Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Summary

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Genetik hastalıkları tedavi etmek için viral vektörlerin kullanımı son yıllarda önemli ölçüde artmıştır ve bugüne kadar kaydedilen 2.000'den fazla çalışma bulunmaktadır. Adeno ilişkili viral (AAV) vektörler, voretigene neparvovec-rzyl'in onaylanmasıyla örneklendiği gibi, gözle ilgili hastalıkların tedavisinde özel bir başarı elde etmişlerdir. Piyasaya yeni tedaviler getirmek için, düzenleyici kurumlar tipik olarak vektörün çevreye salınımını değerlendirmek için nitelikli veya doğrulanmış biyodökülme çalışmaları talep eder. Bununla birlikte, bu tür dökülme çalışmalarını desteklemek için moleküler tabanlı testlerin geliştirilmesi için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından resmi bir kılavuz yayınlanmamıştır ve geliştiricileri kendileri için en iyi uygulamaları belirlemeye bırakmıştır. Bu protokolün amacı, klinik biyoshedding çalışmalarını desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) ile insan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için doğrulanabilir bir protokol sunmaktır. Bu makale, moleküler tahlil validasyonuna yönelik mevcut endüstri yaklaşımlarını tartışmakta ve yöntemin şu anda beyaz kağıtlarda önerilen hedef tahlil kabul kriterlerini aştığını göstermektedir. Son olarak, uygulamadan bağımsız olarak herhangi bir ddPCR testinin performansında kritik olan adımlar tartışılmaktadır.

Introduction

Gen terapisi tanımları değişir, ancak genellikle bir genin ekspresyonunu değiştirmek veya manipüle etmek veya bir canlı hücrenin biyolojik özelliklerini klinik bir amaç için değiştirmek için hücresel genomun belirli bir DNA dizisinin kasıtlı ve sıklıkla beklenen kalıcı bir değişimini indükler ^1,2. Viral vektörler, transdüksiyon etkinlikleri nedeniyle gen terapisi için giderek daha fazla araç olarak kullanılmaktadır; bir rapor, mevcut gen terapisi klinik çalışmalarının% 70'inden fazlasının viral vektörleri kullandığını göstermektedir³. Gen tedavisi için viral vektörlere olan ilgi giderek artmaktadır. Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği'nin Gen, Hücre ve RNA terapisi manzarasına ilişkin 4. Çeyrek 2022 Üç Aylık Veri Raporu, 2022 yılında, klinik öncesinden ön kayda kadar gen, hücre ve RNA terapisi boru hattının% 7 oranında arttığını ve geliştirilmekte olan toplam tedavi sayısını 3.726'ya çıkardığını ve bunların 2.053'ünün (% 55) gen terapileri olduğunu bildirmiştir⁴. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (ABD FDA) şu anda insanlarda klinik kullanım için 27 hücre ve gen terapisini onaylamıştır, bunlardan beşi özellikle viral vektörleri kullanmaktadır⁵.

Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) gen terapisi için araçlar olarak özel ilgi görmüştür. Yakın tarihli bir meta-analiz, son yirmi yılda AAV'lerin kullanımını araştıran yaklaşık 136 klinik çalışma olduğunu ortaya koymuştur⁶. Ek olarak, ABD FDA onaylı beş gen terapisinden üçü AAV tabanlıdır. Bunun nedeni, yüksek oranda düzenlenebilir doğaları, spesifik doğal olarak oluşan veya yapay olarak tasarlanmış vektörlerin kullanımına göre ayarlanabilen geniş konak aralığı, insanlarda düşük patojenite ve toksisite ve genellikle düşük immünojenite ^7,8'dir. AAV'ler ayrıca onaylanmış bir klinik ortamda oküler hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmıştır. Voretigene neparvovec-rzyl, bialelik RPE65 mutasyonuyla ilişkili retina distrofisi^9'u tedavi etmek için 2017 yılında ABD FDA ve 2018 yılında Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanan AAV2 tabanlı bir tedavidir.

AAV tabanlı tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artmasıyla birlikte, tahliller konusunda düzenleyici rehberliğe ihtiyaç duyulmaktadır. Herhangi bir viral vektörün doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, ürün geliştirmenin keşif, üretim ve klinik öncesi/klinik test aşamalarının ayrılmaz bir parçasıdır. ABD FDA, insan gen terapisi için kimya, üretim ve kontrol araştırma yeni ilaç uygulamaları 10, gen terapisinin uygulanmasından sonra uzun süreli takip¹¹, replikasyon yetkin retrovirüs testi 12 ve gen terapilerinde kullanılan mikrobiyal vektörler için öneriler¹³ dahil olmak üzere gen terapileri için bazı kılavuzlar yayınlamaya başlamıştır. EMA ayrıca, genel olarak FDA önerileriyle uyumlu olan gen terapisi ürünlerinin geliştirilmesine ilişkin bir dizi kılavuz yayınlamıştır, ancak bazı farklılıklar vardır¹⁴. Bu kılavuzların, belirli düzenlemelere atıfta bulunulan durumlar dışında, yasal olarak uygulanabilir sorumluluklar oluşturmamasına rağmen, düzenleyici kurumların konuyla ilgili mevcut düşünceleri ve ilaç başvuruları ve düzenleyici onay için gerekli tahliller için beklentileri hakkında netlik sağladıklarını belirtmek önemlidir.

FDA, özellikle oküler ve oküler olmayan dokuları, göz içi sıvılarını ve kanı hedeflemek için bir vektörün uygulama bölgesinden dağılımını, kalıcılığını ve klirensini değerlendirmek için çalışmaların yapılmasını önermektedir¹⁵. Bunlar biyodağılım ve dökülme çalışmaları şeklini alır. Biyodağıtım çalışmaları, bir ürünün uygulama bölgesinden hastanın vücuduna nasıl yayıldığını araştırarak maruziyeti değerlendirir. Dökülme, ürünün hastadan çevreye salınımını özel olarak değerlendirir ve vektörün tedavi edilmemiş bireylere bulaşma olasılığını artırır¹⁶. FDA, numune toplama sıklığı, numune toplama süresi, toplanan numune türleri ve depolama koşulları ile ilgili olarak biyodağılım ve dökülme çalışmalarının tasarımı için önerilerde bulunur.

Ek olarak, FDA, performans kolaylığı, yüksek verimli format, hızlı geri dönüş süreleri ve tahlil duyarlılığı nedeniyle vektör genomlarının kantitatif tespiti için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunun (qPCR veya gerçek zamanlı PCR) kullanılmasını önermektedir. Bununla birlikte, moleküler yöntemlerin tasarımı ve performans değerlendirmesi için küçük ve büyük moleküller için mevcut olanlara kıyasla göreceli bir öneri eksikliği vardır. Bu tür çalışmalar için kılavuzların çoğunun, hem ürünlerin hem de tahlillerin kendilerinin benzersiz ve karmaşık tasarımı nedeniyle moleküler yöntemlere uygulanması zordur, bu da önerilen değerlendirmeler için mevcut platformların uygunluğu ve tahlil doğrulaması için uygun yöntemler hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır. Bugüne kadar, FDA, PCR tabanlı testlerin resmi olarak doğrulanmasını gerektirmemiştir, ancak EMA bu gerekliliği getirmiştir¹⁷. Bu boşluğun ışığında, farklı gruplar ve atölyeler, üreticilerin ve sözleşmeli araştırma kuruluşlarının 18,19,20,21,22,23,24,25'i takip etmeye çalıştıkları beyaz kağıtlar ve öneriler yayınladılar. Bu önerilerin çoğu, yalnızca ilgili görüldüğü şekilde dahil edilen damlacık dijital PCR (ddPCR) gibi gelişmekte olan platformlar için öneriler veya değişiklikler göz önünde bulundurularak qPCR testleri göz önünde bulundurularak yazılmıştır. Daha yeni öneriler, ddPCR testleri için dikkat edilmesi gerekenlere odaklanmıştır, ancak büyük ölçüde, biyoshedding çalışmalarında karşılaşılan karmaşık biyolojik matrislerden ziyade, bir üretim ortamında vektör genom nicelleştirmesine uygulamalarına odaklanmıştır.

Klinik uygulama ve hedeflere bağlı olarak, ddPCR'nin qPCR'ye kıyasla artan duyarlılığı ve matriks girişimlerini ele alma kabiliyeti nedeniyle biyolojik dağılım ve dökülme çalışmalarını desteklemek için ddPCR, qPCR'ye göre tercih edilebilir. Ayrıca, numunelerin yaklaşık 20.000 damlacığa bölünmesi nedeniyle, Poisson istatistikleri kullanılarak standart bir eğri kullanılmadan kopya sayısının doğru bir şekilde ölçülmesi, yöntem geliştirme ve doğrulamayı basitleştirerek elde edilebilir. Bu protokolün amacı, klinik biyodökülme çalışmalarını desteklemek amacıyla oküler yüzeyden toplanan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için ddPCR tabanlı bir yöntemin geliştirilmesi ve doğrulanması için standartlaştırılmış bir yaklaşımı tanımlamaktır.

Protocol

1. Sentetik DNA fragmanının hazırlanması

1. Kalite kontrol olarak kullanılmak üzere hedef amplifikasyon bölgesini içeren sentetik bir DNA parçası tasarlayın ve sipariş edin.
   1. Sekansın, ileri astardan ilgili hedef genin ters astarına kadar tüm amplikon dizisini içerdiğinden emin olun, her bir primer bağlama dizisinin 5' uçlarında dört ila altı baz çift sekansın bir uzantısı ile.
   2. 12 baz çiftinden büyük adenin ve timin homopolimerlerinden veya sekiz baz çiftinden büyük guanin ve sitozin baz çiftlerinden kaçının, çünkü homopolimerler gen fragmanının sentezine müdahale edebilir.
      NOT: Amplikonlar bu tür diziler içeriyorsa, primerler ve problar için tavlama bölgeleri korunduğu sürece baz ikameleri yapılabilir.
   3. Alternatif olarak, tipik klonlama stratejilerini kullanarak amplikonu içeren doğrusallaştırılmış bir plazmid hazırlayın.
2. Malzemenin tüpün dibinde toplanmasını sağlamak için sentetik DNA fragmanını içeren tüpü bir mikrosantrifüjde ~ 10 s boyunca santrifüj edin.
3. Tris-EDTA (TE) tamponunu kullanarak sentetik DNA fragmanını 1.0 ×^{10 10} kopya/μL konsantrasyonuna veya hedef tahlil aralığına göre uygun şekilde yeniden askıya alın.
4. Vorteks kısaca, daha sonra 20 ± 5 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin. Buz üzerinde serinletin.
5. Çoklu, ideal olarak tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve kullanıma kadar -70 ila -90 ° C'de saklayın.
   NOT: Bu şekilde hazırlanan sentetik DNA fragmanları tipik olarak yeniden süspansiyon tarihinden itibaren en az 24 ay boyunca stabildir.
6. İstenirse, kalite kontrol olarak kullanılmadan önce hazırlanan sentetik DNA stoğunun tam konsantrasyonunu belirleyin veya kullanılan resüspansiyona dayanarak nominal konsantrasyonu tahmin edin.

2. Primer ve probun hazırlanması

1. Tipik tasarım stratejilerini kullanarak istenen amplifikasyon bölgesini hedeflemek için astarları ve bir hidroliz probunu tasarlayın ve sipariş edin^26,27.
   1. ddPCR sistemiyle uyumlu bir 5' floresan muhabir boyası (örneğin, FAM) ve 3' söndürücü (örneğin, Iowa Black dark quencher) kullanın.
      NOT: Çok sayıda PCR testi tasarım yazılımı paketi mevcuttur ve bunlardan herhangi biri kullanılabilir. Örneğin, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi²⁸ tarafından hazırlanan Primer-BLAST, tahlil tasarımı için sağlam seçenekler ve olası hedef dışı etkileri tanımlamak için özgüllüğün biyoinformatik olarak değerlendirilebilme kolaylığı nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Astarların ve probların hazırlanmasının, tedarik edildikleri formata bağlı olarak burada listelenen adımlardan farklı olabileceği belirtilmelidir.
2. İleri astar, ters astar ve probu içeren tüpleri, ~ 10 s boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjleyerek malzemeyi tüpün altına pelet haline getirin.
3. TE tamponunu kullanarak astarları 20 μM'ye yeniden askıya alın. Kısaca vorteks.
4. TE tamponunu kullanarak probu 10 μM'ye yeniden askıya alın. Kısaca vorteks.
5. Çoklu, ideal olarak tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve kullanıma kadar en az -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Bu şekilde hazırlanan astarlar ve problar tipik olarak yeniden süspansiyon tarihinden itibaren en az 24 ay boyunca kararlıdır.

3. Numune seyreltme tamponunun hazırlanması

1. PCR tamponunu çözün ve somon sperm DNA'sını oda sıcaklığında kesin. Vorteks iyice karıştırmak için.
2. Tablo 1'e göre bir numune seyreltme tamponu hazırlayın.
3. Vorteks iyice var. Hazırlandıktan sonra 1 aya kadar 2-8 ° C'de saklayın.

Tablo 1: Numune seyreltme tamponunun hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

4. Ana karışımın hazırlanması

1. Problar, ileri astar, ters astar ve prob için ddPCR ana karışımını oda sıcaklığında çözün ve kullanmadan önce çözülme sonrası en az 10 dakika ısınmaya bırakın. Kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
   NOT: Bu reaktifler, verimli damlacık oluşumunu sağlamak için tamamen oda sıcaklığına getirilmelidir. Hazırlık sırasında reaktifleri buz üzerinde tutmayın.
   1. Vorteks, kullanımdan önce mini bir santrifüjde iyice ve kısaca santrifüjlenir.
      NOT: Restriksiyon enzimleri tipik olarak gliserol içinde sağlanır ve kullanımdan hemen önce depodan çıkarılmalıdır. Yavaşça karıştırın. Vorteks yapmayın.
2. Her amplifikasyon hedefi için bir PCR ana karışımı hazırlayın. Önerilen bir PCR ana karışım bileşimi için Tablo 2'ye bakın ve primerlerin ve probların konsantrasyonlarını gerektiği gibi değiştirin.
   1. Restriksiyon enziminin eklenmesinden önce iyice vorteks ve kısaca santrifüj. Kısıtlama enzimini ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin.
      NOT: Bu adımda, damlacık oluşumundan sonra 40 μL PCR reaksiyonunun son hacmini elde etmek için 22 μL PCR reaksiyonu gereklidir (15 μL PCR ana karışımı, 5.0 μL şablon ve 20 μL damlacık üretim yağından oluşur).
3. Plaka haritasına göre her bir kuyucuğa 16,5 μL ana karışım ekleyin. Doğrulama doğruluğu ve hassasiyet çalışması için örnek bir plaka haritası için Şekil 1'e bakın.
   1. Bir plakanın kalite kontrol (QC) serisinin üç bağımsız preparatını, test edilmiş, test edilmiş, yüksek ve düşük bir seviyeye çivilenmiş ve çivisiz üç bağımsız endojen gözyaşı alikotunu ve üç bağımsız şablonsuz kontrolü (NTC) içerdiğinden emin olun.
   2. Bu kuyucukların yerleşimini, Set 1'in konsantrasyonun azalması sırasına göre yüklendiği, Set 2'nin artan konsantrasyon sırasına göre yüklendiği ve Set 3'ün plaka konumuna özgü herhangi bir etki olup olmadığını değerlendirmek için rastgele bir sırayla yüklendiği plaka boyunca değiştirin.
   3. Örnekleri bir sütunun mümkün olduğunca çoğunu dolduracak şekilde sıralayın ve kontrol arabelleği olan bir sütun içindeki kullanılmayan kuyucukları doldurun. İstenirse, kalan kuyucuklara birden fazla endojen kontrol partisi (örneğin, daha fazla gözyaşı havuzu veya bireylerden toplanan gözyaşı) ekleyin.
   4. Plakayı şeffaf yapışkan film ile kapatın. Şablon hazırlama sırasında plakayı oda sıcaklığında tutun. Alternatif olarak, plakayı 2-8 ° C'de 4 saate kadar tutun, ancak şablon eklemeden önce en az 10 dakika oda sıcaklığına geri getirin.

