Summary
Øget påvisning af umodne tephritid frugtfluer i marken kan udløse rettidig indsats for at eliminere populationer af disse destruktive skadedyr. Det er hurtigere og mere præcist at opdage sene stjernelarver, når man moser værtsfrugt i en pose og fører frugtkødet gennem en række sigter end håndskæring og visuel inspektion.
Abstract
Frugtfluer af familien Tephritidae er blandt de mest destruktive og invasive skadedyr i landbruget i verden. Mange lande gennemfører dyre udryddelsesprogrammer for at eliminere begyndende befolkninger. Under udryddelsesprogrammer gøres der en samordnet indsats for at opdage larver, da dette stærkt indikerer en ynglende population og hjælper med at fastslå angrebets rumlige omfang. Påvisning af umodne livsstadier udløser yderligere bekæmpelses- og reguleringsforanstaltninger for at inddæmme og forhindre yderligere spredning af skadegøreren. Traditionelt opnås larvedetektion ved at skære individuelle værtsfrugter og undersøge dem visuelt. Denne metode er arbejdskrævende, da kun et begrænset antal frugter kan behandles, og sandsynligheden for at mangle en larve er høj. En ekstraktionsteknik, der kombinerer i) mushing værtsfrugt i en plastikpose, ii) silning af papirmasse gennem en række sigter, iii) placering af tilbageholdt papirmasse i en brun sukkervandopløsning og iv) indsamling af larver, der flyder til overfladen, blev testet. Metoden blev evalueret i Florida med feltindsamlet guava naturligt inficeret af Anastrepha suspensa. For at efterligne lave populationer, der var mere repræsentative for et udryddelsesprogram for bananfluer, blev mango og papaya på Hawaii inficeret med et kendt, lavt antal Bactrocera dorsalis larver. Metodens anvendelighed blev testet i marken på guava, der naturligt er inficeret af B. dorsalis for at evaluere metoden under forhold, som arbejdere oplever under et nødfrugtflueprogram. I både felt- og laboratorieforsøg var mushing og sigtning af papirmassen mere effektiv (krævede mindre tid) og mere følsom (flere larver fundet) end at skære frugt. Flydende papirmasse i brunt sukkervandsopløsning hjalp med at opdage tidligere stjernelarver. Mushing og sigtning af frugtmasse af vigtige tephritid-værter kan øge sandsynligheden for at detektere larver under nødprogrammer.
Introduction
Tephritid frugtfluer er blandt de mest ødelæggende landbrugs skadedyr, hvor slægterne Anastrepha, Bactrocera og Ceratitis udgør den største risiko1. Mange områder er i høj risiko for eksotisk frugtflueetablering baseret på 1) historiske indtrængen og tilhørende afgrænsnings- og udryddelsesprogrammer, 2) den høje ankomstrate for frugtflueværtsmateriale i indgangshavne og 3) klimatiske forhold, der er gunstige for etablering af reproducerende populationer. Staten Californien oplever flere indtrængen og påvisninger af tephritider årligt2. Der har været mere end 200 angreb og udryddelsesprogrammer mod tephritider globalt i løbet af det sidste århundrede, og dette er accelereret betydeligt i de seneste årtier3. Selvom langt de fleste af disse programmer har succes med at udrydde den invaderende bananflue3,4, forbliver den økonomiske og miljømæssige byrde af disse invasioner stadig høj, og muligheden for etablering er altid til stede; et nyligt katastrofalt eksempel er infektionen af Bactrocera dorsalis på det afrikanske kontinent5.
Under nødfrugtflueprogrammer gøres der en samordnet indsats for at opdage og kontrollere ynglepopulationer af de invaderende arter. For eksempel reagerer staten Florida på tephritid-indtrængen ved at anvende jorddrenches (under dryplinjen af frugtbærende værtsplanter) og fjerne værtsfrugt i en radius på 200 m omkring steder, hvor parrede hunner og / eller larver findes6. Disse handlinger og taktikker tjener til at dræbe larver og pupper i jorden og fjerne æg og larver fra frugt i området. I nogle udryddelsesprogrammer fjernes en betydelig mængde værtsfrugt. I 2015 blev over 100.000 kg frugt ødelagt under B. dorsalis udryddelsesprogrammet i Florida6. De økonomiske tab for avlere og tilknyttede industrier alene i karantæneområdet blev anslået til at være over $ 10.7 millioner7.
