Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نمذجة الغشاء الواقعية باستخدام مخاليط الدهون المعقدة في دراسات المحاكاة

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

Summary

يعد تنوع الدهون الغشائية في التركيب والتكوين مساهما مهما في العمليات الخلوية ويمكن أن يكون علامة على المرض. تسمح لنا محاكاة الديناميات الجزيئية بدراسة الأغشية وتفاعلاتها مع الجزيئات الحيوية بدقة ذرية. هنا ، نقدم بروتوكولا لبناء وتشغيل وتحليل أنظمة الأغشية المعقدة.

Abstract

الدهون هي اللبنات الهيكلية لأغشية الخلايا. تختلف أنواع الليبيدات عبر عضيات الخلايا وعبر الكائنات الحية. ينتج عن هذا التنوع خصائص ميكانيكية وهيكلية مختلفة في الغشاء تؤثر بشكل مباشر على الجزيئات والعمليات التي تحدث في هذه الواجهة. تكوين الدهون ديناميكي ويمكن أن يعمل على تعديل عمليات إشارات الخلية. تستخدم الأساليب الحسابية بشكل متزايد للتنبؤ بالتفاعلات بين الجزيئات الحيوية وتوفير رؤى جزيئية للملاحظات التجريبية. الديناميات الجزيئية (MD) هي تقنية تعتمد على الميكانيكا الإحصائية التي تتنبأ بحركة الذرات بناء على القوى التي تعمل عليها. يمكن استخدام محاكاة MD لتوصيف تفاعل الجزيئات الحيوية. هنا ، نقدم بإيجاز التقنية ، ونحدد الخطوات العملية للمبتدئين المهتمين بمحاكاة طبقات الدهون المزدوجة ، ونوضح البروتوكول باستخدام برامج صديقة للمبتدئين ، ونناقش البدائل والتحديات والاعتبارات المهمة للعملية. على وجه الخصوص ، نؤكد على أهمية استخدام مخاليط الدهون المعقدة لنمذجة غشاء الخلية المهم لالتقاط البيئات الميكانيكية والكارهة للماء المناسبة في المحاكاة. نناقش أيضا بعض الأمثلة حيث يعدل تكوين الغشاء وخصائصه تفاعلات الطبقات الثنائية مع الجزيئات الحيوية الأخرى.

Introduction

الدهون هي المكونات الرئيسية للأغشية ، والتي توفر حدودا للخلايا وتمكن من التقسيم داخل الخلايا1،2،3. الدهون هي البرمائيات ، مع مجموعة رأس قطبية واثنين من ذيول الأحماض الدهنية الكارهة للماء. تتجمع هذه ذاتيا في طبقة ثنائية لتقليل ملامسة السلاسل الكارهة للماءبالماء 3,4. ينتج عن مجموعات مختلفة من مجموعات الرأس المحبة للماء والذيول الكارهة للماء فئات مختلفة من الليبيدات في الأغشية البيولوجية ، مثل الجليسيروفوسفوليبيدات ، والشحميات السفينغوبية ، والستيرول (الشكل 1) 1،5،6. الغليسيروفوسفوليبيدات هي اللبنات الأساسية لأغشية الخلايا حقيقية النواة المكونة من الجليسيروفوسفات، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة، ومجموعات الرأس ذات الوزن الجزيئيالمنخفض 7. تعتمد تسميات الدهون على الاختلافات في مجموعات الرأس. ومن الأمثلة على ذلك فوسفاتيديل كولين (PC) ، فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) ، فوسفاتيديل سيرين (PS) ، فوسفاتيديل جليسرول (PG) ، فوسفاتيديل إينوسيتول (PI) ، أو حمض الفوسفاتيديك غير المعدل (PA) 5,6. أما بالنسبة للذيول الكارهة للماء ، فإن طول ودرجة التشبع تختلف ، جنبا إلى جنب مع بنية العمود الفقري. التوليفات المحتملة عديدة ، مما يؤدي إلى الآلاف من أنواع الدهون في خلايا الثدييات6. تؤدي التغييرات في تكوين الدهون الغشائية إلى خصائص غشاء ميكانيكية وهيكلية مختلفة تؤثر على نشاط كل من بروتينات الغشاء المتكامل والبروتينات المحيطية 2,6.

Figure 1
الشكل 1. هياكل الدهون التمثيلية. تظهر ذيول الأحماض الدهنية في مربعات زرقاء، ومجموعات رؤوس الليبيدات الشائعة باللون البرتقالي، والعمود الفقري للعينة باللون الأرجواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الدهون هي لاعبين نشطين في العمليات الخلوية ، وتنشيط البروتين في شلالات الإشارات ، وتوازن الخلايا السليمة 8,9. ديناميات الدهون المتغيرة هي نتيجة للعدوى أو يمكن أن تكون علامات على التسبب في المرض10،11،12،13،14،15. كحواجز للخلية ، فإن دراسة الدهون الغشائية ودورها في تغلغل الجزيئات الصغيرة ذات صلة بأنظمة توصيل الأدوية وآليات تعطيل الغشاء16,17. يؤدي التنوع الكيميائي والنسب المختلفة لأنواع الدهون عبر العضيات والأنسجة والكائنات الحية إلى ديناميكيات غشاء معقدة2. لذلك من المهم الاحتفاظ بهذه الخصائص في دراسات النمذجة للطبقات المزدوجة الدهنية ، خاصة عندما يكون الهدف من الدراسة هو فحص تفاعلات الجزيئات الحيوية الأخرى مع الغشاء. تعتمد الأنواع الدهنية التي يجب مراعاتها في النموذج على الكائن الحي والمقصورة الخلوية محل الاهتمام. على سبيل المثال ، تعتبر دهون PG مهمة لنقل الإلكترون في bateria18 الضوئي ، في حين أن دهون الإينوزيتول المفسفرة (PIPs) هي لاعبين رئيسيين في ديناميكيات غشاء البلازما (PM) وشلالات الإشارات في خلايا الثدييات 19,20. داخل الخلية ، تحتوي أغشية PM والشبكة الإندوبلازمية (ER) و Golgi وأغشية الميتوكوندريا على وفرة فريدة من الدهون تؤثر على وظيفتها. على سبيل المثال ، ER هو محور التكوين الحيوي للدهون وينقل الكوليسترول إلى PM و Golgi. يحتوي على تنوع عالي الدهون مع وفرة من PC و PE ، ولكن محتوى ستيرول منخفض ، مما يعزز سيولة الغشاء21،22،23،24. في المقابل ، يشتمل PM على مئات وحتى آلاف الأنواع الدهنية اعتمادا على الكائن الحي25 ، ويحتوي على مستويات عالية من الدهون السفينغولية والكوليسترول التي تمنحه صلابة مميزة مقارنة بالأغشية الأخرى في الخلية24. يجب مراعاة عدم تناسق الوريقات للأغشية مثل PM ، التي تحتوي على نشرة خارجية غنية بالسفينغوميلين ، و PC ، والكوليسترول ، ونشرة داخلية غنية ب PE و PI و PS التي تعتبر مهمة للإشارة إلى الشلالات24. أخيرا ، يدفع تنوع الدهون أيضا إلى تكوين مجالات دقيقة تختلف في التعبئة والنظام الداخلي ، والمعروفة باسم طوافات الدهون24,26 ؛ تظهر هذه عدم التماثل الجانبي ، ويفترض أنها تلعب أدوارا مهمة في الإشارات الخلوية26 ، ويصعب دراستها بسبب طبيعتها العابرة.

تم استخدام التقنيات التجريبية مثل التنظير الفلوري والتحليل الطيفي وأنظمة الأغشية النموذجية مثل الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) للتحقيق في تفاعلات الجزيئات الحيوية مع الأغشية. ومع ذلك ، من الصعب التقاط الطبيعة المعقدة والديناميكية للمكونات المعنية بالطرق التجريبية وحدها. على سبيل المثال ، هناك قيود على تصوير المجالات عبر الغشاء للبروتينات ، وتعقيد الأغشية المستخدمة في مثل هذه الدراسات ، وتحديد الحالات الوسيطة أو العابرة أثناء عملية الاهتمام27،28،29. منذ ظهور المحاكاة الجزيئية للطبقات الأحادية الدهنية والطبقات الثنائية في ثمانينيات القرن العشرين29 ، يمكن الآن تحديد أنظمة البروتين الدهني وتفاعلاتها على المستوى الجزيئي. محاكاة الديناميات الجزيئية (MD) هي تقنية حسابية شائعة تتنبأ بحركة الجسيمات بناء على قواها بين الجزيئات. يصف جهد التفاعل الإضافي التفاعلات المرتبطة وغير المرتبطة بين جسيمات النظام30. تسمى مجموعة المعلمات المستخدمة لنمذجة هذه التفاعلات حقل قوة المحاكاة (FF). يتم الحصول على هذه المعلمات من حسابات ab initio ، والحسابات شبه التجريبية ، وميكانيكا الكم ، والأمثل للبيانات المستنسخة من تجارب الأشعة السينية وحيود الإلكترون ، والرنين المغناطيسي النووي ، والأشعة تحت الحمراء ، والتحليل الطيفي للنيوترونات ، من بين طرق أخرى31.

يمكن استخدام محاكاة MD لدراسة الأنظمة على مستويات مختلفة من الدقة32،33،34. تتم دراسة الأنظمة التي تهدف إلى توصيف تفاعلات جزيئية حيوية محددة ، وروابط هيدروجينية ، وتفاصيل أخرى عالية الدقة باستخدام محاكاة جميع الذرات (AA). في المقابل ، تقوم عمليات المحاكاة الخشنة (CG) بتجميع الذرات في مجموعات وظيفية أكبر لتقليل التكلفة الحسابية وفحص ديناميكيات النطاقالأكبر 33. تقع بين هذين المحاكاة للذرة المتحدة (UA) ، حيث يتم دمج ذرات الهيدروجين مع ذراتها الثقيلة لتسريع الحساب33,35. تعد محاكاة MD أداة قوية لاستكشاف ديناميكيات الأغشية الدهنية وتفاعلاتها مع الجزيئات الأخرى ويمكن أن تعمل على توفير آليات المستوى الجزيئي للعمليات ذات الأهمية في واجهة الغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تعمل محاكاة MD على تضييق نطاق الأهداف التجريبية والتنبؤ بالخصائص الجزيئية الكبيرة لنظام معين بناء على التفاعلات المجهرية.

باختصار ، بالنظر إلى مجموعة من الإحداثيات الأولية والسرعات ومجموعة من الشروط مثل درجة الحرارة والضغط الثابتين ، يتم حساب مواضع وسرعات كل جسيم من خلال التكامل العددي لجهد التفاعل وقانون نيوتن للحركة. يتكرر هذا بشكل متكرر ، وبالتالي توليد مسار محاكاة30. يتم إجراء هذه الحسابات باستخدام محرك MD ؛ من بين العديد من الحزم مفتوحة المصدر ، يعد GROMACS36 أحد أكثر المحركات استخداما والذي وصفناه هنا. ويشمل أيضا أدوات لتحليل وبناء الإحداثيات الأولية للنظم المراد محاكاتها37. تشمل محركات MD الأخرى NAMD38. CHARMM39 و AMBER40 ، والتي يمكن للمستخدم اختيارها وفقا لتقديره الخاص بناء على الأداء الحسابي لنظام معين. من الأهمية بمكان تصور المسارات أثناء المحاكاة وكذلك لتحليل النتائج وتفسيرها. تتوفر مجموعة متنوعة من الأدوات. نناقش هنا الديناميات الجزيئية المرئية (VMD) التي تقدم مجموعة واسعة من الميزات ، بما في ذلك التصور ثلاثي الأبعاد (3-D) مع طرق الرسم والتلوين الموسعة ، وتصور البيانات الحجمي ، وبناء وإعداد وتحليل مسارات أنظمة محاكاة MD ، وصنع فيلم المسار بدون حدود لحجم النظام ، إذا كانت الذاكرة متوفرة41،42،43.

تتأثر دقة الديناميكيات المتوقعة بين مكونات النظام بشكل مباشر ب FF المختار لنشر المسار. يتم متابعة جهود معلمات FF التجريبية من قبل عدد قليل من مجموعات البحث. تشمل FF الأكثر رسوخا وشيوعا ل MD CHARMM39 و AMBER 40 و Martini44 و OPLS 45 و SIRAH 46. يستخدم مجال القوة المضافة لجميع الذرات CHARMM36 (C36)47 على نطاق واسع ل AA MD لأنظمة الأغشية لأنه يعيد إنتاج البيانات الهيكلية التجريبية بدقة. تم تطويره في الأصل من قبل مجتمع CHARMM ، وهو متوافق مع العديد من محركات MD مثل GROMACS و NAMD. على الرغم من التحسينات عبر FFs الشائعة ، هناك جهد مستمر لتحسين مجموعات المعلمات للسماح بالتنبؤات التي تعيد إنتاج الملاحظات التجريبية عن كثب ، مدفوعة بالمصالح في أنظمة معينة للدراسة48,49.

يتمثل التحدي عند محاكاة الأغشية الدهنية في تحديد طول مسار المحاكاة. يعتمد هذا إلى حد كبير على المقاييس التي سيتم تحليلها والعملية التي يهدف المرء إلى توصيفها. عادة ما تتطلب مخاليط الليبيدات المعقدة وقتا أطول للوصول إلى الاتزان؛ حيث يجب أن يكون لدى المزيد من الأنواع وقت كاف للانتشار على مستوى الغشاء والوصول إلى تنظيم جانبي مستقر. يقال إن المحاكاة تكون في حالة توازن عندما تصل خاصية الاهتمام إلى هضبة وتتقلب حول قيمة ثابتة. من الممارسات الشائعة الحصول على ما لا يقل عن 100-200 نانوثانية من المسار المتوازن لإجراء تحليل إحصائي مناسب على الخصائص والتفاعلات ذات الاهتمام. من الشائع إجراء عمليات محاكاة غشائية فقط بين 200-500 نانوثانية ، اعتمادا على مدى تعقيد خليط الدهون وسؤال البحث. تتطلب تفاعلات البروتين والدهون عادة أوقات محاكاة أطول ، بين 500-2000 نانوثانية. وفيما يلي بعض النهج لتسريع أخذ العينات والديناميات التي يمكن ملاحظتها باستخدام النظم الغشائية: '1' نموذج المحاكاة الغشائية العالية الحركة، الذي يستعيض عن الكربونات الطرفية للدهون في الغشاء بالمذيب العضوي لتسريع أخذ العينات 50؛ و '2' نموذج المحاكاة الغشائية العالية الحركة، الذي يستعيض عن الكربونات الطرفية للدهون في الغشاء بالمذيب العضوي لتسريع أخذ العينات 50؛ و '2' نموذج المحاكاة الغشائية العالية الحركة، الذي يستعيض عن الكربونات الطرفية للدهون في الغشاء بالمذيب العضوي لتسريع أخذ العينات50؛ و '2' نموذج المحاكاة الغشائية العالية الحركة، الذي يستعيض عن الكربونات الغشائية العالية الحركة (HMMM)، الذي يستعيض عن و (ii) إعادة تقسيم كتلة الهيدروجين (HMR) ، والذي يجمع جزءا صغيرا من كتل الذرات الثقيلة داخل النظام مع تلك الخاصة بذرات الهيدروجين للسماح باستخدام محاكاة أكبر للخطوةالزمنية 51.

يناقش البروتوكول التالي نهجا صديقا للمبتدئين لبناء وتشغيل وتحليل نماذج الأغشية الواقعية باستخدام AA MD. نظرا لطبيعة محاكاة MD ، يجب تشغيل مسارات متعددة لمراعاة قابلية التكرار والتحليل الإحصائي المناسب للنتائج. من الممارسات الحالية تشغيل ثلاث نسخ متماثلة على الأقل لكل نظام من أنظمة الاهتمام. بمجرد اختيار الأنواع الليبيدة للكائن الحي والعملية محل الاهتمام، يتم توضيح وتلخيص الخطوات الأساسية لبناء مسار محاكاة لنظام الغشاء فقط وتشغيله وتحليله.

Figure 2
الشكل 2. تخطيطي لتشغيل محاكاة MD. تتوافق المربعات البرتقالية مع الخطوات الرئيسية الثلاث الموضحة في البروتوكول. يوجد تحتها سير عمل عملية المحاكاة. أثناء إعداد النظام ، يتم بناء النظام الذي يحتوي على الإحداثيات الأولية لنظام الغشاء المذاب باستخدام مولد إدخال النظام مثل CHARMM-GUI Membrane Builder. بعد نقل ملفات الإدخال إلى مجموعة حوسبة عالية الأداء ، يتم نشر مسار المحاكاة باستخدام محرك MD ، مثل GROMACS. يمكن إجراء تحليل المسار على مجموعة الكمبيوتر أو محطة عمل محلية جنبا إلى جنب مع التصور. ثم يتم إجراء التحليل ، باستخدام الحزم التي تحتوي على كود تحليل مدمج مثل GROMACS و VMD ، أو باستخدام نصوص Bash أو مكتبات Python المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء إحداثيات النظام

  1. انتقل إلى CHARMM-GUI.org (C-GUI) باستخدام متصفح الويب. في القائمة العلوية ، انتقل إلى مولد الإدخال ، ثم حدد Membrane Builder من الخيارات الرأسية على الجانب الأيسر من الشاشة.
  2. لإنشاء طبقة ثنائية، حدد منشئ الطبقة الثنائية.
    ملاحظة: يجب على المستخدمين لأول مرة تنشيط حسابهم المجاني قبل إنشاء أول مجموعة من الإحداثيات.
  3. حدد نظام الغشاء فقط. احفظ معرف JOB الذي تم إنشاؤه لاسترداد النظام والمتابعة من حيث توقفت أثناء العملية إذا لزم الأمر.
    1. تصور الأنظمة أثناء كل خطوة من خطوات عملية البناء بالنقر فوق عرض الهيكل في المربع الموجود أعلى الصفحة ، أو عن طريق تنزيل ملف PDB الناتج. ابحث عن المكونات المفقودة أو الأخطاء في أنواع الدهون المدخلة المحددة أو حجم الرقعة.
  4. حدد مكونات النظام.
    1. اختر خيار الدهون غير المتجانسة ، حتى في حالة بناء طبقة ثنائية أحادية المكون ؛ ثم حدد نوع مربع مستطيل .
    2. حدد 45 جزيء ماء لكل دهون لخيار الترطيب ؛ هذا يكفي لضمان طبقة ثنائية رطبة بالكامل.
    3. اضبط طول XY ليكون بناء على عدد مكونات الدهون. بعد ذلك، حدد عدد الليبيدات المراد تضمينها لكل نوع من أنواع الليبيدات المحدد قبل النموذج. بالنسبة لدراسة الحالة التي تمت مناقشتها في القسم التالي ، تم بناء نموذج غشائي يحتوي على 600 دهون موزعة بشكل متماثل في ورقتين. لنمذجة ER للخلايا حقيقية النواة ، تم استخدام خليط من 336 DOPC ، 132 DPPE ، 60 CHOL ، 72 POPI lipids لنموذج PI. و 330 DOPC و 126 DPPE و 54 CHOL و 66 POPI و 24 DOPS من الدهون لنموذج PI-PS.
      ملاحظة: توفر C-GUI مكتبة من الهياكل الدهنية للاختيار من بينها ؛ انقر على الصور بجوار اسم النوع لتركيبه الكيميائي.
    4. اكتب العدد المطلوب من الجزيئات في النشرة العلوية والسفلية في المربعين بجوار اسم الليبيد. بالنسبة لدراسة الحالة ، من المرغوب فيه تكوين غشاء متماثل - تأكد من عدم وجود أخطاء حول عدد غير متطابق من الدهون في النشرة العلوية والنشرة السفلية. إذا كان عدم التماثل مطلوبا ، فتأكد من صحة العدد الإجمالي للدهون في كل نشرة. للحصول على تفاصيل حول بناء طبقات ثنائية غير متماثلة ، راجع عمل Park et al.52,53.
    5. انتقل إلى أعلى قائمة أنواع الدهون وانقر على زر إظهار معلومات النظام. تجميع المكونات واستكمال النظام.
    6. حدد الخيار لتضمين الأيونات المعادلة باستخدام الخوارزمية القائمة على المسافة للتقارب الأسرع54.
    7. اترك تركيز المحلول الافتراضي ل KCl عند 0.15 mM. هذا تركيز ملح نموذجي لجعل صندوق المحاكاة محايدا للطبقات المزدوجة الغشائية.
      ملاحظة: إذا كان سيتم استخدام تركيز مختلف ، فتأكد من النقر فوق الزر "حساب تركيبة المذيبات " بعد تحريره.
  5. حدد شروط وإعدادات المحاكاة.
    1. حدد CHARMM36m كخيار FF ؛ يستخدم بشكل شائع لمحاكاة الدهون والبروتين ، ولكن يمكن للمستخدم تحديد خيارات أخرى تمت مناقشتها في المقدمة.
    2. حدد GROMACS كمحرك MD للحصول على ملفات إدخال نموذجية بالتنسيق المقابل.
      ملاحظة: يوصى باستخدام GROMACS للمستخدمين الجدد لأنه يحتوي على العديد من الموارد والبرامج التعليمية والمنتديات عبر الإنترنت للحصول على الدعم. يمكن للمستخدم الاختيار من بين محركات MD متعددة لاستكشاف الخيارات من حيث أداء المحاكاة وبناء جملة التعليمات البرمجية.
    3. حدد مجموعة Constant Particle-Pressure-Temperature (NPT) ، وهي المجموعة الديناميكية الأكثر استخداما في محاكاة الطبقات الثنائية للدهون.
    4. اضبط درجة الحرارة والضغط في كلفن والقضبان على 303 كلفن و 1 بار على التوالي. من المعتاد ضبط درجة الحرارة بين 298 كلفن و 310 كلفن لدراسة العمليات البيولوجية لضمان وجود طبقة ثنائية في حالة الاضطراب السائل.
      ملاحظة: تعتمد درجة الحرارة على ظروف العملية المراد محاكاتها ويمكن تغييرها حسب الحاجة. اعتمادا على أنواع الدهون في النموذج ، اضبط درجة الحرارة لتكون أعلى من درجة حرارة الانتقال لمكونات الدهون النقية قبل تشغيل المحاكاة.
  6. قم بتنزيل الملفات الناتجة ونقلها إلى مجموعة الكمبيوتر.
    1. تصور النظام النهائي على برنامج من اختيارك ، مثل VMD أو PyMol ، وفحص الإعداد المناسب.
      ملاحظة: من الجيد التحقق ، على سبيل المثال ، من وجود كمية كافية من الماء حول الغشاء بحيث لا تتفاعل الدهون مع ذرات الصورة أثناء المحاكاة ، وإعداد الوريقات المناسب (طبقة ثنائية بدون مسافة أو ماء بينهما).

2. تشغيل محاكاة MD

  1. قم بتحميل الملفات وفك ضغطها من C-GUI على مجموعة الحوسبة الخاصة بك. انتقل إلى دليل جروماك . إنشاء برنامج نصي لإرسال الاسترخاء.
  2. اتبع إرشادات المجموعة لتنسيق البرنامج النصي للإرسال.
    1. انسخ الأوامر المدرجة حتى أعلى تعليق # Production مباشرة في ملف README إلى البرنامج النصي للإرسال.
      ملاحظة: هذا الإعداد الافتراضي من C-GUI هو حلقة تقوم بتشغيل استرخاء من 6 خطوات للنظام. إذا كنت ترغب في بروتوكول مختلف وراسخ ، فقم بتحريره لقراءة الإحداثيات التي تم إنشاؤها وتنزيلها للتو من C-GUI.
  3. أرسل البرنامج النصي للاسترخاء وتأكد من تنزيل جميع ملفات الإخراج لجميع الخطوات قبل الانتقال إلى تشغيل الإنتاج. عند الانتهاء ، تحقق من ملفات الإخراج التالية من GROMACS ، التي تم إنشاؤها أثناء تشغيل 6 خطوات: * .log ، * .tpr ، * .gro ، * .edr ، * .trr / * .xtc
  4. إنشاء برنامج نصي لتشغيل الإنتاج.
    1. استخدم إحدى عينات أوامر gmx grompp و gmx mdrun من أي من خطوات الاسترخاء كقالب.
    2. قبل استخدام البرنامج النصي ، تأكد من إنشاء ملف * .mdp يحتوي على خيارات محاكاة مماثلة لملف step7_production.mdp المتوفر.
      ملاحظة: الخيارات الافتراضية المقدمة قياسية لمحاكاة الأغشية ؛ يتم سرد ditances في نانومتر ويتم إعطاء الوقت في بيكو ثانية أو عدد الخطوات (بيكو ثانية / خطوة وقت التكامل). قم بتحديث nsteps للتشغيل حتى طول المحاكاة المطلوب (هذا يساوي dt * nsteps) و nst [x ، v ، f] لتحديث تردد توفير البيانات في عدد خطوات التكامل. بالنسبة لدراسة الحالة ، اضبط nsteps على 250,000,000 لطول محاكاة يبلغ 500ns (وقت المحاكاة / خطوة التكامل = 500,000 ps / 0.002ps) ، و nst [x ، v ، f] out إلى 50,000 لحفظ البيانات كل 100 ps
  5. قبل تشغيل المحاكاة الفعلية ، قم بإجراء دراسات معيارية لتحديد أفضل استخدام للموارد.
    1. قم بتشغيل النظام لمدة 1-2 نانوثانية باستخدام عدد مختلف من عقد الحوسبة.
      ملاحظة: تم تقديم دراسة حالة ER على مجموعة الحوسبة عالية الأداء في مركز UB للبحوث الحاسوبية (CCR)55 مقابل 2 نانوثانية ، حيث تم اختبار الأداء لعقد 1-10.
    2. قارن الأداء في ns/day لكل إعداد لتحديد الموارد المثلى للتشغيل. من الممارسات الشائعة تحديد عدد العقد التي تؤدي إلى 75٪ -80٪ من الحد الأقصى للأداء.
  6. قم بتشغيل تشغيل الإنتاج.
    1. تشغيل كل نظام في ثلاث نسخ لضمان التكرار وإجراء تحليل إحصائي على البيانات.
    2. قم بتوسيع المسار استنادا إلى المعايير في حالة نفاد وقت الانتظار المسموح به للإرسال على مجموعة الحوسبة. استخدم أوامر gmx convert-tpr ، ثم أوامر gmx mdrun لمتابعة جمع المسار.
      ملاحظة: الخيارات موضحة في وثائق جروماكس عبر الإنترنت (https://manual.gromacs.org/).
    3. بالنسبة لنظام الغشاء فقط ، افحص ما إذا كان النظام قد وصل إلى حالة التوازن عن طريق حساب المساحة لكل ليبيد بمرور الوقت. إذا لم يحدث ذلك ، فقم بتمديد مسار المحاكاة.

3. تحليل المسار

  1. تصور النظام قبل إجراء التحليل لتحديد الجزيئات ذات الأهمية وجزء من المسار المخصص للتوصيف.
  2. ضغط ملفات المسار الخام (* .trr) عن طريق تغيير تنسيق الملف إلى * .xtc و / أو تخطي الإطارات لتقليل حجم الملف وتسهيل النقل الأكثر كفاءة إلى المحطة المحلية للتصور والتحليل.
    ملاحظة: بالنسبة لأنظمة الأغشية الكبيرة ، قد يختار المرء تجريد الماء من المسار لتقليل حجم الملف بشكل أكبر. يمكن القيام بذلك باستخدام ملفات الفهرس على GROMACS أو نصوص TCL على VMD أو مكتبات Python مثل MDAnalysis و MDTraj.
  3. قم بإجراء التحليلات المختارة خلال الجزء المتوازن من المسار ، كما هو محدد من السلاسل الزمنية للمساحة لكل دهون.
    ملاحظة: ارجع إلى المناقشة لمزيد من التفاصيل حول تحليلات الأغشية النموذجية وكيفية تشغيلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح استخدام البروتوكول والنتائج التي يمكن الحصول عليها ، تمت مناقشة دراسة مقارنة لنماذج الأغشية للشبكة الإندوبلازمية (ER). النموذجان في هذه الدراسة هما (i) نموذج PI ، الذي يحتوي على الأنواع الدهنية الأربعة الأولى الموجودة في ER ، و (ii) نموذج PI-PS ، الذي أضاف أنواع الدهون الأنيونية فوسفاتيديل سيرين (PS). تم استخدام هذه النماذج لاحقا في دراسة البروتين الفيروسي وكيفية تفاعله مع الغشاء ، وقد تم الاستشهاد بالاهتمام ب PS باعتباره مهما لنشاط نفاذية البروتينالفيروسي 23. لدمج التنوع في هياكل الذيل الدهنية ، تم تعيين تركيبات الغشاء على النحو التالي: DOPC: DPPE: CHOL: POPI (56: 22: 10: 12 mol٪) و DOPC: DPPE: CHOL: POPI: DOPS (55: 21: 11: 9: 4 mol٪).

تم إنشاء الأغشية باستخدام منشئ غشاء CHARMM-GUI. لاستيعاب 4 أنواع مختلفة من الدهون وبعد ذلك البروتين ، تم تعيين الأغشية المتماثلة لتحتوي على 600 دهون / نشرة. تم استخدام الإعدادات الموصى بها في البروتوكول ، مع درجة حرارة 303 كلفن. لضمان النسخ المتماثلة المستقلة ، تكررت عملية البناء ثلاث مرات لكل نموذج غشاء ، مما أدى إلى خليط عشوائي مختلف من الدهون في كل مرة. بعد بناء الأنظمة ، تم نقل ملفات الإدخال إلى مركز UB للبحوث الحاسوبية (CCR) مجموعة الحوسبةعالية الأداء 55 لتشغيل محاكاة MD باستخدام إصدار GROMACS 2020.5. بعد اكتمال بروتوكول الاسترخاء المكون من 6 خطوات ، تم إجراء المقارنة المعيارية على نظام واحد فقط لكل نموذج (الشكل 3) نظرا لأن عدد الذرات متشابه عبر جميع النسخ المتماثلة. كان 75٪ من الحد الأقصى للأداء ~ 78 نانوثانية / يوم ، وبالتالي ، تم طلب 6 عقد على الأكثر على الكتلة لعمليات الإنتاج. تم تشغيل كل نسخة متماثلة لما يصل إلى 500 نانوثانية عن طريق تعيين nstep = 25 × 107 في ملف * .mdp وإرسال ملحقات إلى الكتلة حسب الحاجة بناء على المعايير.

Figure 3
الشكل 3. عينة من عمليات تشغيل المعايير. يستخدم لتحديد أداء نموذج PI (315000 ذرة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل 4 المساحة لكل ليبدة (APL) لكل نسخة متماثلة. تم حساب ذلك من أبعاد XY لصندوق المحاكاة المخزن في ملف إخراج محاكاة * edr من GROMACS باستخدام برنامج الطاقة المدمج. بعد ذلك، قسمت مساحة السطح الكلية على عدد الليبيدات الكلية لكل وريقة لتقديم تقدير للوحدة التحميل الآلي للقطع في كل نموذج. بالنسبة لجميع الأنظمة ، تم تحديد التوازن على أنه النقطة التي تصل فيها وحدة التحميل الآلي للقطع إلى هضبة وتتقلب حول قيمة ثابتة. في جميع هذه الأنظمة ، يتم الوصول إلى التوازن ضمن أول 100 نانوثانية من المسار (انظر الشكل 4). بناء على هذا المقياس ، تم اعتبار مسارات 500 نانوثانية كافية لهذه الأنظمة. تم إجراء جميع التحليلات الأخرى على هذه الطبقات الثنائية على مدار آخر 400 نانوثانية من المسار ، والمعروفة باسم المرحلة المتوازنة أو مرحلة الإنتاج. لتحديد عدم اليقين في كل قيمة محسوبة ، يوصى بمتوسط الكتلة كل 10-20 نانوثانية. من تحليل APL ، يحتوي نموذج غشاء PI-PS ، في المتوسط ، على مساحة سطح أكبر بمقدار 0.7 Å2 من نموذج PI.

Figure 4
الشكل 4. أمثلة على المساحة لكل دهون. (أ) نماذج PI و (B) PI-PS. يتم عرض النسخ المتماثل 1 والنسخ المتماثل 2 والنسخ المتماثل 3 لكل نموذج باللون الأحمر والأزرق والأخضر. يحدث التوازن لجميع الأنظمة في أول 100 نانوثانية. يتم الإبلاغ عن عدم اليقين باعتباره الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تحليلين بسيطين حول بنية الغشاء. يوضح الشكل 5 سمك الغشاء، مقيدا بالمسافة بين مركز الكتلة (COM) لذرات الفوسفات في الفوسفوليبيدات في الوريقتين العلوية والسفلية. تم حساب ذلك باستخدام برنامج المسافة في GROMACS ، والذي يتطلب ملف فهرس يسرد مجموعتين ذريتين ، واحدة لمجموعات الفوسفات في النشرة العلوية ومجموعة أخرى لتلك الموجودة في النشرة السفلية. أظهرت النتائج فرقا إحصائيا بين سمك النموذجين الغشائيين، موضحة وجود علاقة عكسية بين APL وسمك الغشاء. وأخيرا، يوضح الشكل 6 معلمات ترتيب الديوتيريوم لكل نوع من أنواع الليبيدات، وهو مقياس يحدد ترتيب ذيول الليبيدات داخل النواة ثنائية الطبقة الكارهة للماء56. تصنف ذيول الأحماض الدهنية على أنها sn1 ، وهي ذيول متصلة بالأكسجين الطرفي لهيكل الجلسرين ، و sn2 ، متصلة بالأكسجين المركزي لمجموعة الجلسرين. تظهر النتائج أن هناك فرقا ضئيلا أو معدوما بين ترتيب ذيول الدهون بين النماذج ، باستثناء DPPE الذي يظهر زيادة طفيفة في ترتيب ذيل sn1 في نموذج PI.

Figure 5
الشكل 5. أمثلة على سمك الغشاء. (أ) نماذج PI و (B) PI-PS. يتم عرض النسخ المتماثل 1 والنسخ المتماثل 2 والنسخ المتماثل 3 لكل نموذج باللون الأحمر والأزرق والأخضر. يتم الإبلاغ عن عدم اليقين باعتباره الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6. أمثلة على معلمات ترتيب الديوتيريوم. أ: DOPC، ب: DPPE، ج: POPI، د: أنواع الدهون DOPS. خطوط متصلة ل sn1 وخطوط متقطعة ل sn2 وطراز PI باللون الأحمر وطراز PI-PS باللون الأزرق. يتم الإبلاغ عن عدم اليقين باعتباره الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن استخدام نماذج الأغشية المعقدة لدراسة أهمية أنواع معينة من الدهون وكيف تعدل هذه التفاعلات بين الجزيئات الحيوية والغشاء. تظهر دراسات العينة من المختبر: (1) يعدل تكوين الغشاء تفاعلات البروتينات19 ، و (2) تشبع ذيل الدهون وتخلل تأثير شحنة سطح الغشاء والتنظيم الجانبي للجزيئات الصغيرة17,57. باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه والتحليل المماثل لذلك المقدم في الفقرات السابقة ، يقدم عمل Li et al. رؤى من التجربة والمحاكاة حول التفاعل بين D112 ، وهو عامل علاج ديناميكي ضوئي محتمل ، ومخاليط دهنية مختلفة17. تم فحص طبقة ثنائية مع دهون PC و PS في تجربة لتوصيف تقسيم D112 في الطبقة الثنائية. أجرينا عمليات محاكاة لحصص مختلفة من دهون PC و PS ، مع اختلاف أطوال ذيل الأحماض الدهنية والتشبع ، أي عدد الروابط المزدوجة ، لتحديد تأثير الشحنة السطحية والبيئة الكارهة للماء على تفاعل غشاء D112. بينما تدفع التفاعلات الكهروستاتيكية الارتباط الأولي ل D112 إلى دهون PS الأنيونية ، فإن التفاعلات الكارهة للماء تسحب الجزيء إلى قلب الغشاء عبر آليتين محتملتين (انظر الشكل 7A-B). داخل الغشاء ، يتم توطين D112 بشكل تفضيلي في المجالات الغنية بالكمبيوتر الشخصي ، إما كمونومر أو ديمر.

Figure 7
الشكل 7. نظام عينة إضافية يتبع البروتوكول المقدم. محاكاة D112 مع أغشية نموذجية تحدد آليتين للإدخال (أ) الحربة و (ب) الوجه ؛ (ج) اتجاه دايمرات D112؛ د: التوزيع الجانبي لجزيئات D112 (الخرائط الكنتورية الزرقاء) على نموذج غشائي فيما يتعلق بالليبيدات المشحونة (العناقيد البرتقالية). يمكن العثور على دراسة كاملة في 17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن للتقنيات التجريبية تصور الجزيئات الحيوية بدقة عالية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM)58 ، وتقنيات التألق ، ومجهر القوة الذرية (AFM)59. ومع ذلك ، من الصعب التقاط التفاعل وديناميكيات التفاعلات الجزيئية التي تكمن وراء المسارات البيولوجية ، والتسبب في المرض ، والتسليم العلاجي على المستوى الذري أو الأحماض الأمينية. هنا ، تمت مناقشة قدرات محاكاة MD لدراسة الأغشية الدهنية والخطوات الرئيسية لتصميم وبناء وتشغيل وتحليل هذه الأنظمة. ميزة هذه الطريقة الحسابية هي التفاصيل الذرية والمعادلات الأساسية التي نمذجة التفاعلات الجزيئية لاقتراح وتوصيف الآليات الجزيئية في واجهة الغشاء.

الخطوة الحاسمة عند محاكاة أغشية الخلايا هي فهم قوي للنظام البيولوجي المراد دراسته. تعتمد أنواع الدهون المراد تضمينها على الكائن الحي ، والمقصورة الخلوية ، والأهم من ذلك ، العملية المراد دراستها. تعد عمليات المحاكاة ذات الأغشية المتماثلة نقطة انطلاق جيدة لمستخدمي MD المبتدئين. عدم التماثل ، على الرغم من أنه سمة معروفة للأغشية مثل PM ، يضيف صعوبات محتملة لأنه يتطلب أوقات محاكاة أطول لأخذ عينات من الانتشار الجانبي وتبادل الستيرول بين الوريقات بشكل صحيح. يقدم عدم التماثل أيضا عدم تطابق في وحدة التحميل الآلي للقطع لكل نشرة يجب معالجتها بعناية في المحاكاة52,53. خطوة أخرى مهمة هي تحديد حجم رقعة الغشاء المراد محاكاتها ، والتي تعتمد على تعقيد خليط الدهون والموارد الحسابية المتاحة ؛ تستغرق رقع الغشاء الأكبر وقتا أطول للحوسبة ، وهو ما قد لا يكون ممكنا دائما. يوصى بحجم لا يقل عن 150 دهون / نشرة للأنظمة المتجانسة أو الثنائية ، وما يصل إلى 600 دهون / نشرة للتركيبات الأكثر تعقيدا. إذا تم استخدام نموذج الغشاء لدراسات غشاء البروتين ، فإن القاعدة الأساسية الجيدة هي عمل رقعة غشائية يمكن أن تستوعب ما بين 2-3 أضعاف أطول بعد للبروتين. عند فحص الجزيئات الصغيرة ، يجب أن تظل تغطية حجم الرقعة أقل من 30٪ -40٪ لتجنب تأثيرات الحجم المحدود. اعتمادا على المقياس لتحديد التوازن ، قد تتطلب مخاليط الدهون المعقدة بسهولة أوقات محاكاة أطول 3 مرات على الأقل مقارنة بالمخاليط الدهنية النقية أو المخاليط الثنائية.

هناك خيارات متعددة لإعداد الإحداثيات الأولية للمحاكاة الجزيئية الحيوية. تتضمن حزم البرامج الشائعة GROMACS36 و VMD 42 و PACKMOL60 و Moltemplate 61 و CHARMM-GUI 62. C-GUI عبارة عن منصة قائمة على الويب مصممة لتسهيل بناء هذه الأنظمة ، مع مجموعة متنوعة من الجزيئات في مكتبة الدهون الخاصة بها. يوفر ملفات إدخال لمحركات MD المختلفة ومعلمات مجال القوة ، مما يجعله نقطة انطلاق رائعة للمبتدئين. أثناء خطوات البناء ، توفر C-GUI تقديرات للمساحة لكل دهون لأنواع الدهون الفردية. من المفيد زيادة هذا التقدير بنسبة 10٪ -15٪ عند بناء مخاليط دهنية معقدة (5+ أنواع) ، خاصة في حالة استخدام الستيرول في النموذج. إذا لم يتم العثور على دهون ذات أهمية في مكتبة C-GUI ، فيمكن للمرء استخدام بنية دهنية قريبة كحامل نائب ثم تعديل البنية باستخدام نصوص VMD أو Python بعد البناء والاسترخاء الأولي للنظام. نظرا لأن C36m هو مجال قوة مضافة63 ، فلا توجد عادة حاجة إلى إعادة تحديد المعلمات لبنية الدهون المحدثة ، بشرط أن تكون جميع أنواع الذرات في الجزيء الجديد موجودة في مجال القوة. وتجدر الإشارة إلى أنه لم يتم تغطية جميع الخيارات المتاحة على واجهة المستخدم الرسومية C-GUI في هذا البروتوكول ، ولكن تم عرض الخيارات ذات الصلة بالمبتدئين وتلك التي تتماشى مع الممارسات الشائعة في هذا المجال ؛ تمت معالجة الخيارات المتقدمة ونشرها من قبل المطورين54،62،64.

تعتمد ظروف المحاكاة مثل المجموعة الديناميكية الحرارية ودرجة الحرارة والضغط على طبيعة الدراسة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم الاحتفاظ بالشروط كافتراضيات في C-GUI ، والتي تعتبر نموذجية لمحاكاة الغشاء في مرحلة السائل. مرحلة الهلام غير مرغوب فيها لنمذجة الأغشية البيولوجية ، فهي تحدث تحت درجة حرارة انتقال الدهون ، ومن السهل التعرف عليها من خلال المحاذاة المتوازية لذيول الدهون بزاوية. قد يتغير هذا لأهداف الدراسة المختلفة أو وفقا لتجارب المتعاونين ، إن وجدت. أثناء تشغيل MD ، تتضمن الإعدادات النموذجية للطبقات الثنائية الغشائية ما يلي: (1) 1-4 fs timestep ل AA MD لالتقاط أسرع الحركات الاهتزازية لروابط الهيدروجين والأكسجين65 ؛ عادة ما يتم استخدام 2 fs للإنتاج ، ولكن يتم استخدام 1 fs أثناء خطوات الاسترخاء والتقليل ، ويمكن استخدام 4 fs إذا تم استخدام HMR51 ؛ (2) ترددات توفير البيانات بين 0.05-0.2 نانوثانية هي ممارسة شائعة ؛ (3) مخطط قطع Verlet66 ، مع قطع ناعم وصلب يبلغ 1.0 و 1.2 نانومتر لتفاعلات فان دير فال. يؤدي تعيين نصف قطر قطع أكبر إلى تقليل أداء المحاكاة حيث يتم حساب المزيد من التفاعلات بين أزواج الذرات ؛ ومع ذلك ، هناك حاجة إلى قطع أكبر لحساب ملامح الضغط الجانبي ، والتي تتطلب عادة قطعا يتراوح بين 2.0 و 2.4 نانومتر ؛ (4) يتم استخدام مخطط شبكة الجسيمات إدوارد (PME)67 مع قطع 1.2 نانومتر للتفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى ؛ (5) تستخدم خوارزمية LINCS68 في GROMACS لتقييد الروابط الهيدروجينية ؛ (6) جهاز التحكم في الضغط الشائع هو باروستات Parrinello-Rahman المطبق بشكل شبه متناحي للطبقات الثنائية ؛ (7) جهاز التحكم في درجة الحرارة الشائع هو ترموستات Nose-Hoover. لاحظ أن هناك أنواعا متعددة من الباروستات والثرموستات التي يمكن استخدامها في المحاكاة وتعتمد على طبيعة الدراسة69.

تعد APL وسمك الغشاء والتقليب بالتخبط من مقاييس شائعة لتحديد ما إذا كان النظام قد وصل إلى التوازن الحراري ، والذي يمكن أن يتراوح من 50 نانوثانية للطبقات الثنائية النقية إلى 4000 نانوثانية للمخاليط غير المتماثلة المعقدة اعتمادا على المقياس المختار. يجب حساب تحليل الخصائص الميكانيكية والهيكلية والديناميكية للطبقة الثنائية بعد الوصول إلى التوازن ، أي بمجرد أن تصل خاصية الاهتمام إلى هضبة وتتقلب فيما يتعلق بمتوسط القيمة. يجب أن يكون الجزء المتوازن من المسار ، المعروف أيضا باسم مرحلة الإنتاج ، 100 نانوثانية على الأقل للتحليل الإحصائي المناسب وتقديرات عدم اليقين. تشمل خصائص الغشاء الشائعة التي يمكن حسابها من المحاكاة ، على سبيل المثال لا الحصر ، معلمات ترتيب الديوتيريوم ، وملامح كثافة الإلكترون ، ووظائف التوزيع الشعاعي ، وزوايا ميل ذيول الدهون أو مجموعات الرأس ، ومعامل الانضغاط ، وأوقات استرخاء دوران الدهون ، ومعامل الانحناء ، وملامح الضغط الجانبي ، وأنماط تجمع الدهون ، وديناميكيات الماء بالقرب من واجهة الغشاء35,70 ، 71 ؛ مراجعة من قبل Moradi et al. يصف بعض هذه بمزيد من التفصيل70. يمكن إجراء هذه التحليلات باستخدام أدوات تحليلية مدمجة من GROMACS و VMD ، أو باستخدام البرمجة النصية Python أو Bash أو TCL. هناك أيضا العديد من مكتبات Python مفتوحة المصدر مثل MDAnalysis 72,73 و MDTraj 74 و Pysimm 75 و Pyemma 76 و PyLipID 77 التي تسهل تحليل مسارات المحاكاة.

يركز هذا البروتوكول على نهج جميع الذرات ، وهو أمر يتطلب حسابيا إذا كان الهدف من الدراسة هو توصيف ديناميكيات البروتينات الكبيرة التي تتفاعل مع بقع غشائية كبيرة. ومع ذلك ، فإن الزيادة في القوة الحسابية واستخدام معالجات الوحدات الرسومية (GPUs) قد فضلت محاكاة الأنظمة الأكبر. تتطلب عمليات محاكاة MD أخذ عينات كافية من مطابقات النظام لحساب متوسطات الخصائص التي تعيد إنتاج القيم التجريبية بدقة. تهدف النمذجة الغشائية الواقعية إلى إعادة إنتاج بيئة ميكانيكية وهيكلية دقيقة لغشاء الخلية محل الاهتمام ، والتي تؤثر بشكل مباشر على تفاعل الجزيئات الحيوية الأخرى وتسهيل أخذ عينات من الأحداث النادرة78،79،80. عند تفسير البيانات ، يجب على المرء أن يكون حريصا على التحقق من صحة الملاحظات مع الاتجاهات التجريبية أو القيم الفعلية لأنظمة مماثلة للتحقق من أن أنظمة النموذج ليست مجرد قطعة أثرية للمحاكاة أو تشكل أحداثا غير فسيولوجية78. في الختام ، تعد محاكاة MD نموذجا قويا لفحص التفاعلات الجزيئية بناء على الديناميكا الحرارية الإحصائية. يمكن استخدام محاكاة MD لدراسة آثار تنوع الدهون على الخواص الهيكلية والميكانيكية للغشاء ، والتي بدورها تؤدي إلى تفاعلات مختلفة مع الجزيئات الحيوية أثناء العمليات الخلوية. يوفر البروتوكول نهجا صديقا للمبتدئين لتصميم وبناء وتشغيل وتحليل أنظمة الأغشية الدهنية المعقدة. تعمل هذه الخطوات على محاكاة الأنظمة الغشائية فقط وكذلك البروتين أو الجزيئات الصغيرة بالقرب من واجهة الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للكشف عنها.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جينهوي لي وريكاردو إكس راميريز على مسارات المحاكاة والمناقشات أثناء كتابة هذه المخطوطة. تم دعم O.C. من قبل زمالة الجامعة في بوفالو الرئاسية ومبادرة المعهد الوطني للصحة لتعظيم منحة التدريب على تطوير الطلاب 1T32GM144920-01 الممنوحة لمارغريتا إل دوبوكوفيتش (PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaconda3 Anaconda Inc (Python & related libraries) N/A
CHARMM-GUI.org Im lab, Lehigh University N/A
GROMACS GROMACS development team N/A
Linux HPC Cluster UB CCR N/A
MATLAB MathWorks N/A
VMD Theoretical and Computational Biophysics Group N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vanni, S., Riccardi, L., Palermo, G., De Vivo, M. Structure and Dynamics of the Acyl Chains in the Membrane Trafficking and Enzymatic Processing of Lipids. Accounts of Chemical Research. 52 (11), 3087-3096 (2019).
  2. Harayama, T., Riezman, H. Understanding the diversity of membrane lipid composition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 281-296 (2018).
  3. Tanaka, M. Comprehensive Biophysics. Edward, H. . E. gelman , Elsevier. 261-272 (2012).
  4. Bruce Alberts, A. J., Julian Lewis,, Martin Raff,, Keith Roberts,, Peter Walter, Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. (2002).
  5. Watson, H. Biological membranes. Essays in Biochemistry. 59, 43-69 (2015).
  6. Coskun, Ü, Simons, K. Cell Membranes: The Lipid Perspective. Structure. 19 (11), 1543-1548 (2011).
  7. Biobased Surfactants (Second Edition) eds. Douglas G, H. ayes, Daniel, K. Y., Solaiman,, Richard, D. , AOCS Press. 515-529 (2019).
  8. González-Rubio, P., Gautier, R., Etchebest, C., Fuchs, P. F. J. Amphipathic-Lipid-Packing-Sensor interactions with lipids assessed by atomistic molecular dynamics. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1808, 2119-2127 (2011).
  9. Halbleib, K., et al. Activation of the Unfolded Protein Response by Lipid Bilayer Stress. Molecular Cell. 67, 673-684 (2017).
  10. Andreasen, M., Lorenzen, N., Otzen, D. Interactions between misfolded protein oligomers and membranes: A central topic in neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (9), 1897-1907 (2015).
  11. Calianese, D. C., Birge, R. B. Biology of phosphatidylserine (PS): basic physiology and implications in immunology, infectious disease, and cancer. Cell Commununication and Signaling. 18 (1), 41 (2020).
  12. Nieto-Garai, J. A., Contreras, F. X., Arboleya, A., Lorizate, M. Role of Protein-Lipid Interactions in Viral Entry. Advanced Biology. 6, 2101264 (2022).
  13. Mazzon, M., Mercer, J. Lipid interactions during virus entry and infection. Cell Microbiology. 16, 1493-1502 (2014).
  14. Colombelli, C., Aoun, M., Tiranti, V. Defective lipid metabolism in neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA) syndromes: not only a matter of iron. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38 (1), 123-136 (2015).
  15. Saini-Chohan, H. K., Mitchell, R. W., Vaz, F. M., Zelinski, T., Hatch, G. M. Delineating the role of alterations in lipid metabolism to the pathogenesis of inherited skeletal and cardiac muscle disorders: Thematic Review Series: Genetics of Human Lipid Diseases. Journal of Lipid Research. 53 (1), 4-27 (2012).
  16. Martinotti, C., Ruiz-Perez, L., Deplazes, E., Mancera, R. L. Molecular Dynamics Simulation of Small Molecules Interacting with Biological Membranes. ChemPhysChem. 21 (14), 1486-1514 (2020).
  17. Li, J., Kalyanram, P., Rozati, S., Monje-Galvan, V., Gupta, A. Interaction of Cyanine-D112 with Binary Lipid Mixtures: Molecular Dynamics Simulation and Differential Scanning Calorimetry Study. ACS Omega. 7 (11), 9765-9774 (2022).
  18. Nagy, L., et al. Protein/Lipid Interaction in the Bacterial Photosynthetic Reaction Center: Phosphatidylcholine and Phosphatidylglycerol Modify the Free Energy Levels of the Quinones. Biochemistry. 43 (40), 12913-12923 (2004).
  19. Ramirez, R. X., Campbell, O., Pradhan, A. J., Atilla-Gokcumen, G. E., Monje-Galvan, V. Modeling the molecular fingerprint of protein-lipid interactions of MLKL on complex bilayers. Frontiers in Chemistry. 10, (2023).
  20. Dondelinger, Y., et al. MLKL Compromises Plasma Membrane Integrity by Binding to Phosphatidylinositol Phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  21. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  22. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5 (2011).
  23. Lee, H. R., Lee, G. Y., You, D. G., Kim, H. K., Young, D. Y. Hepatitis C virus p7 induces membrane permeabilization by interacting with phosphatidylserine. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 897 (2020).
  24. Casares, D., Escribá, P. V., Rosselló, C. A. Membrane Lipid Composition: Effect on Membrane and Organelle Structure, Function and Compartmentalization and Therapeutic Avenues. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2167 (2019).
  25. Marrink, S. J., et al. Computational Modeling of Realistic Cell Membranes. Chemical Reviews. 119 (9), 6184-6226 (2019).
  26. Janmey, P. A., Kinnunen, P. K. J. Biophysical properties of lipids and dynamic membranes. Trends in Cell Biology. 16 (10), 538-546 (2006).
  27. Brémaud, E., Favard, C., Muriaux, D. Deciphering the Assembly of Enveloped Viruses Using Model Lipid Membranes. Membranes. 12, 441 (2022).