Tablo 2: Örnek PCR ana karışım hazırlığı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 1: Doğrulama doğruluğu ve hassas çalışma için örnek plaka haritası. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. QC'lerin hazırlanması

1. Sentetik DNA parçalarını veya doğrusallaştırılmış plazmidleri oda sıcaklığında çözün ve kullanımdan önce çözülme sonrası en az 10 dakika ısınmaya bırakın. Verimli damlacık oluşumunu sağlamak için şablonları oda sıcaklığına getirin.
   1. Kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın. Vorteks, kullanımdan önce mini bir santrifüjde iyice ve kısaca santrifüjlenir.
2. Seyreltici olarak numune seyreltme tamponunu kullanarak QC seyreltmeleri hazırlayın. Doğrulama doğruluğu ve hassasiyet çalışmasına hazırlanmak için önerilen konsantrasyonların bir örneği Tablo 3'te sunulmuştur.
   NOT: Doğruluk ve hassasiyet çalışmalarının başarıyla tamamlanmasının ardından, her plakada yalnızca yüksek kalite kontrol (HQC), orta kalite kontrol (MQC) ve düşük kalite kontrol (LQC) çalıştırılmalıdır. Doğruluk ve hassasiyet çalışmaları için, tahlil içi doğruluk ve hassasiyetin değerlendirilmesi için QC'lerin en az üç bağımsız seyreltmesi dahil edilmiştir. Doğruluk ve hassas çalıştırmaların ardından, yalnızca bir seyreltme serisinin dahil edilmesi gerekir.
3. Hazırlandıktan sonra, seyreltmeleri tabağa eklenene kadar oda sıcaklığında saklayın.
4. Seyreltmeleri buz üzerinde veya gerekirse 2-8 ° C'de saklayın. Sonraki kullanımdan önce, seyreltmelerin kullanımdan önce en az 10 dakika oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Günün sonunda QC'leri atın.

Tablo 3: Sentetik çift sarmallı DNA fragmanları kullanılarak örnek kalite kontrol (QC) hazırlığı. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

6. Numunelerin hazırlanması

1. Çözülene kadar oda sıcaklığında bir klinik çalışmadan toplanan gözyaşı örneklerini çözün ve kullanımdan önce çözülmeden sonra en az 10 dakika ısınmaya bırakın.
   1. Kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın. Vorteks, kullanımdan önce bir mikro santrifüjde iyice ve kısaca santrifüjlenir.
2. Seyreltici olarak numune seyreltme tamponu kullanarak gözyaşı numunelerini 1:10 (veya daha büyük) seyrelterek 0,2 mL PCR tüplerine veya 8 delikli PCR şeritlerine seyreltin. Tüpleri kapatın.
   NOT: Gözyaşlarında beklenen hedef konsantrasyonuna bağlı olarak, numunelerin daha fazla seyreltilmesi veya her numunenin birden fazla seyreltilmesinin test edilmesi gerekebilir.
3. Numuneleri termal bir döngüleyicide 95 °C'de 10 dakika ısıtın, ardından soğuması için en az 5 dakika boyunca 4 °C'de tutun. 3 °C/sn rampa hızı kullanın.
   NOT: Numuneler aynı gün kullanılıncaya kadar termal döngüleyicide 4 °C'de kalabilir veya daha uzun süre saklamak için -70 ila -90 °C'de dondurulabilir. Bu adım, vektör kapsidini denatüre etmeye ve genomu serbest bırakmaya hizmet eder. QC sentetik DNA fragmanları veya doğrusallaştırılmış plazmidler çift sarmallı olduklarından, bu ısıtma adımından geçmemelidirler.
4. Soğuduktan sonra numuneleri oda sıcaklığına geri getirin (veya donmuşsa oda sıcaklığında çözün) ve en az 10 dakika ısınmaya bırakın.
   NOT: Verimli damlacık oluşumunu sağlamak için numuneler tamamen oda sıcaklığına getirilmelidir.

7. Şablon ekleme

1. Ana karışımı içeren ddPCR plakasını alın. Malzemeyi hatırlamak için her numuneyi veya QC seyreltme tüpünü iyice ve kısaca santrifüj yapın.
2. Yapışkan filmi çıkarın ve plaka haritasına göre 96 delikli plakanın uygun kuyucuklarına 5,5 μL QC veya numune ekleyin.
   NOT: Gerekli birimlerin açıklaması için adım 4.2.1'e bakın
3. NTC kuyucuklarına 5,5 μL numune seyreltme tamponu ekleyin.
4. Damlacık üretimi, bir kolonun tüm kuyucuklarının bir reaksiyon veya tampon kontrolüne sahip olmasını gerektirir. Bir kolonun herhangi bir kuyucuğu numune reaksiyonları içermiyorsa, nükleaz içermeyen su kullanarak 2x ddPCR tampon kontrolü 1:2 oranında seyreltin. Bir sütunun boş kuyucuklarına 22 μL 1x ddPCR arabellek kontrolü ekleyin.
   NOT: Bir sütunun tamamı kullanılmıyorsa, bu kuyucuklara tampon kontrolü eklemek gerekli değildir.
5. Plakaya delinebilir bir folyo contası ekleyin. Plakayı plaka kapatıcıya yerleştirin ve 180 ° C'de 5 s boyunca kapatın.
   1. Alternatif olarak, plakayı ddPCR sistemi üreticisinin tavsiyelerine uygun olarak kapatın.
6. Plakayı en az 30 s boyunca maksimum hızda vorteks edin (sürekli vorteks ayarını kullanarak; dokunmatik vorteks kullanmayın) ve bir plaka eğiricide kısa bir süre santrifüj.
   NOT: Bu adımda plakanın tam ve eksiksiz karıştırılması, PCR reaksiyonunun damlacıklara uygun şekilde bölümlenmesi için kritik öneme sahiptir. Kuyularda kabarcık görünmediğinden emin olun. Gerekirse, plaka damlacık üretiminden önce maksimum 4 saat boyunca 2-8 ° C'de tutulabilir. Tutulursa, plakanın damlacık oluşumundan önce en az 10 dakika oda sıcaklığına gelmesine izin verin.

