanalyskriterierna bör, tills de definieras striktare, väljas före validering på grundval av metodens avsedda kliniska tillämpningar. Beroende på vilka beslut i senare led som ska fattas på grundval av uppgifterna kan det behövas större noggrannhet och precision. Omvänt kan ett enkelt positivt kontra negativt resultat vara tillräckligt.
Tillvägagångssättet omfattade också rekommendationer för bedömning av specificitet och matriseffekt. En pool av tårar som samlats in från obehandlade individer misslyckades med att ge ett positivt resultat i denna analys, medan målet kunde detekteras när vektorn spikades i tårarna vid en hög och låg koncentration inom de rekommenderade återhämtningshastigheterna. Helst skulle matris innehållande endogen vektor (t.ex. insamlad efter behandling med viral vektor) också inkluderas i dessa bedömningar. Det är dock osannolikt att sådana prover kommer att vara tillgängliga för användning vid en validering. För att öka valideringens robusthet kan flera pooler av tårar eller tårar som samlats in från en mängd olika individer bedömas för att avgöra om en patientspecifik matriseffekt uppstår. Slutligen rekommenderas att utvärdera stabiliteten. I arbetsflöden där DNA-extraktion sker utanför den biologiska matrisen kan det vara nödvändigt att utvärdera stabiliteten hos både provet och det extraherade DNA. I detta arbetsflöde testas provet direkt i analysen utan behov av DNA-extraktion. Därför måste man, med hänsyn till utvärderingen av stabiliteten för denna metod, utvärdera tårprovernas stabilitet. Vanligtvis rekommenderas bedömningar av bänkskiva, kylskåp, frysning/upptining och långsiktig stabilitet. Dessa utfördes inte som en del av denna studie, men de metoder som utvecklats här kan användas i denna bedömning, efter manipulationer till ingångsproverna.
Sammantaget har denna metod visat sig vara en robust, repeterbar och validerbar analys för att detektera AAV-baserade vektorer i tårprover. Det kan fungera som en plattform som kan anpassas till specifika vektorer för att stödja kliniska prövningar och utgör en grund för validering av en analys som överensstämmer med god laboratoriesed.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Nick Russell och Brandon McKethan från Bio-Rad för deras hjälpsamma diskussioner under utvecklingen av denna metod.
AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |