Summary
Å øke oppdagelsen av umodne tephritidfruktfluer i feltet kan utløse rettidig innsats for å eliminere populasjoner av disse ødeleggende. Påvisning av sene stjernelarver er raskere og mer nøyaktig når du kjører vertsfrukt i en pose og fører massen gjennom en rekke sikter enn håndskjæring og visuell inspeksjon.
Abstract
Fruktfluer av familien Tephritidae er blant de mest ødeleggende og invasive landbruksskadegjørerne i verden. Mange land gjennomfører dyre utryddingsprogrammer for å eliminere begynnende befolkninger. Under utryddelsesprogrammer gjøres det en felles innsats for å oppdage larver, da dette sterkt indikerer en hekkepopulasjon og bidrar til å etablere den romlige utstrekningen av angrepet. Påvisning av umodne livsstadier utløser ytterligere kontroll- og reguleringstiltak for å begrense og forhindre videre spredning av. Tradisjonelt oppnås larvesteteksjon ved å kutte individuelle vertsfrukter og undersøke dem visuelt. Denne metoden er arbeidsintensiv, da bare et begrenset antall frukt kan behandles, og sannsynligheten for å savne en larve er høy. En ekstraksjonsteknikk som kombinerer i) hundekjøring av vertsfrukt i en plastpose, ii) siling av masse gjennom en rekke siler, iii) plassering av tilbakeholdt masse i en brun sukkervannløsning, og iv) oppsamling av larver som flyter til overflaten ble testet. Metoden ble evaluert i Florida med feltsamlet guava naturlig infisert av Anastrepha suspensa. For å etterligne lave populasjoner som er mer representative for et fruktflueutryddelsesprogram, ble mango og papaya på Hawaii infisert med et kjent, lavt antall Bactrocera dorsalis larver. Anvendeligheten av metoden ble testet i feltet på guava naturlig infisert av B. dorsalis for å evaluere metoden under forhold som oppleves av arbeidere under et nødfruktflueprogram. I både felt- og laboratorieforsøk var hundekjøring og sikting av massen mer effektiv (krevde mindre tid) og mer følsom (flere larver funnet) enn å kutte frukt. Flytende massen i brunt sukkervannsoppløsning bidro til å oppdage tidligere instar larver. Hundekjøring og sikting av fruktmasse av viktige tephritidverter kan øke sannsynligheten for å oppdage larver under nødprogrammer.
Introduction
Tephritid fruktfluer er blant de mest ødeleggende landbruksskadegjørerne, med slektene Anastrepha, Bactrocera og Ceratitis som utgjør størst risiko1. Mange områder har høy risiko for etablering av eksotiske bananfluer, basert på 1) historiske angrep og tilhørende avgrensnings- og utryddelsesprogrammer, 2) den høye ankomstraten av fruktfluevertsmateriale ved inngangsportene, og 3) klimatiske forhold som er gunstige for etablering av reproduserende populasjoner. Delstaten California opplever flere angrep og påvisninger av tephritider årlig2. Det har vært mer enn 200 angrep og utryddelsesprogrammer mot tephritider globalt i løpet av det siste århundret, og dette har akselerert betydelig de siste tiårene3. Selv om det store flertallet av disse programmene lykkes med å utrydde den invaderende bananfluen3,4, er den økonomiske og miljømessige byrden av disse invasjonene fortsatt høy, og muligheten for etablering er alltid til stede; et nylig katastrofalt eksempel er infeksjonen av Bactrocera dorsalis på det afrikanske kontinentet5.
Under nødstilfeller av bananflueprogrammer gjøres det en felles innsats for å oppdage og kontrollere hekkebestander av de invaderende artene. For eksempel reagerer delstaten Florida på tephritid-angrep ved å bruke jorddrenches (under drypplinjen av fruktbærende vertsplanter) og fjerne vertsfrukt i en radius på 200 m rundt steder der parrede hunner og / eller larver er funnet6. Disse handlingene og taktikkene tjener til å drepe larver og pupper i jorden og fjerne egg og larver fra frukt i området. I noen utryddelsesprogrammer fjernes en betydelig mengde vertsfrukt. I 2015 ble over 100.000 kg frukt ødelagt under B. dorsalis utryddelsesprogram i Florida6. De økonomiske tapene for produsenter og tilknyttede næringer i karanteneområdet alene ble estimert til å være over $ 10.7 millioner7.