8. Otomatik damlacık üretimi, termal döngü ve damlacık okuma

1. Otomatik damlacık jeneratöründe damlacıkları aşağıdaki gibi oluşturun.
   1. Dokunmatik ekranda, örnekleri içeren plaka haritasındaki sütunları seçin. Cihazın güvertesi, hangi sarf malzemelerinin (DG32 kartuşları, uçları, atık kabı, damlacık üretim yağı) gerekli olduğunu belirtmek için yanar. Sarı ışıklar bir sarf malzemesi eklemenin gerekli olduğunu, yeşil ışıklar ise yeterli sarf malzemesinin mevcut olduğunu gösterir.
   2. Damlacık jeneratörünü arkadan öne doğru yükleyin.
   3. Hidroliz probları için, problar için damlacık üretim yağının takılı olduğundan ve kuyu sayısı için yeterli yağın kaldığından emin olun. Alternatif PCR kimyasalları kullanılıyorsa, uyumlu bir damlacık üretim yağının takıldığından emin olun.
   4. Damlacık plakası tutucusuna soğuk bir blok yerleştirin. Bloğun tamamen mavi renkli olduğundan ve pembe görünmediğinden emin olun. Soğuk bloğa yeni bir 96 delikli ddPCR plakası yerleştirin.
   5. Hazırlanan PCR plakasını numune plakası tutucusuna yerleştirin. Makine kapağını kapatın. Damlacık üretimi için başlat'a basın.
2. Damlacık oluşumunu takiben, reaksiyon başına toplam 40 μL, otomatik olarak yeni PCR plakasına aktarılır.
3. Damlacık üretiminin tamamlanmasını takip eden 30 dakika içinde, damlacıkları içeren plakayı soğuk bloktan çıkarın. Damlacıklar bu aşamada en kırılgan olduğu için yavaşça çalışın.
4. Plakaya delinebilir bir folyo contası ekleyin. Plakayı plaka kapatıcıya yerleştirin ve 180 ° C'de 5 s boyunca kapatın.
   1. Alternatif olarak, plakayı ddPCR sistemi üreticisinin tavsiyelerine uygun olarak kapatın.
5. Plakayı uyumlu bir termal çevrimciye yerleştirin. Bisiklet koşullarını girin (bkz. Tablo 4).
6. Termal döngünün sona ermesinin ardından, plakayı termal çevrimcide tutun, 2-8 ° C'ye aktarın veya hemen okuyun.
   NOT: Plakayı 4-12 ° C'de 12 saat tutmak damlacık sayısını artırabilir, ancak bu gerekli değildir. Tutmadan yeterli damlacık elde edilmelidir.
7. Plakayı damlacık okuyucuya yükleyin, yeterli okuyucu yağının kalmasını ve atık kabının yeterli alana sahip olmasını sağlayın. Damlacıkları okuyun. Termal döngünün başlamasından sonraki 24 saat içinde damlacık okuması gerçekleştirin.

Tablo 4: Tipik termal döngü koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

9. Veri analizi

NOT: Poisson istatistikleri kullanılarak konsantrasyonun doğru hesaplanması için kuyu başına en az 10.000 damlacık gereklidir. 10.000'den az damlacık içeren herhangi bir kuyucuk üzerinde analiz yapmaya çalışmayın.

1. Damlacıkları pozitif veya negatif olarak tanımlamak için bir eşik gereklidir. ddPCR analiz yazılımı otomatik olarak kuyular arasında değişebilen bir eşik uygular. Bununla birlikte, daha tutarlı, doğru ve kesin sonuçlar için plakanın tüm kuyucukları için NTC kuyularının floresan yoğunluğunun biraz üzerinde manuel olarak bir eşik ayarlayın.
   NOT: Eşiğin uygun şekilde yerleştirilmesi, pozitif ve negatif damlacıkların ayrılmasına ve ne kadar damlacık yağmuru bulunduğuna bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir (bkz. Şekil 2). Bu örnekte, damlacık genlik grafiği her QC düzeyinde ve NTC'de örnek kuyucukları gösterir. Mor çizgi, negatif damlacık popülasyonunun biraz üzerinde ayarlanmış 1.000'lik bir eşiği gösterir.
2. Poisson istatistiksel modellemesi, konsantrasyonu% 95 güvenle hesaplamak için en az üç pozitif damlacık gerektirir. Sıfır, bir veya iki pozitif damlacık içeren tüm kuyucukların negatif olduğunu ve sıfır²⁷ konsantrasyonuna ayarlandığını düşünün.
3. Her gözyaşı örneğindeki kopya numarasını geri hesaplayın.
   1. Konsantrasyon, kopya/μL olarak, veri raporunda sağlanır. Orijinal numunenin kopyaları/μL cinsinden konsantrasyonunu belirlemek için bu değeri kullanın (yani, gözyaşı numunesinde).
   2. ddPCR reaksiyon seyreltmesini hesaplamak için, damlacık oluşumundan önceki ilk PCR reaksiyon hacmini eklenen şablonun hacmine bölün. Bu yöntemde sunulan hacimler kullanıldığında, bu 4 değerini verir.
      
   3. Orijinal numuneden seri seyreltme faktörünü belirleyin (adım 6.2).
   4. Numunedeki kopyaları/μL'yi belirlemek için, kopyaları/μL'yi ddPCR reaksiyonu seyreltmesiyle, ardından seri seyreltme faktörüyle çarpın. Örneğin, veri raporunda oluşturulan kopya / μL konsantrasyonu 966 idi; 22 μL reaksiyon başına 5,5 μL şablon eklendi. Numunenin 1:50.000 seri seyreltilmesi kullanıldı.
      
      
   5. Aynı numunenin birden fazla seyreltmesi test edildiyse, tüm geçerli, aralık içi seyreltmeleri analiz edin ve ortalamayı hesaplayın.
4. Her QC için, verilen QC seyreltmesinin konsantrasyonunu (kopyalar / μL) ddPCR reaksiyon hacmine (20 μL) bölerek beklenen kopyaları / μL PCR reaksiyonunu hesaplayın. Bu, bu nominal değerin daha fazla hesaplama yapılmaksızın veri raporunda sağlanan kopyalar/μL değeriyle doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
   NOT: Bu yaklaşım, temsili sonuçlarda kullanılan çivili gözyaşı örneklerinin analizi için de kullanılmıştır.
5. Ortalama değeri, standart sapmayı, varyasyon katsayısını (%CV) ve numunenin nominal konsantrasyonuna (%RE) veya QC değerine göre göreceli hata yüzdesini çoğaltma kuyularını kullanarak belirleyin (varsa birden fazla seyreltme ekleyin).
   1. Kuyular arası hassasiyetin değerlendirilmesi için, eğer dahil edilmişse, kuyu kopyalarının her biri için bunu belirleyin.
   2. Tahlil içi doğruluk ve hassasiyetin değerlendirilmesi için, bunu bir parti içinde kullanılan her seyreltme serisi veya aliquot için belirleyin.
   3. Tahliller arası doğruluk ve hassasiyetin değerlendirilmesi için, dahil edilen partilerin her birinin tahlil içi araçlarını kullanarak bunu belirleyin.

Şekil 2: Eşik ayarlama örneği. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

10. Tahlil kabul kriterleri

1. Partinin kabul edilebilir olup olmadığını belirlemek için her parti için hesaplanan verilerde aşağıdaki belirtimleri kullanın. Bu koşullar karşılanmazsa, partiyi geçersiz kılın ve tekrarlayın.
   NOT: Bu kriterler, PCR tabanlı tahlil validasyonu 18,19,20,21,22,23,24,25 ile ilgili yayınlanmış beyaz kağıtlardan fikir birliği olarak belirlenmiştir. Hedef kriterlerin klinik uygulama için uygun şekilde değiştirilmesi gerekebilir.
2. Şablon denetimi yok (NTC)
   1. Her NTC kuyusunun en az 10.000 damlacık içerdiğinden emin olun.
   2. Her NTC kuyusunun 3'ten az pozitif damlacık içerdiğinden emin olun.
3. QC'ler ve tahlil aralığı
   1. Her QC kuyusunun en az 10.000 damlacık içerdiğinden emin olun.
   2. Bir QC konsantrasyonundaki replika kuyularının hassasiyetinin,% ≤30.0'ın kabul edilebilir olduğu üst ve alt niceleme sınırları hariç,% 25.0 CV ≤ olduğundan emin olun. Bunu her QC seti ve konsantrasyon seviyesi için bağımsız olarak değerlendirin.
   3. Her ortalama QC seviyesindeki geri hesaplanan konsantrasyonun nispi hatasının, %±30,0 RE'nin kabul edilebilir olduğu üst ve alt niceleme sınırları hariç, nominal konsantrasyonun (kopyalar/PCR reaksiyonu) %±25,0 RE'si içinde olduğundan emin olun. Bunu her QC seti ve konsantrasyon seviyesi için bağımsız olarak değerlendirin.
   4. QC örneklerinin en az 2 / 3'ünün (örneğin, altı sonuçtan dördü) ve her seviyedeki QC örneklerinin% 50'sinin (düşük, orta, yüksek) bu yönergeleri karşıladığından emin olun.
4. Örnekleri
   1. Analiz edilecek numune kuyularının en az 10.000 damlacık içerdiğinden emin olun.
   2. Analiz edilecek bir numune seyreltmesinin replika kuyularının hassasiyetinin %≤25,0 CV olduğundan emin olun.
   3. Verilen numunenin dahil edilen en az bir seyreltmesinin, üst ve alt sınır QC'lerine dayanarak yukarıda tanımlandığı gibi, tahlilin tanımlanmış niceleme aralığı içinde olduğundan emin olun.
   4. Tüm seyreltmeler, tanımlanan üst niceleme sınırından daha büyük verim sonuçları içeriyorsa ve yeterli bir numune hacmi kalırsa, numunenin daha yüksek bir seyreltmesini kullanarak tahlili tekrarlayın.
   5. Dahil edilen tüm seyreltmeler, alt niceleme sınırından daha düşük bir sonuç verirse ve yeterli bir numune hacmi kalırsa, numunenin daha düşük bir seyreltmesini kullanarak testi tekrarlayın.
      NOT: Üçten fazla pozitif damlacık içeren, ancak alt miktar sınırının altında bir konsantrasyona sahip numuneler tespit edilebilir olarak tanımlanabilir, ancak ölçülemez.

Results

Gösterim amacıyla, ticari olarak temin edilebilen, geliştirilmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden AAV2 vektörünü tespit etmek için tasarlanmış, kalite kontrol olarak eGFP içeren sentetik bir çift sarmallı DNA fragmanı ile tasarlanmış bir tahlil geliştirilmiştir. Şu anda, vektörün kendisinin mi yoksa sentetik bir DNA fragmanının veya doğrusallaştırılmış plazmidin QC olarak kullanım için en uygun olup olmadığı konusunda devam eden tartışmalar vardır. Genel olarak, yöntem geliştirmede vektöre eşdeğerlik gösteriliyorsa sentetik bir DNA fragmanı veya doğrusallaştırılmış plazmid kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir). Astarlar ve problar, eGFP transgenini tespit etmek için tasarlanmış ve optimize edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan diziler için Ek Tablo S1'e bakın. QC fragman stoğunun konsantrasyonu ddPCR kullanılarak ampirik olarak belirlendi. Tüm tahliller protokol bölümünde örnek olarak verilen konsantrasyonlar ve PCR koşulları kullanılarak yapıldı.

qPCR testleri için, standart eğrinin doğrusallığını, hassasiyetini, dinamik aralığını, doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmeniz önerilir. ddPCR, hedef niceleme için standart bir eğriye dayanmadığından, bu öneriler değiştirilmelidir. Bunun yerine, Poisson istatistiksel modellemesine dayanan bir ddPCR reaksiyonunun beklenen ölçülebilir aralığını kapsayacak şekilde çeşitli konsantrasyonlara seyreltilmiş sentetik çift sarmallı DNA parçalarından oluşan QC'ler, dinamik aralığı ve duyarlılığı tanımlamak ve doğruluğu ve hassasiyeti değerlendirmek için 29,30,31,32 kullanılmıştır. QC konsantrasyonlarının seçimi, öncelikle belirli bir konsantrasyondaki bir kuyu içindeki pozitifin toplam damlacıklara beklenen oranına dayanıyordu. Matematiksel olarak, ddPCR, bölümlerin yaklaşık% 80'i pozitif olarak çoğaldığında teorik olarak en doğrudur. Pozitif-toplam damlacık oranı 0.8'in üzerine çıktıkça, bölümlerin doygunluğu nedeniyle doğruluk azalır, damlacıkların% 100'ü pozitif olduğunda nicelleştirme mümkün değildir. Düşük uçta, teorik olarak, bir pozitif damlacık kadar az tespit edilebilir ve nicelleştirilebilir, ancak doğruluk daha zayıftır ve tahlil düşük seviyeli yanlış pozitiflere tabidir. Tipik olarak, bir sonucun %95 güvenle hesaplanması için en az üç damlacık pozitif olmalıdır, bu da burada kullandığımız bir konsantrasyonu hesaplamak için eşiktir.

Beş farklı QC konsantrasyonundan oluşan bir dizi hazırlandı ve hesaplanan hedef kopya sayısı / μL PCR reaksiyon hacimlerinin, Tablo 5'te gösterildiği gibi, ölçülebilir ddPCR aralığını kapsayan toplam damlacık oranlarına pozitif çıkması bekleniyordu. Bunlar, tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanıldı. Buradaki değerlendirmede, nicelemenin üst ve alt sınırları ddPCR'de mümkün olan teorik maksimuma itilmemiştir. Doğru niceleme, burada gösterilenden daha yüksek ve daha düşük seviyelerde mümkün olabilir. Aralık, bu yöntemin çıkış yönündeki uygulamalarla uyumlu olarak geliştirilmelidir.

Bu QC'lerin toplam üç bağımsız olarak hazırlanmış seyreltme serisi, tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti değerlendirmek için her parti için numune seyreltme tamponunda hazırlanmıştır. Her QC seyreltmesinin yinelenen kuyuları dahil edildi. Gerçek bir doğrulama protokolünü simüle etmek için, birden fazla analist tarafından birkaç gün boyunca toplam altı doğruluk ve hassasiyet partisi gerçekleştirildi. Bu altı partiden elde edilen sonuçlar, yöntemin tahlil içi ve tahliller arası doğruluğunu ve hassasiyetini tanımlamak ve tahlilin dinamik aralığını tanımlamak için analiz edilmiştir.

Her QC seviyesindeki her parti için tahlil içi performans değerlendirildi. Tüm QC ve NTC kuyularının en az 10.000 damlacık içermesini bekliyorduk. Bu, altı partinin tamamında test edilen 216 kuyudan 216'sında, ortalama damlacık sayısı 19.748 damlacık / kuyu ile karşılandı (Tablo 6). Daha sonra, her bir QC'nin her bir yinelenen kuyu kümesinin kuyular arası %CV'sinin, %≤30,0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, %≤25,0 olması bekleniyordu. Bu, QC'ler için altı partinin tamamında test edilen 90 kuyudan 90'ından oluşan setlerde karşılandı ve tüm QC seviyelerinde ortalama% 3.9'luk bir kuyular arası CV ile karşılandı (Tablo 7). Tüm QC'ler, yukarıda özetlenen beklenen aralıklarda toplam damlacık oranlarına ortalama pozitif sonuç vermiştir (Tablo 6).

Her parti içinde, bağımsız olarak hazırlanan seyreltme serisi noktalarının her biri için tahlil içi ortalama ve standart sapma hesaplandı ve bunlar, her tahlildeki her konsantrasyon için bir tahlil içi ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Bu, tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 8). Hassasiyet, normal tahlil koşulları altında aynı homojen numunenin replikalarından elde edilen verilerdeki değişkenliği ifade eder ve çoklu dahil edilen alikotların %CV'si hesaplanarak değerlendirilir. Her partide test edilen üç alikotun, %30,0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, tahlil içi %CV ≤≤ %25,0 vermesini bekledik. Bu, 60 partinin her birinde beş QC seviyesinin tümü için karşılandı (toplam 30 performanstan 30'u). Genel olarak, hedef kriterlerden daha fazla tahlil içi hassasiyet elde edilebilir, tüm QC seviyelerinde ortalama tahlil içi %7,7 CV ile. Doğruluk, deneysel olarak belirlenen değer ile nominal değer arasındaki anlaşmanın yakınlığını ifade eder. Bu, her bir QC'nin hesaplanan konsantrasyonları ile teorik olarak beklenen nominal konsantrasyonları arasındaki göreceli hata yüzdesinin (%RE veya %Bias) hesaplanmasıyla değerlendirilir. Üç alikotun tahlil içi ortalamasının, %±30.0'ının beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, nominal konsantrasyonun %±25.0 RE'si olması bekleniyordu. Bu, 60 partinin her birinde beş QC seviyesinin tümü için karşılandı (toplam 30 performanstan 30'u). Genel olarak, tüm QC seviyelerinde ortalama mutlak tahlil içi %4,2 RE ile hedefimizden daha fazla tahlil içi doğruluk elde edilebilir. NTC'nin tüm performanslarında (toplam 30), pozitif damlacıklar tespit edilemedi.

Tahliller arası doğruluk ve hassasiyet, her parti içindeki her QC seviyesinin tahlil içi ortalaması kullanılarak da hesaplanmıştır. Tahliller arası hassasiyetin, %30,0 beklenen üst ve alt sınır QC hariç, %≤≤25,0 CV olması bekleniyordu. Benzer şekilde, tahliller arası doğruluk için±,% 30.0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç,% 25.0 RE ± bekleniyordu. Bu hedeflerden önemli ölçüde daha yüksek bir tahlil doğruluğu ve hassasiyeti gözlenmiştir (Tablo 9), tahliller arası hassasiyet %4,0 ila %8,5 arasında değişmekte ve tahliller arası mutlak doğruluk %1,0 ila %3,2 arasında değişmektedir. Toplu olarak, bu sonuçlar, bu yöntemin mevcut endüstri hedefleri dahilinde yeterli tahlil içi ve tahlil doğruluğu ve hassasiyeti elde edebileceğini göstermektedir. Bu tahlilin PCR reaksiyonunun μL başına 2.500-2.5 kopyalık dinamik bir aralığı, bu sonuçlara dayanarak, PCR reaksiyonunun μL başına 2.5 kopyalık bir genel tahlil duyarlılığı ile tanımlanabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, daha geniş dinamik aralıkları doğrulamak mümkün olabilir.

Daha sonra, hedef matris içindeki tahlil doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek gerekiyordu - bu durumda gözyaşları. Tipik olarak, tahliller klinik çalışmaların başlatılmasından önce doğrulanır, yani vektörle tedavi edilen hastalardan toplanan gözyaşlarının doğrulama amacıyla mevcut olması muhtemel değildir. Bu, hedef AAV vektörünü, matris çivili QC'ler oluşturmak için gönüllü bağışçılardan toplanan gözyaşlarına sokarak yapay olarak oluşturulabilir. İlke kanıtı için, ticari bir kaynaktan elde edilen eGFP eksprese eden bir AAV2 vektörü kullanılmıştır. AAV2 vektör stoğunun konsantrasyonu, bu protokolde açıklandığı gibi, bir DNA izolasyon adımı kullanılmadan, ddPCR kullanılarak ampirik olarak belirlendi. Her çalışmada, AAV2 bağımsız olarak yüksek (beklenen 1.41 x 10³ kopya / μL PCR reaksiyonu) ve düşük (28.2 kopya / μL PCR reaksiyonu) seviyesinde üç gözyaşı alikotuna çivilendi. Çivili olmayan alikotlar, yöntemin özgüllüğünü göstermek için bir kontrol olarak dahil edildi.

Her parti için her ani artış seviyesinde tahlil içi performans değerlendirildi. Tüm gözyaşı örneklerinin en az 10.000 damlacık içermesi bekleniyordu. Bu, altı partinin tamamında test edilen 108 kuyudan 108'inde karşılandı ve ortalama toplam damlacık sayısı 20.208 damlacık / kuyu idi (Tablo 10). Daha sonra, her bir QC'nin her bir yinelenen kuyu setinin kuyular arası %CV'sinin, yüksek ve düşük başak seviyeleri için% ≤25.0 olması bekleniyordu. Bu, QC'ler için altı partinin tamamında test edilen 36 kuyu setinden 36'sında, ortalama kuyular arası %3,2 CV ile karşılanmıştır (Tablo 11).

Her parti içinde, bağımsız olarak hazırlanan gözyaşı sivri uçlarının her biri için tahlil içi ortalama ve standart sapma hesaplandı ve bunlar, her tahlildeki her konsantrasyon için bir tahlil içi ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Bu, matristeki tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 12). Tahlil içi %CV'nin %≤25.0 ve yüksek ve düşük spike seviyeleri olmasını bekledik. Bu, her seviye için altı partiden altısında karşılandı. Genel olarak, matriste hedeften daha fazla tahlil içi hassasiyet elde edilebilir, ortalama tahlil içi %3,7 CV yüksek seviyede %3,7 ve düşük seviyede %12,2 (genel olarak %8,0). Ayrıca, tahlil içi %RE'nin her iki ani yükseliş seviyesinde de %±25.0 olması bekleniyordu. Bu, her seviye için altı partiden altısında karşılandı. Benzer şekilde, genel olarak, matriste hedeften daha fazla tahlil içi doğruluğun elde edilebildiği, ortalama tahlil içi mutlak %RE'nin düşük seviyede %8,1 ve yüksek seviyede %11,3 (genel olarak %9,7) olduğu bulunmuştur. Çivilenmemiş kontrol için, alikotların hiçbirinde (Tablo 12) hiçbir eGFP sinyali tespit edilememiştir, bu da insan gözyaşı matrisindeki yöntemin özgüllüğünü göstermektedir.

Gözyaşı matrisindeki tahliller arası doğruluk ve hassasiyet, her bir partideki her bir başak seviyesinin tahlil içi ortalaması kullanılarak da hesaplanmıştır. Tahliller arası hassasiyetin %≤25.0 CV olması bekleniyordu ve tahliller arası doğruluk için %25.0 RE ± bekliyorduk. Bu hedeflerden önemli ölçüde daha yüksek bir tahlil doğruluğu ve hassasiyeti gözlenmiştir (Tablo 13), yüksek seviyede %5,5 ve düşük seviyede %7,1'lik bir tahliller arası hassasiyet ve yüksek seviyede %11,3 ve düşük seviyede %8,1'lik mutlak tahliller arası doğruluk ile. Toplu olarak, bu sonuçlar gözyaşı matrisindeki yöntemin doğruluğunu, hassasiyetini ve özgüllüğünü göstermektedir.

Tablo 5: Tahlilin dinamik aralığını tanımlamak için kullanılan kalite kontrolleri. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 6: Toplam damlacık sayıları ve sentetik çift sarmallı DNA kalite kontrolü ve NTC'nin pozitif-toplam damlacık oranları. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 7: QC kuyular arası istatistikler (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 8: QC'lerin tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 9: QC'lerin tahliller arası doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 10: Gözyaşı örneklerinin toplam damlacık sayıları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 11: Gözyaşı örneği kuyular arası istatistikler (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 12: Gözyaşı numunelerinin tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 13: Gözyaşı numunelerinin tahliller arası doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Bu çalışmada kullanılan primer, problar ve sentetik çift sarmallı DNA kalite kontrol dizileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

ddPCR protokolünün, tahlilin uygun performansı için kritik olan birkaç adımı vardır. İlk kritik adım, astarların ve probun tasarımı ve optimizasyonudur. Genel olarak, hidroliz probu bazlı kimyanın boya bazlı kimya (örneğin, SYBR Green) üzerinde klinik öncesi veya klinik bir ortamda kullanılması, üstün özgüllükleri nedeniyle tavsiye edilir. Ek olarak, amplifikasyon hedefinin seçimi kritik bir konudur. Tipik olarak, vektörün ilgilendiği transgen hedeflenir. Bununla birlikte, daha erken klinik öncesi aşamalarda veya vektör transgenini genomik DNA'ya karşı ayırt etmenin mümkün olmadığı vektörlerde, standartlaştırılmış vektör hedeflerinin kullanılması uygun olabilir. Örneğin, ters çevrilmiş terminal tekrarlama bölgesini, promotörü, poli-A kuyruğunu veya bu vektör bileşenleri arasındaki segmentler arası kavşakları hedefleyebilir. Hedef seçimi vektör tasarımına göre değişecektir. Geleneksel qPCR primer ve prob tasarım stratejileri ve yazılımları genellikle ddPCR için uygundur. Gerekli optimizasyon miktarını azaltmak için tutarlı bir tavlama sıcaklığı (örneğin, 60 ° C) vermesi beklenen tasarım parametreleri seçilmelidir. Ayrıca, her hedef için en az üç farklı kümenin tasarlanması, sıralanması ve değerlendirilmesi önerilmiştir. Daha sonra en büyük özgüllüğü (negatif kontrol kuyusunda veya ilgili hedef DNA'nın matrisinde amplifikasyon yok) ve duyarlılığı (yani, algılama sınırı) gösteren küme ^{seçilmelidir20}.