For at finde tephritidlarver i karantæneområderne indsamler et lille team entomologer værtsfrugter i en radius på 200 m omkring et hunfluedetekteringsområde og skærer og inspicerer visuelt hver frugt for larver6. Med begrænsede personaleressourcer og hundredvis af mulige værter bliver opgaven vanskelig, især i de områder, hvor plantediversiteten i både kommercielle produktionsområder og boligværfter er høj. Derudover kan larver blive savnet, når de skærer værtsfrugter. I en undersøgelse, der evaluerede frugtskæring i indgangshavnene, viste det sig, at skæring af frugt ikke var så effektiv til at detektere A. suspensa sammenlignet med at holde de inficerede frugter i flere uger og tælle larverne og pupperne, der findes i puppesubstratet8.
Der er alternativer til frugtskæring til påvisning af et angreb 9,10,11,12,13. For eksempel er en flydende brunt sukker og en varmtvandsmetode begge accepterede procedurer, der bruges til at detektere vestlige kirsebærfrugtfluer i høstede kirsebær 9,10. Den brune sukkermetode indebærer at placere knust frugt i sukkervandopløsning og samle larver, der flyder til toppen. Flydemetoden med brunt sukker blev udviklet specifikt for at opfylde lovgivningsmæssige regler for eksporterede kirsebær, som kræver, at pakkerier overvåger for karantæne frugtflue skadedyr. Der er også et godkendt amerikansk-Canada blåbærcertificeringsprogram, der inkluderer flydende vand med brunt sukker, saltvandsflydeevne eller kogning for at understøtte fytosanitet14. Ved test af nøjagtigheden af sukker og varmtvandsflød brugte forskere sigtemetoden til at bestemme, hvor mange larver der savnes 9,10,11,12,13. En undersøgelse viste, at blanding af knuste blåbær i en saltopløsning og filtrering af opløsningen gennem et genanvendeligt kaffefilter var fire gange bedre til at detektere Drosophila suzukii-larver end visuelt at inspicere overfladen af salt- og sukkeropløsninger14. Derudover blev gaskromatografi anvendt til påvisning af A. suspensa larver i citrus15. Disse metoder er ikke blevet testet for anvendelighed i feltundersøgelser.
Vores mål var at udvikle og teste en metode til at finde tephritidlarver i marken ved hjælp af sigtning og flydende sukkervand. Denne metode muliggør en mere effektiv påvisning af umodne bananfluer end den traditionelle frugtskæringsmetode, hvilket understøtter rettidig kontrol af avlspopulationer under udryddelsesprogrammer for bananfluer.
Protocol
1. Valg af frugt
- Bestem, hvilken frugt der er tilgængelig i det område, der skal undersøges.
- Vælg værtsfrugt baseret på listen over kendte værter for måltephritid-arten.
- Vælg blød kød, moden frugt, såsom mango, papaya og guava. Umodne eller hårdkødede frugter, såsom tropiske mandler, bør inspiceres med en anden metode, såsom frugtskæring.
- Vælg falden, overmoden frugt eller moden frugt på træer, der har tegn på skade, oviposition ar og bløde pletter.
- Forarbejd ca. 2 liter frugt på én gang (f.eks. 5 guavaer eller 5 mellemstore mangoer udgør tilstrækkelige prøver til denne metode). Antallet af frugter, der kan behandles på én gang, afhænger af frugternes størrelse (figur 1A).
2. Mushing
- Skær frugten i store stykker og læg den i en 4 L opbevaringspose med lynlås (figur 1B).
- Tilsæt vand i posen, indtil vandet dækker den hakkede frugt med 25-50 mm (figur 1C).
- Klem forsigtigt frugten med hånden, indtil al frugtkødet har løsnet sig fra skrællen og har en glat konsistens (dvs. ingen store bidder) (figur 1D).
3. Sigtning til sen instar indsamling
- Stak sigterne. Brug store sigter (457 mm diameter) til behandling af store mængder frugt (~ 5 frugter på én gang) og mindre sigter (305 mm diameter) til individuelle frugter eller mindre prøver (< 5 frugter).
- Sigten stables med en stor maskesigte (nr. 8; 2,36 mm) oven på en lille maskesigte (nr. 20; 0,85 mm). Til påvisning af tidlige stjerner anbringes en tredje sigte (nr. 45; 0,35 mm) i bunden af stakken (figur 1E).
- Hæld papirmassen i den øverste sigte (figur 1F).
- Papirmassen vaskes grundigt gennem stakken af sigter med vand fra en vandhane, slange eller en flaske, indtil den fine papirmasse har passeret gennem sigterne (figur 1G).
- Scan visuelt de øverste sigter for sene stjernelarver, der kan have været tilbageholdt med skrællen eller store stykker frugt (figur 1H).
- Kontroller omhyggeligt den anden sigte for sene stjernelarver. Med store mængder finmasse kan yderligere skylning være nødvendig.
- Saml larver fra sigterne med larvetang og læg dem i hætteglas med 70% EtOH.
4. Sukker floatation til tidlig instar indsamling
- Bland sukkeropløsningen ved at opløse 453 g (1 kasse) mørkebrunt sukker i 2 liter postevand, hvilket giver en Brix-aflæsning på 19°10.
- Papirmassen vaskes fra de finmaskede sigter (f.eks. nr. 20 og nr. 45) til kanten af sigten med postevand, og materialet flyttes derefter til en plastskål (11 L).
- Tilsæt opløsningen af brunt sukker, indtil den dækker papirmassen med 25-50 mm, og tilsæt 2 dråber skumdæmper. Lad papirmassen sidde i brunsukkeropløsningen i ca. 5 min.
- Saml larver, der flyder til overfladen af opløsningen med larvetang i hætteglas med 70% EtOH.
5. Larve kuration
- Mærk et hætteglas med afhentningssted, dato, frugttype og samler til senere undersøgelse og identifikation.
Representative Results
Tidlig og sen stjerne Anastrepha suspensa ekstraktion fra markindsamlet frugt
I dette eksperiment har vi sammenlignet frugtskæringen og mushing, sigtning og flydende (MSF) metoder med hensyn til andelen af larver, der opdages, og den gennemsnitlige tid, der kræves for at opdage dem. Guava, stærkt inficeret med larverne af Anastrepha suspensa, blev indsamlet fra en plante beliggende ved University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. Frugten blev tilfældigt sorteret i grupper på 5 og tildelt 1 af 2 larveekstraktionsmetoder: 1) håndskæring eller 2) MSF-metoden. Tiden til at samle alle larverne, der var synlige for det blotte øje ved hjælp af hver ekstraktionsmetode, blev registreret.
Håndskæringsmetoden fulgte den metode, der i øjeblikket anvendes i et udryddelsesprogram. Hver af de 5 arbejdere (n = 5) blev tildelt 5 frugter til at søge efter alle stadier af larver ved at skære frugterne i mindre stykker og visuelt inspicere papirmassen. For at afgøre, om larver blev savnet i den visuelle inspektion, blev de håndskårne frugtstykker inspiceret igen ved hjælp af et dissekerende mikroskop (10x).
Til MSF-metoden blev 5 frugter skåret i store stykker (50-80 cm), anbragt i lynlåsposer og presset forsigtigt i hånden, indtil al papirmassen blev løsnet fra skrællen, og papirmassen havde en glat konsistens (dvs. ingen store bidder). Den musede frugt blev silet gennem en række store (45,7 cm) messingsigter. Den største maske (nr. 8) blev stablet på toppen, efterfulgt af et nummer nr. 20 og en nr. 45 maskesigte. Det personale, der var tildelt denne behandling, vaskede papirmassen gennem masken ved hjælp af vand fra en slange, der var forbundet til en håndvaskhane. De sene stjernelarver var tydelige i sigterne. De mindre stjerner blev blandet med papirmasse, hvilket gjorde dem vanskelige at se og fjerne. Derfor blev pulp/larve-blandingen fra sigterne lagt i spande med 1 liter brun sukkervandsopløsning. Larverne flød straks til overfladen. Opløsningen blev forsigtigt omrørt, og efter 5 minutter blev larverne fjernet fra spandene og talt. Tiden til at behandle frugten var en kombination af mushing, sigtning og fjernelse af larverne fra sukkervandopløsningen. Data for antallet af larver fundet gennem håndskæring eller sigtning og flydemetoder blev analyseret ved hjælp af Kruskal-Wallis ikke-parametrisk test (p = 0,05)16.
MSF-metoden gav et større antal larver (figur 2A) og flere larver pr. min (figur 2B) end håndskæring. Selvom detektion af de forskellige instars ikke blev kvantificeret i denne undersøgelse, observerede vi, at alle instars (første, anden og tredje) blev fundet ved hjælp af sigter, mens først senere instars (anden og tredje) blev set ved hjælp af håndskæring. Da de tidligere skårne og visuelt inspicerede prøver blev inspiceret igen med et dissekerende mikroskoposkop, blev 40% af de sene stjernelarver, der angreb frugterne, savnet. Tidligere instars blev dog primært fundet ved geninspektionen.
Dette eksperiment viste, at brugen af MSF-metoden er mere effektiv til at finde larver i stærkt inficeret frugt. Imidlertid er frugt inficeret med lavere antal larver mere sandsynligt stødt på i et udryddelsesprogram, hvor de invaderende arter ville være meget sjældne. Derfor gennemførte vi en laboratorieundersøgelse, hvor værtsfrugten var inficeret med et kendt, lavt antal larver.
Manuel angreb af mango og papaya for at simulere lav Bactrocera dorsalis angreb
Dette eksperiment sammenlignede frugtskærings- og MSF-metoderne med hensyn til andelen af larver, der blev opdaget, og den tid, der kræves for at opdage dem, når angrebet var relativt lavt. Manuel angreb blev brugt som et eksperimentelt værktøj til at evaluere effektiviteten af hver metode, da antallet af larver til stede var kendt med sikkerhed.
En korkborer (1,0 cm i diameter) blev brugt til at lave 5 huller i individuelle mango- og papayafrugter, der var fri for frugtfluelarver. En enkelt sen anden til tidlig tredje instar B. dorsalis larve blev placeret i hvert af de 5 huller i en delmængde af frugten. Hullerne blev dækket ved hjælp af stykket, der kedede sig fra frugten, og den resterende frugt blev dækket uden at indsætte larve for visuelt at simulere manuel angreb. Frugterne blev holdt ved 27 ° C i 48 timer for at muliggøre larveudvikling. Eksperimentet blev udført på ARS-laboratoriet i Hilo, Hawaii Island (n = 5 arbejdere) og APHIS-PPQ-laboratoriet på Oahu Island, Hawaii (n = 4 arbejdere).
Til frugtskæring fik hver arbejder 5 mangoer (1 inficeret med 1 larver og 4 ikke angrebet) og 4 papaya (en angrebet og 3 ikke angrebet). En arbejder skar hver frugt individuelt i mindre og mindre stykker og inspicerede løbende papirmassen for eventuelle umodne bananfluer. Søgningen blev stoppet, da papirmassen blev grundigt inspiceret. Det samlede antal larver, der blev fundet, og den tid, hver arbejdstager brugte på at behandle alle frugterne ved at skære, blev registreret (figur 3) og (figur 4).
Hver arbejder modtog et andet lignende sæt frugter (5 mango og 4 papaya) til moshing eller sigtning (uden frugtskæring involveret), med 2 stykker inficeret som tidligere beskrevet. Pulp blev hældt i den øverste sigte og vasket gennem stakken af sigter ved hjælp af vand fra en vandhane og larver fjernet, som beskrevet i protokollen. Eksperimentet blev udført to gange, med sukker floatation og uden sukker floatation, for at afgøre, om fjernelse af floatationstrinnet ville øge processens hastighed uden at miste følsomhed (dvs. alle eller de fleste larver blev fundet) (figur 3). Antallet af larver, der blev fundet, og den tid, som hver arbejdstager brugte på at behandle frugten gennem skæring, MSF eller MS-metoden, blev registreret.
For både mango og papaya resulterede den fulde MSF-metode (flydende inkluderet) i et højere antal larvedetektioner og var hurtigere end frugtskæring (tabel 1). Arbejdere, der brugte den traditionelle frugtskæringsmetode, savnede 32% og 35% af larverne placeret i henholdsvis mango og papaya (tabel 1). Behandling af frugt i bulk ved hjælp af MSF-teknikken krævede 30% mindre tid end at skære individuelle mangoer og 35% mindre tid end at skære individuelle papaya (figur 3). Flere larver blev fundet i minuttet ved hjælp af MSF-metoden til papaya (figur 3C) og mango (figur 3D) sammenlignet med frugtskæringsmetoden. Alle larver, der blev fundet, var i live.
Larvemorfologisk identifikation er kun mulig for sene instjerner. Vi gentog ovenstående eksperiment, men udelod flydeproceduren for at afgøre, om genopretningen af larver forblev høj, og hastigheden af frugtforarbejdning steg. MS-metoden (med floatation udeladt) resulterede i flere larvedetektioner for papaya (figur 4A) og mango (figur 4B) sammenlignet med skæring og visuel inspektion. Derudover var teknikken hurtigere end at skære og visuelt inspicere papaya (figur 4C) og mango (figur 4D). Fjernelse af flydetrinnet fra MSF-metoden reducerede tiden til at finde sene stjernelarver med 90% for papaya og med 48% for mango (tabel 2). Procentdelen af larver, der blev fundet, var høj for begge metoder og var konsekvent højere for MS (floatation udeladt). For papaya blev 80% og 85% af larverne genvundet fra henholdsvis MSF- og MS-metoderne (tabel 1 og tabel 2). For mango blev 88 % og 95 % genfundet ved hjælp af henholdsvis MSF- og MS-metoderne (tabel 1 og tabel 2).
Feltsammenligning af frugtskæring og MSF-metoder
Målet med dette eksperiment var at sammenligne frugtskærings- og MSF-metoderne under markforhold og efterligne et nødprogram for bananfluer. Frugtforarbejdning blev udført uden laboratoriets bekvemmelighed og infrastruktur til at teste feltberedskabet for de to larveekstraktionsmetoder. Arbejdet blev udført i en guava frugtplantage beliggende på USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm nær Hilo. I alt 40 guavaer, der viste tegn på angreb, blev indsamlet og opdelt i 2 grupper. I alt 20 guavaer blev udsat for skæring/visuel inspektion efterfulgt af MSF (floatation inkluderet), hvilket gjorde det muligt at vurdere skæremetodens følsomhed sammenlignet med MSF-metoden. Dissektion fortsatte som beskrevet ovenfor. Når de blev opdaget, blev larver fjernet og talt. Fire arbejdere dissekerede 5 guavaer hver, og den tid, der kræves til skæring og inspektion, blev registreret for hver arbejdstager. Efterskæring af MSF blev udført som ovenfor, bortset fra at en tredje mindre maskesigte (nr. 40, 0,420 mm) blev brugt ud over nr. 8 og nr. 20 sigterne til at samle mindre larver. Det andet sæt på 20 guavaer blev anbragt i 2 lynlåsposer (10 frugter pr. pose) og blev kun udsat for MSF (dvs. ingen skæring), hvilket gjorde det muligt at sammenligne den tid, der var nødvendig til frugtskæring versus MSF. Som ovenfor blev der anvendt tre sigter i denne procedure. Antallet af fundne larver og den samlede tid til at behandle frugt (mushing og holde frugten i 5 min i posen / sigtning / flydende i sukkeropløsning) blev registreret.
Som fundet i laboratoriet undervurderede frugtskæring frugtangreb og var meget variabel og detekterede 25% -83% færre larver end hvad der kunne genvindes ved hjælp af MSF-metoder (tabel 3). Desuden genvandt Læger uden Grænser i prøven med et lavt antal larver 500% flere larver, hvilket gav højere analysefølsomhed og en større chance for at identificere den angrebne organisme. Frugter blev behandlet meget hurtigere ved hjælp af MSF-metoden sammenlignet med skæring; skæring og inspektion af 5 frugter krævede omtrent samme tid som forarbejdning af 10 frugter via MSF.
Figur 1: Trin i ekstraktionsprotokollen for bananfluelarver . (A) Behandl ca. 2 volumenprocent frugt på én gang (f.eks. udgør 5 guavaer eller 5 mellemstore mangoer tilstrækkelige prøver til denne metode). (B) Skær frugten i store stykker og læg den i en 4 L opbevaringspose med lynlås. (C) Tilsæt vand til posen, indtil vandet dækker den hakkede frugt med 25-50 mm. (D) Klem forsigtigt frugten med hånden, indtil al frugtkødet har løsnet sig fra skrællen og har en glat konsistens (dvs. ingen store bidder). E) Sigten stables med sigten med den store maske (nr. 8; 2,36 mm) øverst efterfulgt af sigten med den lille maske (nr. 20; 0,85 mm). For tidlige instars placeres en tredje sigte (nr. 45; 0,35 mm) i bunden af stakken. (F) Hæld frugtkødet i den øverste sigte. G) Papirmassen vaskes grundigt gennem sistakken med vand fra en vandhane, slange eller flaske, indtil finmassen har passeret gennem den første sigte. (H) Scan visuelt de øverste sigter for sent instar larver, der kan have været tilbageholdt med skræl eller store stykker frugt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tidlig og sen stjerne Anastrepha suspensa ekstraktion fra markindsamlet frugt. Det gennemsnitlige antal (± standardafvigelse for gennemsnittet [SE]) af Anastrepha suspensalarver fra fem guavafrugter indsamlet ved opskæring og visuel inspektion (skæring: 70,4 ± 11,9) eller vask af frugtkødet gennem en serie på tre sigter efterfulgt af iblødsætning af frugtkødet i en sukkervandsopløsning (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Det gennemsnitlige antal larver (±SE) indsamlet pr. minut fra 5 guavaer behandlet ved opskæring (1,21 ± 0,16) og MSF (3,71 ± 0,50) (B). Hver metode blev replikeret 5 gange, og stjerner over søjlerne indikerer signifikante forskelle for antallet af larver (χ 2 = 6,81, p < 0,01) og tiden til behandling (χ2 = 6,80, p < 0,01) baseret på en Kruskal-Wallis-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af den fulde mushing-sigte-flydemetode ved hjælp af manuel angreb af mango og papaya for at simulere lav Bactrocera dorsalis angreb. Det gennemsnitlige antal Bactrocera dorsalis larver (±SE) fundet i papaya (skæring: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) og mango (skæring: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frugter og det gennemsnitlige antal larver (±SE) indsamlet pr. minut fra papaya (skæring: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) og mango (skæring: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frugter, der blev behandlet ved hjælp af skærings- eller MSF-metoderne (flydende inkluderet, n = 5) manuelt inficeret med 5 tredje stjernelarver. Stjerner over søjlerne indikerer signifikante forskelle for antallet af larver, der findes i papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) og mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) sammenlignet med frugtskæring baseret på Kruskal-Wallis-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Validering af mushing-sigtemetoden (floatation fjernet) ved hjælp af manuel angreb af mango og papaya for at simulere lav Bactrocera dorsalis angreb. Det gennemsnitlige antal larver (±SE) fundet i papaya (skæring: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) og mango (skæring: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) frugter og det gennemsnitlige antal larver indsamlet pr. minut (±SE) i papaya (skæring: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) og mango (skæring: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Frugter blev manuelt inficeret med 5 tredje instar Bactrocera dorsalis larver og behandlet ved at skære og visuelt inspicere (skære) eller moset i en pose og vaskes gennem sigter (kun mushing og sigtning, uden floatation, n = 4). Stjerner over søjlerne indikerer signifikante forskelle for antallet af larver, der findes i papaya (χ 2 = 5,46, p = 0,02) og mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) og tiden til behandling af papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) og mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) sammenlignet med frugtskæring, baseret på Kruskal-Wallis-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Frugt | # Forarbejdet frugt | #Larvae tilføjet | Behandlingsmetode | #Larvae fundet | Behandlingstid (min)* | % inddrivelse |
| Mango | 25 | 25 | Stikling | 17 | 158 | 68% |
| Mango | 25 | 25 | MSF | 22 | 113 | 88% |
| Papaya | 16 | 20 | Stikling | 13 | 62 | 65% |
| Papaya | 16 | 20 | MSF | 16 | 40 | 80% |
| *Samlet tid opsummeret over 5 arbejdere. | ||||||
Tabel 1: Antallet af genvundne larver og tiden til at behandle frugt ved skæring og visuel inspektion (skæring) eller fuld mushing, sigtning og flydende (MSF) metode. Testfrugten blev manuelt inficeret med 5 tredje instar larver blandet med keder sig og kappet kun frugt (1 af de 5 mangoer, 1 af de 4 papaya).
| Frugt | # Forarbejdet frugt | #Larvae tilføjet | Behandlingsmetode | #Larvae fundet | Behandlingstid (min)* | % inddrivelse |
| Mango | 20 | 20 | Stikling | 10 | 66 | 50% |
| Mango | 20 | 20 | MS | 19 | 44 | 95% |
| Papaya | 16 | 20 | Stikling | 5 | 38 | 25% |
| Papaya | 16 | 20 | MS | 17 | 25 | 85% |
| *Samlet tid opsummeret over 4 arbejdere. | ||||||
Tabel 2: Antallet af genvundne larver og tiden til forarbejdning af frugt ved kun at skære eller mushing og sigte, floatation udeladt (MS). Testfrugterne blev manuelt inficeret med fem tredje stjernelarver blandet med kede og kappede kun frugt (1 ud af 5 mango, 1 ud af 4 papaya).
| Arbejder/metode | #Fruit forarbejdet | Tid til behandling (min.) | #Larvae fundet skæring | #Larvae fundet MSF* | % af det samlede antal larver fundet ved skæring |
| Arbejdstager 1: skæring | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| Arbejder 2: skæring | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| Arbejdstager 3: skæring | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| Arbejdstager 4: skæring | 5 | 20 | 24 | ||
| Arbejder 5: Læger uden Grænser | 10 | 22 | NA | 22 | NA |
| Arbejder 6: Læger uden Grænser | 10 | 18 | NA | 37 | NA |
| * Pulp fra skæring og visuel inspektion behandlet igen ved hjælp af MSF-metoden for at bestemme antallet af sene 2nd-3 rd instar larver savnet | |||||
| ** Pulp af arbejdere 2 og 3 frugt samlet før forarbejdning ved hjælp af MSF-metoden | |||||
Tabel 3: Antallet af larver, der findes i markindsamlet guava ved at skære og visuelt inspicere frugten (skære) eller ved at mushing, sigtning og flydende (MSF) frugten.
Discussion
Vores mål var at udvikle en effektiv måde at finde tephritid larver i marken. Motivationen for at iværksætte et udryddelsesprogram eller etablere et karantæneområde er påvisning af parrede hunner eller larver6, hvilket indikerer en ynglepopulation. Den nuværende metode til at skære og visuelt søge frugt er ineffektiv til at finde larver, da der normalt er mange flere værtsfrugter til stede, end der kan inspiceres individuelt. Derudover er populationerne af tephritider sandsynligvis lave i et område med ny invasion, hvilket gør chancerne for at finde larver i en stor mængde frugt utroligt vanskelige. For eksempel blev der i 2015 Bactrocera dorsalis udryddelsesprogram i Florida identificeret 54 forskellige værtsarter, og mere end 4.000 frugter blev skåret. I dette udryddelsesprogram blev der kun fundet få larver i mango, og ingen andre værter viste sig at være inficeret6. Vi fandt ud af, at MSF / MS-metoden var både mere følsom og hurtigere til at detektere A. suspensa og B. dorsalis larver ved forarbejdning af frugter, der havde en stor mængde papirmasse (mango, guava og papaya) i bulk sammenlignet med frugtskæring. Den større mængde værtsfrugter, som det er muligt at inspicere ved hjælp af mushing- og sigtemetoden, kombineret med stigningen i påvisning af en sjælden larve, kan øge sandsynligheden for, at et angreb vil blive fundet tidligt. Tidlig påvisning af en ynglebestand kan øge sandsynligheden for udryddelse og reducere omkostningerne ved programmet.
Vores eksperimenter viste, at antallet af larver, der blev opdaget af arbejdere, der skar og visuelt inspicerede frugter, varierede betydeligt. Arbejdere, der skar frugt, savnede 50% og 75% af B. dorsalis larverne placeret i henholdsvis mango og papaya. I modsætning hertil blev kun 5% og 15% af larverne savnet ved hjælp af MS-metoden til behandling af henholdsvis mango og papayafrugt. På samme måde viste en undersøgelse, der evaluerede frugtopskæring i indgangshavne, at der var betydelig variation i antallet af angrebne frugter og larver, der blev fundet af inspektørerne8. Undersøgelsen viste, at erfarne havneinspektører savnede 64%-99% af A. suspensa-larverne og 16%-82% af den angrebne frugt, når frugten blev skåret og visuelt inspiceret8. Vores resultater tyder på, at mushing og sigtning metode kan mindske sandsynligheden for, at en arbejdstager ville gå glip af at opdage en inficeret frugt.
Flydning af sukker og varmt vand accepteres protokoller i en systemtilgangsmetode til sikring af, at kirsebær og blåbær er fri for bananfluer14. En delmængde af en forsendelse knuses ind i opløsningen, hvorefter en inspektør visuelt screener overfladen af sukkeropløsningen for tilstedeværelse af æg og larver. Selvom et større antal frugter kan behandles sammenlignet med at skære individuelle frugter, påvirkes sandsynligheden for at finde larver ved hjælp af disse teknikker stadig af inspektørens evne, stadiet og antallet af larver, der er til stede, og typen af frugt8. Vi fandt, at B. dorsalis og A. suspensa ligesom andre tephritider løsner sig fra frugtpulpen og flyder til overfladen. Interessant nok fandt vi, at med større sene stjernelarver, som er målet i nød- og udryddelsesprogrammer, da de kan identificeres morfologisk, herunder sukkerflødning, øgede metodens nøjagtighed ikke. Faktisk øgede tilsætning af flydemetoden behandlingstiden med 90% for papaya og med 48% for mango. Øget behandlingstid plus de ekstra materialer (dvs. vand, skraldespande, sukker osv.) understøtter ikke operationelt tilføjelse af dette trin, når du søger efter store stjerner i marken. Sukkerflydemetoden kan være hensigtsmæssig, når målet er at påvise alle stadier, herunder tidlige stjerner, f.eks. i indgangshavne og pakkerier. Filtrering af sukkeropløsningen med en finmasket sigte vil sandsynligvis give den mest nøjagtige påvisning af æg og tidlige larvestjerner11,12.
MS- og MSF-teknikkerne fungerer godt med frugt, der let kan moses og har en stor mængde papirmasse. Tephritid larver har tendens til at grave sig ned i frugtmasse, hvilket gør visuel detektion vanskelig. Et kritisk aspekt af MS- og MSF-metoderne er at adskille larverne fra papirmassen. Sigtningsprocessen fjerner papirmassen og udsætter således larverne på sigteskærme. På samme måde adskiller sukkervandsmetoden larverne fra papirmassen ved at få larverne til at flyde, mens frugtkødet synker til bunden af gryden. Larver, der adskilles fra papirmassen ved MS- eller MSF-metoderne, observeres let at bevæge sig på sigteskærmen eller vandoverfladen. Selvom mushing, sigtning og eventuelt flydende metode i høj grad forbedrede hastigheden og nøjagtigheden af at detektere tephritidlarver i vigtig værtsfrugt, er processen muligvis ikke passende for alle frugter. For eksempel kan værtsfrugt med hård papirmasse, såsom grønne avocadoer eller frugt med et stort frø / pit og relativt lille mængde papirmasse, såsom tropiske mandler, være lettere at behandle ved håndskæring og visuel inspektion.
Vi konstaterede, at MS- og MSF-metoderne var hurtigere, når et relativt lille antal frugter (5-10) blev behandlet. Forskellen ville sandsynligvis være større, hvis større mængder frugt blev behandlet, hvilket kan være nødvendigt og typisk for nødfrugtflueprogrammer. Fjernelse af flydetrinnet øgede detektionshastigheden yderligere uden at gå på kompromis med nøjagtigheden ved at finde store tephritidlarver (>3 mm). Vi viste, at disse teknikker kunne tages med til marken, som simulerede de forhold, som arbejdere oplevede under et nødfrugtflueprogram. Vores undersøgelser tyder på, at MS-metoderne kan give mulighed for en mere rettidig påvisning af sene stjernelarver og efterfølgende udryddelse af tephritid-ynglepopulationer. Læger uden Grænser kan bruges til at påvise æg og tidlige stjerner, der i øjeblikket ikke er mål for udryddelsesprogrammer.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria og Alejandra Canon for hjælp til behandling af guavaen ved University of Florida, Rick Kurashima, Jean Auth og Bruce Inafuku for hjælp til at evaluere den kunstigt inficerede frugt på Hawaii og Michael Stulberg for nyttige kommentarer til tidligere versioner af manuskriptet. Dette projekt blev delvist finansieret af USDA APHIS og University of Florida Cooperative Agreement og delvist støttet af USDA-ARS (projekt 2040-22430-027-00D). Resultaterne og konklusionerne i denne foreløbige publikation er ikke formelt formidlet af USDA og bør ikke fortolkes som udtryk for nogen agenturbestemmelse eller politik. Omtalen af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse fra USDA. USDA er en udbyder og arbejdsgiver med lige muligheder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