For å finne tephritidlarver i karanteneområdene, samler et lite team av entomologer vertsfrukter i en radius på 200 m rundt et hunnfluedeteksjonsområde og kutter og visuelt inspiserer hver frukt for larver6. Med begrensede personalressurser og hundrevis av mulige verter blir oppgaven vanskelig, spesielt i de områdene hvor anleggsmangfoldet i både kommersielle produksjonsområder og boligverft er høyt. I tillegg kan larver bli savnet når de kutter vertsfrukter. I en studie som evaluerte fruktskjæring ved inngangsportene, ble det funnet at kutting av frukt ikke var like effektivt for å oppdage A. suspensa sammenlignet med å holde de infiserte fruktene i flere uker og telle larver og pupper som finnes i puppesubstratet8.
Det finnes alternativer til fruktskjæring for å oppdage angrep 9,10,11,12,13. For eksempel er en brunt sukkerflyting og en varmtvannsmetode begge aksepterte prosedyrer som brukes til å oppdage vestlige kirsebærfruktfluer i høstede kirsebær 9,10. Den brune sukkermetoden innebærer å plassere knust frukt i sukkervannsoppløsning og samle larver som flyter til toppen. Flytemetoden for brunt sukker ble utviklet spesielt for å oppfylle regulatoriske regler for eksporterte kirsebær, som krever at pakkerier overvåker karantene av fruktflueskadedyr. Det er også et godkjent US-Canada blueberry sertifiseringsprogram som inkluderer brunt sukkervann flotasjon, saltvann floatation, eller koking for å støtte phytosanitation14. Ved testing av nøyaktigheten av sukker og varmtvannsflyting brukte forskerne siktemetoden for å bestemme hvor mange larver som er savnet 9,10,11,12,13. En studie viste at blanding av knuste blåbær i en saltløsning og filtrering av løsningen gjennom et gjenbrukbart kaffefilter var fire ganger bedre for å oppdage Drosophila suzukii larver enn visuelt å inspisere overflaten av salt- og sukkerløsninger14. I tillegg ble gasskromatografi brukt til påvisning av A. suspensa larver i sitrus15. Disse tilnærmingene er ikke testet for anvendelighet i feltundersøkelser.
Målet vårt var å utvikle og teste en metode for å finne tephritidlarver i felt ved hjelp av sikting og sukkervannsflyting. Denne metoden muliggjør mer effektiv påvisning av umodne bananfluer enn den tradisjonelle fruktskjæringsmetoden, og støtter rettidig kontroll av avlspopulasjoner under utryddelsesprogrammer for fruktfluer.
Protocol
1. Frukt utvalg
- Bestem hvilken frukt som er tilgjengelig i området som skal undersøkes.
- Velg vertsfrukt basert på listen over kjente verter for målarten tephritid.
- Velg myk, moden frukt, som mango, papaya og guava. Umoden eller hardkjøttet frukt, som tropiske mandler, bør inspiseres med en annen metode, for eksempel fruktskjæring.
- Velg fallen, overmoden frukt eller moden frukt på trær som har tegn på skade, oviposisjonsarr og myke flekker.
- Behandle ca 2 liter frukt på en gang (f.eks 5 guavaer eller 5 mellomstore mango utgjør tilstrekkelige prøver for denne metoden). Antall frukter som kan behandles samtidig, avhenger av størrelsen på fruktene (figur 1A).
2. Hundekjøring
- Skjær frukten i store biter og legg den i en 4 L oppbevaringspose med glidelås (figur 1B).
- Tilsett vann i posen til vannet dekker den hakkede frukten med 25-50 mm (figur 1C).
- Klem frukten forsiktig for hånd til hele fruktkjøttet har løsnet fra skallet og har en jevn konsistens (dvs. ingen store biter) (figur 1D).
3. Sikting for sen skikkelse samling
- Stable siktene. Bruk store sikter (457 mm diameter) for behandling av store mengder frukt (~ 5 frukt samtidig) og mindre sikter (305 mm diameter) for individuell frukt eller mindre prøver (< 5 frukt).