Testi qPCR ve ddPCR arasında geçirebilmek avantajlıysa, önce qPCR kullanarak tahlil koşullarının optimize edilmesi ve seçilen set için R² ≥ 0.98 ile% 90 -% 110 amplifikasyon verimliliği ile sonuçlanan koşulların belirlenmesi önerilir. Bununla birlikte, bir uç nokta yöntemi olarak ddPCR, amplifikasyon verimliliklerindeki farklılıklar nedeniyle tipik olarak qPCR'den daha az hassastır. En azından, tavlama/uzatma adımında, beklenen tavlama sıcaklıklarının üzerindeki ve altındaki sıcaklıkları kapsayacak ve negatif ve pozitif damlacık kümeleri arasındaki yağmur ve floresan genlik ayrımını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değerlendirmek için bir termal sıcaklık gradyanı çalıştırılması önerilir. Çalışma alanı izin veriyorsa, ana karışım hazırlama, şablon ekleme ve yükseltme için ayrı ayrı özel iş istasyonlarına sahip olmanız önerilir. Mümkün olduğunda, çapraz kontaminasyon ve yanlış pozitiflik riskini azaltmak için bunlar kontrollü erişim ve diferansiyel hava basınçları gibi yerleşik mühendislik kontrollerine sahip tek yönlü bir iş akışı ile fiziksel olarak ayrılmalıdır. Bu mümkün değilse, çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkatli olunmalıdır.

Bu protokolde, qPCR testi geliştirmeye daha alışkın olanlara alışılmadık görünebilecek iki adım vardır. Birincisi, PCR ana karışımına bir kısıtlama enziminin dahil edilmesidir. ddPCR amplifikasyonu sırasında, her damlacık uç noktaya termosiklüs edilir. Düzgün bir şekilde optimize edilmiş bir tahlilde, bu, iki damlacık popülasyonu ile sonuçlanır, bir set sürekli olarak yüksek düzeyde floresan sinyalleri (pozitifler) gösterirken, diğeri sürekli olarak düşük seviyede floresan sinyali (negatifler) gösterir. PCR girişimi meydana gelirse, PCR amplifikasyonunun başlatılmasını senkronize edebilir, bu da damlacığın bir amplifikasyon platosuna ulaşmamasına ve dolayısıyla tutarsız floresan uç noktalarına neden olabilir. Bu durumda, damlacıklar negatifler ve pozitifler arasında dağılacak ve ddPCR yağmuru adı verilen bir fenomenle sonuçlanacaktır. Bu, hedefin yanlış ölçülmesine ve tutarsız ve öznel olarak uygulanan eşiklere neden olabilir. Eşiği NTC'nin sinyalinin biraz üzerine ayarlama önerimiz, tüm damlacıklar son noktaya tam olarak çevrilmemiş olsa bile, tüm damlacıklar hala pozitif olarak kabul edildiğinden, nihai nicelemede yağmurun etkilerini en aza indirgemelidir. AAV'ler, amplifikasyon hedefine bağlı olarak, primerlere ve problara erişilebilirliği azaltabilecek, PCR parazitine ve dolayısıyla yağmura neden olabilecek oldukça karmaşık bir ikincil yapıya sahiptir. Restriksiyon enziminin ana karışıma dahil edilmesi, primerlerin ve probların erişimini arttırmak için bu ikincil yapıyı ayırır, yağmuru azaltır, böylece tahlilin doğruluğunu artırabilir. ddPCR reaksiyonuna bir restriksiyon enziminin dahil edilmesinin etkileri daha önce^25,32 olarak tanımlanmıştır. Herhangi bir kısıtlama enzimi, hedef amplifikasyon bölgesi içinde kesilmediği doğrulandığı sürece kullanılabilir. Ön sindirim adımlarına veya alternatif tampon bileşimlerine gerek yoktur.

İkinci olağandışı adım, AAV içeren gözyaşı örneğinin hazırlanmasıdır. Bu protokolde, 1:10 (veya daha büyük) gözyaşı oranı kullanıldı ve daha sonra numune ısıtıldı. Tipik olarak, gözyaşları yaygın olarak kullanılan bir toplama yöntemi olan kılcal bir tüp aracılığıyla toplandığında, ortalama olarak yaklaşık 10.0 μL toplanabilir³³. Seyreltme, sınırlı numune hacminin ele alınmasına yardımcı olur ve yinelenen kuyu testi için yeterli malzeme sağlar. Bu, algılamanın teorik sınırını azaltırken, ddPCR'nin sağlam hassasiyeti, son derece az sayıda vektör parçacığı dışında hepsinin algılanmasıyla sonuçlanmalıdır. Bu yaklaşım ayrıca, beklenmedik bir şekilde başarısız olması durumunda bir "yedekleme" kuyusu oluşturur. Bu durumda veya iki kuyucuğu çalıştırmak için yetersiz numune hacmi durumunda, hassasiyeti değerlendirmek için Poisson hatası kullanılabilir. Ayrıca, konsantrasyonun tespit sınırının altında olduğu durumlarda, bir konsantrasyonu belirlemek için iyi verileri birleştirme fırsatı yaratır. ddPCR tespiti için AAV vektörlerinin viral kapsidlerden serbest bırakılması gerekir. AAV'nin nicelleştirilmesi için bazı yöntemler, viral kapsid^34,35,36'yı çıkarmak için bir proteinaz K sindirim adımı içermektedir. Doğal olarak oluşan tüm AAV serotipleri, çoğu 80 ° C'nin altına düşen, yaklaşık 90 ° C'de veya altında erime sıcaklıklarına sahiptir; bu nedenle, bu gereksiz bir dahil etme^{gibi görünmektedir 37}. Tek başına ısıtma, vektör DNA'sını serbest bırakmak için yeterli görünmektedir.

Ayrıca, ddPCR genellikle bir qPCR testini etkileyebilecek bir numunede bulunabilecek PCR inhibitörlerine karşı daha az hassastır. Belirli bir DNA izolasyon adımı dahil edilirse, bu aynı zamanda bu protokolde kaçınılan spesifik doğrulama gerektirir. Numuneler, vektör genomlarının bir sıvı içindeki difüzyonunun kinetiği nedeniyle ısıtmadan önce seyreltilir. Isıtma ve müteakip soğutma işlemi sırasında, tek sarmallı DNA genomunun pozitif ve negatif duyu iplikçikleri, konsantrasyonlar yeterince yüksekse, çift sarmallı bir ara ürün üretmek için birlikte tavlanabilir. Isıtmadan önce seyreltme, konsantrasyonları azaltır ve nicelemenin doğruluğu üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olmak için yeterli çift sarmallı ara ürünlerin oluşmasını matematiksel olarak olası kılmaz. Kalite kontrol olarak kullanılan sentetik DNA fragmanlarının veya doğrusallaştırılmış plazmidlerin bu ısıtma adımından geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır. Bunlar çift sarmallı olduğundan, ısıtma tek sarmallı ara ürünlere dönüşümle sonuçlanır. Bu tek sarmallı QC'lerin damlacıklara bağımsız olarak bölünmesinin ardından, bunun nominal konsantrasyona göre QC konsantrasyonunda iki kat artışa neden olması beklenir. Alternatif olarak, QC'ler yöntemi standartlaştırmak için ısıtılacaksa, bu, nominal bir konsantrasyonun yeniden yapılandırılması ve atanması için hesaba katılmalıdır.

Son olarak, numune hazırlama ile ilgili olarak, birçok protokol, kapsüllenmemiş vektör DNA'sını çıkarmak için bir DNaz tedavi adımının dahil edilmesini de önermektedir. Bu adım, vektör preparasyonu ile ilişkili serbest DNA'nın nicelleştirilmesinin istenmediği durumlarda kritik öneme sahiptir (dozaj amacıyla nicelleştirme sırasında olduğu gibi). Bununla birlikte, biyodağılım ve biyodökülme çalışmaları bağlamında, tipik olarak, kapsüllenmiş olup olmadığına bakılmaksızın, herhangi bir vektör DNA'sının nereye gittiğini bilmek istenir. Bu nedenle, bu tür çalışmalar sırasında tipik olarak bir DNaz tedavi adımı gerçekleştirilmemesi önerilmektedir. Bir DNaz adımının dahil edilmesinin gerekli olduğu belirlenirse, bu adım seyreltme ve ısıtmadan önce olmalıdır.

Bu yazıda, yöntemin dinamik aralığının, duyarlılığının, doğruluğunun ve hassasiyetinin amaca uygun, iyi laboratuvar uygulamalarına uygun bir doğrulama bağlamında değerlendirilmesine yönelik yaklaşımı temsil eden veriler sunulmuştur. Bu konudaki mevcut rehberlik eksikliği, mevcut endüstri düşüncesine uygun olarak, kendileri için hedef tahlil kriterlerini belirlemek için doğrulama laboratuvarlarını bırakmaktadır. Farklı gruplar bu çalışmada kullanılandan hem daha yüksek hem de daha düşük hedef kriterler ortaya koymuştur 19,20,21,22,23,24,25. Hedef tahlil kriterleri, daha katı bir şekilde tanımlanana kadar, yöntemin amaçlanan klinik uygulamalarına dayanarak validasyondan önce seçilmelidir. Verilere dayanarak verilecek aşağı akış kararlarına bağlı olarak, daha yüksek doğruluk ve hassasiyet seviyelerine ihtiyaç duyulabilir. Tersine, basit bir pozitif ve negatif sonuç yeterli olabilir.

Yaklaşım ayrıca özgüllüğün ve matris etkisinin değerlendirilmesi için önerileri de ele aldı. Tedavi edilmemiş bireylerden toplanan bir gözyaşı havuzu bu tahlilde olumlu bir sonuç veremedi, oysa vektör önerilen iyileşme oranları içinde yüksek ve düşük bir konsantrasyonda gözyaşlarına çivilendiğinde hedef tespit edilebildi. İdeal olarak, endojen vektör içeren matris (örneğin, viral vektör ile tedaviden sonra toplanan) da bu değerlendirmelere dahil edilecektir. Ancak, bu tür örneklerin bir doğrulamada kullanılmak üzere mevcut olması olası değildir. Doğrulamanın sağlamlığını arttırmak için, hastaya özgü bir matris etkisinin meydana gelip gelmediğini belirlemek için birden fazla gözyaşı havuzu veya çeşitli bireylerden toplanan gözyaşları değerlendirilebilir. Son olarak, kararlılığın değerlendirilmesi önerilir. DNA ekstraksiyonunun biyolojik matristen gerçekleştiği iş akışlarında, hem numunenin hem de ekstrakte edilen DNA'nın stabilitesini değerlendirmek gerekebilir. Bu iş akışında, numune DNA ekstraksiyonuna gerek kalmadan doğrudan tahlilde test edilir. Bu nedenle, bu yöntem için stabilitenin değerlendirilmesi göz önüne alındığında, gözyaşı örneklerinin stabilitesinin değerlendirilmesi gerekir. Tipik olarak, tezgah üstü, buzdolabı, donma/çözme ve uzun vadeli stabilite değerlendirmeleri önerilir. Bunlar bu çalışmanın bir parçası olarak gerçekleştirilmemiştir, ancak burada geliştirilen yöntemler, giriş örneklerine yapılan manipülasyonları takiben bu değerlendirmede kullanılabilir.

Genel olarak, bu yöntemin gözyaşı örneklerinde AAV tabanlı vektörleri tespit etmek için sağlam, tekrarlanabilir ve doğrulanabilir bir test olduğu gösterilmiştir. Klinik çalışmaları desteklemek için belirli vektörlere uyarlanacak bir platform görevi görebilir ve iyi laboratuvar uygulamalarıyla tutarlı bir tahlilin doğrulanması için bir temel sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV-eGFP Vektör	Charles River Laboratuvarları	RS-AAV2-FL	Lot AAV2-0720-FL, prensip kanıtı olarak kullanılan vektör
AutoDG Damlacık Dijital PCR sistemi	Bio-Rad	QX200	Alternatif ddPCR sistemi, üreticinin takdirine bağlı olarak kullanılabilir. s protokolü.
Bio-Rad Probları için AutoDG Yağı		1864110	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
Bio-Rad Probları için ddPCR Tampon Kontrolü		1863052	Veya ddPCR sistemi ve PCR kimyası ile uyumlu malzeme kullanın.
ddPCR Damlacık Okuyucu Oil	Bio-Rad	1863004	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
ddPCR Delinebilir Folyo Contalar	Bio-Rad	1814040	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
ddPCR Plakaları 96 Kuyulu, Yarı Etekli	Bio-Rad	12001925	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok)	Bio-Rad	1863023, 1863024 veya 1863025	Primerler/problar ve ddPCR sistemi ile uyumlu ana karışım kullanın.
DG32 AutoDG Cartidges	Bio-Rad	1864108	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
Damlacık Okuyucu	Bio-Rad	QX200	Alternatif ddPCR sistemi, üreticinin isteğine bağlı olarak kullanılabilir s protokolü.
GeneAmp PCR Tampon Uygulamalı	Biyosistemler	N8080129	N/A
Nükleaz İçermeyen Su	Ambion	AM9906	N/A
PCR Plaka Kapatıcı	Bio-Rad	PX1	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
Bio-Rad	1864120	için Pipet Uçları	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.
Pluronic F-68 İyonik Olmayan Yüzey Aktif Madde	Gibco	24040	N/A
Astar ve Hidroliz Probları	Astar		/prob tasarımı için genel yaklaşımları kullanarak hedef diziye dayalı Çeşitli Tasarımlar. ddPCR sistemi ile uyumlu florforları ve söndürücüleri seçin.
Restriksiyon Enzimi	Çeşitli	Hedef	amplifikasyon sekansına göre değişir. Amplifiye edilmiş dizide kesmeyen kısıtlama enzimi kullanın
Kesilmiş somon sperm DNA'sı	ThermoFisher	AM9680	N/A
Sentetik DNA gen fragmanı veya doğrusallaştırılmış plazmit	Çeşitli	Çeşitli	Tasarım Kalite kontrol olarak kullanılmak üzere hedef amplifikasyon bölgesini içeren sentetik bir DNA parçası
TE Tamponu	Teknova	T0224	Hazırlandığından veya satın alındığında nükleaz içermediğinden emin olun. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0
Dokunmatik Termal Döngüleyici	Bio-Rad	C1000	Veya ddPCR sistemi ile uyumlu malzeme kullanın.