- Stable sikten med et stort nett (nr. 8; 2,36 mm) sikt på toppen av en liten nettsikt (nr. 20; 0,85 mm). For påvisning av tidlige instars, plasser en tredje sil (nr. 45; 0,35 mm) på bunnen av stabelen (figur 1E).
- Hell massen i den øverste sikten (figur 1F).
- Vask massen grundig gjennom silstabelen med vann fra en kran, slange eller en flaske til den fine massen har passert gjennom siktene (figur 1G).
- Skann visuelt de øverste siktene etter sene stjernelarver som kan ha blitt beholdt sammen med skallet eller andre store fruktbiter (figur 1H).
- Inspiser nøye den andre sikten for sene instar larver. Med store mengder finmasse kan det være nødvendig med ytterligere skylling.
- Samle larver fra siktene med larvetang og legg dem i hetteglass med 70% EtOH.
4. Sukkerflyting for tidlig stjernekolleksjon
- Forbland sukkeroppløsningen ved å løse opp 453 g (1 boks) mørkebrunt sukker i 2 liter vann fra springen, noe som gir en Brix-avlesning på 19°10.
- Vask massen fra de finere nettingsiktene (f.eks. nr. 20 og nr. 45) til kanten av silen med vann fra springen, og flytt deretter materialet til en plastdishpan (11 L).
- Tilsett den brune sukkeroppløsningen til den dekker massen med 25-50 mm og tilsett 2 dråper anti-skum. La massen sitte i brunsukkeroppløsningen i ca 5 min.
- Samle larver som flyter til overflaten av løsningen med larvaltang i hetteglass med 70% EtOH.
5. Larve kurasjon
- Merk et hetteglass med innsamlingssted, dato, type frukt og samler for senere undersøkelse og identifikasjon.
Representative Results
Tidlig og sen instar Anastrepha suspensa ekstraksjon fra feltet samlet frukt
I dette eksperimentet har vi sammenlignet fruktskjæring og mosekjøring, sikting og flytende (MSF) metoder i forhold til andelen larver oppdaget og gjennomsnittlig tid som kreves for å oppdage dem. Guava, svært infisert med larver av Anastrepha suspensa, ble samlet inn fra en plante som ligger ved University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. Frukten ble tilfeldig sortert i grupper på 5 og tildelt 1 av 2 larveekstraksjonsmetoder: 1) håndskjæring eller 2) MSF-metoden. Tiden for å samle alle larver som er synlige for det blotte øye ved hjelp av hver ekstraksjonsmetode ble registrert.
Håndskjæringsmetoden fulgte metoden som for tiden brukes i et utryddelsesprogram. Hver av de 5 arbeiderne (n = 5) ble tildelt 5 frukter for å søke etter alle stadier av larver ved å kutte fruktene i mindre biter og visuelt inspisere massen. For å avgjøre om larver ble oversett i den visuelle inspeksjonen, ble de håndskårne fruktbitene inspisert på nytt ved hjelp av et dissekerende mikroskop (10x).
For MSF-metoden ble 5 frukter kuttet i store biter (50-80 cm), plassert i zip lock-poser og presset forsiktig for hånd til all massen ble løsnet fra skallet og massen hadde en jevn konsistens (dvs. ingen store biter). Den mosede frukten ble silt gjennom en serie store (45,7 cm) messingsikter. Det største nettet (nr. 8) ble stablet på toppen, etterfulgt av et nummer nr. 20 og en nr. 45 maskesil. Personalet som ble tildelt denne behandlingen, vasket massen gjennom nettet ved hjelp av vann fra en slange koblet til en vaskekran. De sene stjernelarvene var tydelige i silene. De mindre stjernene ble blandet med masse, noe som gjorde dem vanskelige å se og fjerne. Derfor ble fruktkjøtt/larveblandingen fra siktene lagt i bøtter med 1 l brunt sukkervann. Larvene fløt umiddelbart til overflaten. Løsningen ble forsiktig omrørt, og etter 5 minutter ble larver fjernet fra bøttene og talt. Tiden for å behandle frukten var en kombinasjon av hundekjøring, sikting og fjerning av larver fra sukkervannsløsningen. Data for antall larver funnet ved håndskjæring eller sikting og flytemetoder ble analysert ved hjelp av Kruskal-Wallis ikke-parametrisk test (p = 0,05)16.
MSF-metoden ga større antall larver (figur 2A) og flere larver per min (figur 2B) enn håndskjæring. Selv om deteksjon av de forskjellige stjernene ikke ble kvantifisert i denne studien, observerte vi at alle stjerner (første, andre og tredje) ble funnet ved hjelp av sikter, mens bare senere instjerner (andre og tredje) ble sett ved hjelp av håndskjæring. Når de tidligere kuttede og visuelt inspiserte prøvene ble inspisert på nytt med et dissekerende mikroskop, ble 40% av de sene instar-larvene som infiserte fruktene savnet. Tidligere instars ble imidlertid først og fremst funnet ved re-inspeksjonen.
Dette eksperimentet viste at bruk av Leger Uten Grensers metode er mer effektivt for å finne larver i svært infisert frukt. Imidlertid er frukt infisert med lavere antall larver mer sannsynlig i et utryddelsesprogram, hvor de invaderende artene vil være svært sjeldne. Derfor gjennomførte vi en laboratorieundersøkelse der vertsfrukten var infisert med et kjent, lavt antall larver.
Manuell angrep av mango og papaya for å simulere lav Bactrocera dorsalis angrep
Dette eksperimentet sammenlignet fruktskjæring og MSF-metoder med hensyn til andelen larver som ble oppdaget og tiden det tok å oppdage dem når angrepet var relativt lavt. Manuell infestasjon ble brukt som et eksperimentelt verktøy for å evaluere effekten av hver metode, da antall larver til stede var kjent med sikkerhet.
En korkborer (1,0 cm diameter) ble brukt til å lage 5 hull i individuelle mango- og papayafrukter som var fri for bananfluelarver. En enkelt sen andre til tidlig tredje instar B. dorsalis larve ble plassert i hvert av de 5 hullene i en delmengde av frukten. Hullene ble kappet ved hjelp av stykket som ble boret av frukten, og den gjenværende frukten ble avkortet uten å sette inn larver for å visuelt simulere manuell angrep. Fruktene ble holdt ved 27 °C i 48 timer for å tillate larveutvikling. Eksperimentet ble utført ved ARS-laboratoriet i Hilo, Hawaii Island (n = 5 arbeidere) og APHIS-PPQ-laboratoriet på Oahu Island, Hawaii (n = 4 arbeidere).
For fruktskjæring fikk hver arbeider 5 mango (1 infisert med 1 larver og 4 ikke infisert) og 4 papaya (en infisert og 3 ikke infisert). En arbeider kuttet hver frukt individuelt i mindre og mindre biter og inspiserte kontinuerlig massen for eventuelle umodne fruktfluer. Søket ble stoppet da massen ble grundig inspisert. Det totale antallet larver som ble funnet og tiden hver arbeider brukte til å behandle alle fruktene ved å skjære ble registrert (figur 3) og (figur 4).
Hver arbeider fikk et annet lignende sett med frukt (5 mango og 4 papaya) for hundekjøring eller sikting (uten fruktskjæring involvert), med 2 stykker infisert som tidligere beskrevet. Pulp ble helt i toppsikten og vasket gjennom silbunken med vann fra en kran og larver fjernet, som beskrevet i protokollen. Forsøket ble gjennomført to ganger, med sukkerflyting og uten sukkerflyting, for å avgjøre om fjerning av flytetrinnet ville øke hastigheten på prosessen uten å miste følsomhet (dvs. alle eller de fleste larver ble funnet) (figur 3). Antall larver som ble funnet og tiden hver arbeider brukte på å behandle frukten gjennom stikling, MSF eller MS-metoden ble registrert.
For både mango og papaya resulterte Leger Uten Grensers fulle metode (inkludert flyting) i høyere antall larvepåvisninger og var raskere enn fruktskjæring (tabell 1). Arbeidere som brukte den tradisjonelle fruktskjæringsmetoden, savnet 32% og 35% av larvene som ble plassert i henholdsvis mango og papaya (tabell 1). Behandling av frukt i bulk ved hjelp av MSF-teknikken krevde 30% mindre tid enn å kutte individuelle mango og 35% mindre tid enn å kutte individuelle papaya (figur 3). Flere larver ble funnet per minutt ved hjelp av MSF-metoden for papaya (figur 3C) og mango (figur 3D) sammenlignet med fruktskjæringsmetoden. Alle larvene som ble funnet var levende.
Larvemorfologisk identifikasjon er bare mulig for sene instars. Vi gjentok eksperimentet ovenfor, men utelot flyteprosedyren for å avgjøre om utvinningen av larver forble høy og hastigheten på fruktbehandlingen økte. MS-metoden (med flotasjon utelatt) resulterte i flere larvesteteksjoner for papaya (figur 4A) og mango (figur 4B) sammenlignet med skjæring og visuell inspeksjon. I tillegg var teknikken raskere enn å kutte og visuelt inspisere papaya (figur 4C) og mango (figur 4D). Fjerning av flytetrinnet fra MSF-metoden reduserte tiden for å finne sene stjernelarver med 90% for papaya og med 48% for mango (tabell 2). Andelen larver som ble funnet var høy for begge metodene og gjennomgående høyere for MS (floatation utelatt). For papaya ble 80 % og 85 % av larvene gjenfunnet ved henholdsvis MSF- og MS-metodene (tabell 1 og tabell 2). For mango ble 88 % og 95 % gjenfunnet fra henholdsvis MSF- og MS-metodene (tabell 1 og tabell 2).
Feltsammenligning av fruktskjæring og MSF-metoder
Målet med dette eksperimentet var å sammenligne fruktkutting og Leger Uten Grensers metoder under feltforhold, og etterligne et nødprogram for bananflue. Fruktforedling ble utført uten laboratoriets bekvemmelighet og infrastruktur for å teste feltberedskapen til de to larveekstraksjonsmetodene. Arbeidet ble utført i en guava-frukthage som ligger ved USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm nær Hilo. Totalt 40 guavaer som viste tegn på angrep ble samlet inn og delt inn i 2 grupper. Totalt 20 guavaer ble utsatt for skjæring/visuell inspeksjon etterfulgt av MSF (floatation included), noe som gjorde det mulig å vurdere sensitiviteten til skjæremetoden sammenlignet med MSF-metoden. Disseksjonen forløp som beskrevet ovenfor. Når det ble oppdaget, ble larver fjernet og talt. Fire arbeidere dissekerte 5 guavaer hver, og tiden som kreves for kutting og inspeksjon ble registrert for hver arbeider. Etterskjæring av MSF ble gjennomført som ovenfor, bortsett fra at en tredje sikt med mindre netting (nr. 40, 0,420 mm) ble brukt i tillegg til sikt nr. 8 og nr. 20 for å samle opp mindre larver. Det andre settet med 20 guavaer ble plassert i 2 zip lock-poser (10 frukter per pose) og ble kun utsatt for MSF (dvs. ingen kutting), noe som tillot en sammenligning av tiden som trengs for fruktskjæring versus MSF. Som ovenfor ble tre sikter brukt i denne prosedyren. Antall larver som ble funnet og total tid til å bearbeide frukt (hundekjøring og holde frukten i 5 min i posen/sikte/flyte i sukkeroppløsning) ble registrert.
Som funnet i laboratoriet, underestimerte fruktskjæring fruktinfestasjon og var svært variabel, og oppdaget 25% -83% færre larver enn det som kunne gjenvinnes ved hjelp av MSF-metoder (tabell 3). I prøven med lavt antall larver fant Leger Uten Grenser 500 prosent flere larver, noe som ga høyere analysesensitivitet og større sjanse til å identifisere den infiserte organismen. Frukt ble behandlet mye raskere ved hjelp av MSF-metoden sammenlignet med kutting; Å kutte og inspisere 5 frukter krevde omtrent like lang tid som å behandle 10 frukter via MSF.
Figur 1: Trinn i protokollen for ekstraksjon av bananfluelarver . (A) Behandle ca. 2 volumliter frukt samtidig (f.eks. 5 guavaer eller 5 mellomstore mango utgjør tilstrekkelige prøver for denne metoden). (B) Skjær frukten i store biter og legg den i en 4 L zip lock oppbevaringspose. (C) Tilsett vann i posen til vannet dekker den hakkede frukten med 25-50 mm. (D) Klem frukten forsiktig for hånd til all massen har løsnet fra skallet og har en jevn konsistens (dvs. ingen store biter). (E) Stable sikten med det store nettet (nr. 8; 2,36 mm) sikt på toppen etterfulgt av den lille nettingen (nr. 20; 0,85 mm) sikt. For tidlige stjerner, plasser en tredje sil (nr. 45; 0,35 mm) på bunnen av stabelen. (F) Hell massen i den øverste silen. (G) Vask massen grundig gjennom silstabelen med vann fra en kran, slange eller en flaske til den fine massen har passert gjennom den første silen. (H) Skann visuelt de øverste siktene for sene instar larver som kan ha blitt beholdt med skallet eller noen store fruktbiter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidlig og sen instar Anastrepha suspensa ekstraksjon fra felt samlet frukt. Gjennomsnittlig antall (± standardfeil av gjennomsnittet [SE]) av Anastrepha suspensa larver fra fem guavafrukter samlet ved kutting og visuell inspeksjon (skjæring: 70,4 ± 11,9) eller vasking av massen gjennom en serie på tre sikter etterfulgt av bløtlegging av massen i en sukkervannsløsning (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Gjennomsnittlig antall larver (±SE) samlet per minutt fra 5 guavaer behandlet ved kutting (1,21 ± 0,16) og av MSF (3,71 ± 0,50) (B). Hver metode ble replikert 5 ganger, og stjerner over stolpene indikerer signifikante forskjeller for antall larver (χ 2 = 6,81, p < 0,01) og tid til behandling (χ2 = 6,80, p < 0,01) basert på en Kruskal-Wallis-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering av full mushing-sieving-floatation metode ved hjelp av manuell angrep av mango og papaya for å simulere lav Bactrocera dorsalis angrep. Gjennomsnittlig antall Bactrocera dorsalis larver (±SE) funnet i papaya (skjæring: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) og mango (skjæring: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frukt og gjennomsnittlig antall larver (±SE) samlet per minutt fra papaya (skjæring: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) og mango (skjæring: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frukt som ble behandlet ved hjelp av skjæring eller MSF metoder (floatation inkludert, n = 5) manuelt infisert med 5 tredje instar larver. Stjerner over stolpene indikerer signifikante forskjeller for antall larver funnet i papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) og mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) sammenlignet med fruktskjæring basert på Kruskal-Wallis-tester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Validering av mushing-sikting metoden (floatation fjernet) ved hjelp av manuell angrep av mango og papaya for å simulere lav Bactrocera dorsalis angrep. Gjennomsnittlig antall larver (±SE) funnet i papaya (skjæring: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) og mango (skjæring: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) frukt og gjennomsnittlig antall larver samlet per minutt (±SE) i papaya (skjæring: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) og mango (skjæring: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Frukt ble manuelt infisert med 5 tredje instar Bactrocera dorsalis larver og behandlet ved å kutte og visuelt inspisere (kutte) eller mshed i en pose og vasket gjennom sikter (bare hundekjøring og sikting, uten flyting, n = 4). Stjerner over stolpene indikerer signifikante forskjeller for antall larver funnet i papaya (χ 2 = 5,46, p = 0,02 ) og mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) og tid til å behandle papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) og mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) sammenlignet med fruktskjæring, basert på Kruskal-Wallis-tester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Frukt | # Frukt behandlet | #Larvae lagt til | Behandlingsmetode | #Larvae funnet | Behandlingstid (min)* | % gjenoppretting |
| Mango | 25 | 25 | Skjæring | 17 | 158 | 68% |
| Mango | 25 | 25 | MSF | 22 | 113 | 88% |
| Papaya | 16 | 20 | Skjæring | 13 | 62 | 65% |
| Papaya | 16 | 20 | MSF | 16 | 40 | 80% |
| * Total tid summert over 5 arbeidere. | ||||||
Tabell 1: Antall larver gjenfunnet og tid til å behandle frukt ved skjæring og visuell inspeksjon (skjæring) eller full mushing, sikting og flytende (MSF) metode. Testfrukten ble manuelt infisert med 5 tredje instar larver blandet med kjedelig og avkortet bare frukt (1 av de 5 mangoene, 1 av de 4 papayaene).
| Frukt | # Frukt behandlet | #Larvae lagt til | Behandlingsmetode | #Larvae funnet | Behandlingstid (min)* | % gjenoppretting |
| Mango | 20 | 20 | Skjæring | 10 | 66 | 50% |
| Mango | 20 | 20 | MS | 19 | 44 | 95% |
| Papaya | 16 | 20 | Skjæring | 5 | 38 | 25% |
| Papaya | 16 | 20 | MS | 17 | 25 | 85% |
| * Total tid summert over 4 arbeidere. | ||||||
Tabell 2: Antall larver som gjenvinnes og tid til å behandle frukt ved kutting eller kun hundekjøring og sikting, flotasjon utelatt (MS). Testfruktene ble manuelt infisert med fem tredje instar larver blandet med kjedelig og avkortet bare frukt (1 av 5 mango, 1 av 4 papaya).
| Arbeider/metode | #Fruit behandlet | Tid til å behandle (min) | #Larvae fant kutting | #Larvae fant Leger Uten Grenser* | % av totalt antall larver funnet ved skjæring |
| Arbeider 1: kutte | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| Arbeider 2: kutte | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| Arbeider 3: kutte | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| Arbeider 4: kutte | 5 | 20 | 24 | ||
| Arbeider 5: Leger Uten Grenser | 10 | 22 | NA | 22 | NA |
| Arbeider 6: Leger Uten Grenser | 10 | 18 | NA | 37 | NA |
| * Pulp fra skjæring og visuell inspeksjon behandlet igjen ved hjelp av MSF metoden for å bestemme antall sent 2nd-3 rd instar larver savnet | |||||
| ** Masse av arbeidere 2 og 3 frukt samlet før behandling ved hjelp av MSF-metoden | |||||
Tabell 3: Antall larver funnet i feltsamlet guava ved å kutte og visuelt inspisere frukten (skjære) eller ved hundekjøring, sikting og flytende (MSF) frukten.
Discussion
Vårt mål var å utvikle en effektiv måte å finne tephritid larver i felt. Motivasjonen for å starte et utryddelsesprogram eller etablere et karanteneområde er påvisning av parrede hunner eller larver6, noe som indikerer en hekkepopulasjon. Den nåværende metoden for å kutte og visuelt søke frukt er ineffektiv når det gjelder å finne larver, da det vanligvis er mange flere vertsfrukter til stede enn det som kan inspiseres individuelt. I tillegg er populasjonene av tephritidene sannsynligvis lave i et område med ny invasjon, noe som gjør sjansene for å finne larver i en stor mengde frukt utrolig vanskelig. For eksempel, i 2015 Bactrocera dorsalis utryddelsesprogram i Florida ble 54 forskjellige vertsarter identifisert, og mer enn 4000 frukter ble kuttet. I dette utryddelsesprogrammet ble det bare funnet noen få larver i mango, og ingen andre verter ble funnet å være infisert6. Vi fant at MSF / MS-metoden var både mer følsom og raskere i å oppdage A. suspensa og B. dorsalis larver ved behandling av frukt som hadde en stor mengde masse (mango, guava og papaya) i bulk sammenlignet med fruktskjæring. Den større mengden vertsfrukter som det er mulig å inspisere ved hjelp av hundekjørings- og siktemetoden, kombinert med økningen i deteksjon av en sjelden larve, kan øke sannsynligheten for at et angrep vil bli funnet tidlig. Tidlig påvisning av en hekkepopulasjon kan øke sannsynligheten for utryddelse og redusere kostnadene ved programmet.
Våre eksperimenter viste at antall larver oppdaget av arbeidere som kuttet og visuelt inspiserte frukt, varierte betydelig. Arbeidere som kuttet frukt savnet 50% og 75% av B. dorsalis larver plassert i henholdsvis mango og papaya. I motsetning til dette ble bare 5% og 15% av larvene savnet ved hjelp av MS-metoden for behandling av henholdsvis mango- og papayafrukt. Tilsvarende viste en studie som evaluerte fruktskjæring ved inngangsportene at det var betydelig variasjon i antall infiserte frukter og larver funnet av inspektørene8. Studien viste at erfarne havneinspektører savnet 64% -99% av A. suspensa larver og 16% -82% av den infiserte frukten når frukt ble kuttet og visuelt inspisert8. Våre resultater tyder på at hundekjørings- og siktemetoden kan redusere sannsynligheten for at en arbeidstaker vil savne å oppdage en infisert frukt.
Sukker og varmtvannsflyting er aksepterte protokoller i en systemtilnærmingsmetode for å sikre at kirsebær og blåbær er fri for bananfluer14. En delmengde av en forsendelse knuses inn i løsningen, hvorpå en inspektør visuelt skjermer overflaten av sukkeroppløsningen for tilstedeværelse av egg og larver. Selv om et større antall frukter kan behandles sammenlignet med å kutte individuell frukt, er sannsynligheten for å finne larver ved hjelp av disse teknikkene fortsatt påvirket av inspektørens evne, stadium og antall larver som er tilstede, og typen frukt8. Vi fant at, som andre tephritider, blir B. dorsalis og A. suspensa løsnet fra fruktmassen og flyter til overflaten. Interessant nok fant vi at med større sene instar larver, som er målet i nød- og utryddelsesprogrammer som de kan identifiseres morfologisk, inkludert sukkerflyting, økte ikke nøyaktigheten av metoden. Faktisk økte tilsetning av flytemetoden behandlingstiden med 90% for papaya og med 48% for mango. Økt behandlingstid pluss tilleggsmaterialer (dvs. vann, beholdere, sukker, etc.) støtter ikke operasjonelt å legge til dette trinnet når du søker etter store stjerner i feltet. Sukkerflytemetoden kan være hensiktsmessig når målet er å oppdage alle stadier, inkludert tidlige instars, for eksempel ved inngangsporter og pakkehus. Filtrering av sukkerløsningen med en finmasket sil vil mest sannsynlig gi den mest nøyaktige påvisningen av egg og tidlige larveinnslag11,12.
MS- og Leger Uten Grensers teknikker fungerer godt med frukt som lett kan moses og har et stort volum av masse. Tephritid larver har en tendens til å grave seg inn i fruktmasse, noe som gjør visuell deteksjon vanskelig. Et kritisk aspekt ved MS- og MSF-metodene er å skille larvene fra massen. Sikteprosessen fjerner massen, og utsetter dermed larvene på silskjermer. På samme måte skiller sukkervannmetoden larvene fra massen ved å få larvene til å flyte, mens massen synker til bunnen av pannen. Larver som skilles fra massen ved hjelp av MS- eller MSF-metodene, observeres lett når de beveger seg på silskjermen eller vannoverflaten. Selv om hundekjøring, sikting og eventuelt flytende metode forbedret hastigheten og nøyaktigheten ved påvisning av tephritid larver i viktig vertsfrukt, kan prosessen ikke være egnet for alle frukter. For eksempel kan vertsfrukt med hard masse, som grønn avokado eller frukt med et stort frø / grop og relativt liten mengde masse, som tropiske mandler, være lettere å behandle ved håndskjæring og visuell inspeksjon.
Vi fant at MS- og Leger Uten Grensers metoder var raskere når et relativt lite antall frukt (5-10) ble behandlet. Forskjellen ville sannsynligvis være større hvis større mengder frukt ble behandlet, noe som kan være nødvendig og typisk for nødfruktflueprogrammer. Fjerning av flytetrinnet økte deteksjonshastigheten ytterligere uten at det gikk ut over nøyaktigheten ved funn av store tephritidlarver (>3 mm). Vi viste at disse teknikkene kunne tas til feltet, som simulerte forholdene som arbeiderne opplevde under et nødfruktflueprogram. Våre studier indikerer at MS-metodene kan muliggjøre en raskere påvisning av sene stjernelarver og påfølgende utryddelse av tephritid-avlspopulasjoner. Leger Uten Grenser kan brukes til å oppdage egg og tidlige stjerner som for tiden ikke er mål for utryddelsesprogrammer.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria og Alejandra Canon for hjelp til å behandle guavaen ved University of Florida, Rick Kurashima, Jean Auth og Bruce Inafuku for hjelp til å evaluere den kunstig infiserte frukten på Hawaii, og Michael Stulberg for nyttige kommentarer til tidligere versjoner av manuskriptet. Dette prosjektet ble delvis finansiert av USDA APHIS og University of Florida Cooperative Agreement og støttet delvis av USDA-ARS (prosjekt 2040-22430-027-00D). Funnene og konklusjonene i denne foreløpige publikasjonen har ikke blitt formelt formidlet av USDA og bør ikke tolkes til å representere noen byråbestemmelse eller politikk. Omtalen av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende med det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller godkjenning av USDA. USDA er en likestillingsleverandør og arbeidsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