  28. Campbell, O., Monje-Galvan, V. Protein-driven membrane remodeling: Molecular perspectives from Flaviviridae infections. Biophysical Journal. 122 (11), 1890-1899 (2022).
  29. Loschwitz, J., Olubiyi, O. O., Hub, J. S., Strodel, B., Poojari, C. S. Computer simulations of protein-membrane systems. Progress in molecular biology and translational science. 170, 273-403 (2020).
  30. Shell, M. S. Thermodynamics and Statistical Mechanics: An Integrated ApproachCambridge Series in Chemical Engineering. Scott Shell, M. , Cambridge University Press. 21-49 (2015).
  31. Yang, J., et al. Molecular Dynamic Simulation of Ni-Al Alloy-H2O Reactions Using the ReaxFF Reactive Force Field. ACS Omega. 8 (11), 9807-9814 (2023).
  32. Ingólfsson, H. I., Arnarez, C., Periole, X., Marrink, S. J. Computational 'microscopy' of cellular membranes. Journal of Cell Science. 129 (2), 257-268 (2016).
  33. Klauda, J. B. Perspective: Computational modeling of accurate cellular membranes with molecular resolution. The Journal of Chemical Physics. 149 (22), 220901 (2018).
  34. Chavent, M., Duncan, A. L., Sansom, M. S. P. Molecular dynamics simulations of membrane proteins and their interactions: from nanoscale to mesoscale. Current Opinion in Structural Biology. 40, 8-16 (2016).
  35. Khakbaz, P., Monje-Galvan, V., Zhuang, X., Klauda, J. B. Biogenesis of Fatty Acids, Lipids and Membranes. Otto Geiger, , Springer International Publishing. 1-19 (2017).
  36. Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
  37. Lemkul, J. A. From Proteins to Perturbed Hamiltonians: A Suite of Tutorials for the GROMACS-2018 Molecular Simulation Package. Living Journal of Computational Molecular Science. 1 (1), 5068 (2018).
  38. Phillips, J. C., et al. Scalable molecular dynamics on CPU and GPU architectures with NAMD. The Journal of Chemical Physics. 153 (4), 044130 (2020).
  39. Klauda, J. B., et al. Update of the CHARMM All-Atom Additive Force Field for Lipids: Validation on Six Lipid Types. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7830-7843 (2010).
  40. Wang, J., Wolf, R. M., Caldwell, J. W., Kollman, P. A., Case, D. A. Development and testing of a general amber force field. Journal of Computational Chemistry. 25 (9), 1157-1174 (2004).
  41. John Stone, A. A., et al. Using VMD. , http://csbmb.beckman.illinois.edu/BIOP586C/vmd-tutorial-2011.pdf (2011).
  42. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
  43. Hsin, J., Arkhipov, A., Yin, Y., Stone, J. E., Schulten, K. Using VMD: An Introductory Tutorial. Current Protocols in Bioinformatics. 24 (1), 5.7.1-5.7.48 (2008).
  44. Souza, P. C. T., et al. Martini 3: a general purpose force field for coarse-grained molecular dynamics. Nature Methods. 18 (4), 382-388 (2021).
  45. Jorgensen, W. L., Maxwell, D. S., Tirado-Rives, J. Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids. Journal of the American Chemical Society. 118 (45), 11225-11236 (1996).
  46. Machado, M. R., et al. The SIRAH 2.0 Force Field: Altius, Fortius, Citius. Journal of Chemical Theory and Computation. 15 (4), 2719-2733 (2019).
  47. Huang, J., et al. CHARMM36m: an improved force field for folded and intrinsically disordered proteins. Nature Methods. 14 (1), 71-73 (2017).
  48. Mu, J., Liu, H., Zhang, J., Luo, R., Chen, H. F. Recent Force Field Strategies for Intrinsically Disordered Proteins. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (3), 1037-1047 (2021).
  49. Inakollu, V. S. S., Geerke, D. P., Rowley, C. N., Yu, H. Polarisable force fields: what do they add in biomolecular simulations. Current Opinion in Structural Biology. 61, 182-190 (2020).
  50. Ohkubo, Y. Z., et al. Accelerating Membrane Insertion of Peripheral Proteins with a Novel Membrane Mimetic Model. Biophysical Journal. 102 (9), 2130-2139 (2012).
  51. Hopkins, C. W., Le Grand, S., Walker, R. C., Roitberg, A. E. Long-Time-Step Molecular Dynamics through Hydrogen Mass Repartitioning. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (4), 1864-1874 (2015).
  52. Park, S., Beaven, A. H., Klauda, J. B., Im, W. How Tolerant are Membrane Simulations with Mismatch in Area per Lipid between Leaflets. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (7), 3466-3477 (2015).
  53. Park, S., Im, W., Pastor, R. W. Developing initial conditions for simulations of asymmetric membranes: a practical recommendation. Biophysical Journal. 120 (22), 5041-5059 (2021).
  54. Wu, E. L., et al. CHARMM-GUI Membrane Builder toward realistic biological membrane simulations. Journal of Computational Chemistry. 35 (27), 1997-2004 (2014).
  55. Center for Computational Research, U.a.B.. CCR Facility Description. , https://ubir.buffalo.edu/xmlui/handle/10477/79221 (2019).
  56. Piggot, T. J., Allison, J. R., Sessions, R. B., Essex, J. W. On the Calculation of Acyl Chain Order Parameters from Lipid Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation. 13 (11), 5683-5696 (2017).
  57. Li, J., Monje-Galvan, V. Effect of Glycone Diversity on the Interaction of Triterpenoid Saponins and Lipid Bilayers. ACS Applied Bio Materials. , (2023).
  58. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  59. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  60. Martínez, L., Andrade, R., Birgin, E. G., Martínez, J. M. PACKMOL: A package for building initial configurations for molecular dynamics simulations. Journal of Computational Chemistry. 30 (13), 2157-2164 (2009).
  61. Jewett, A. I., et al. Moltemplate: A Tool for Coarse-Grained Modeling of Complex Biological Matter and Soft Condensed Matter Physics. Journal of Molecular Biology. 433 (11), 166841 (2021).
  62. Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., Im, W. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. Journal of Computational Chemistry. 29 (11), 1859-1865 (2008).
  63. Polêto, M. D., Lemkul, J. A. Integration of experimental data and use of automated fitting methods in developing protein force fields. Communications Chemistry. 5 (1), 38 (2022).
  64. Hynninen, A. P., Crowley, M. F. New faster CHARMM molecular dynamics engine. Journal of Computational Chemistry. 35 (5), 406-413 (2014).
  65. Kim, S. Issues on the Choice of a Proper Time Step in Molecular Dynamics. Physics Procedia. 53, 60-62 (2014).
  66. Grubmüller, H., Heller, H., Windemuth, A., Schulten, K. Generalized Verlet Algorithm for Efficient Molecular Dynamics Simulations with Long-range Interactions. Molecular Simulation. 6 (1-3), 121-142 (1991).
  67. Darden, T., York, D., Pedersen, L. Particle mesh Ewald: An N·log(N) method for Ewald sums in large systems. Journal of Chemical Physics. 98 (12), 10089-10092 (1993).
  68. Hepatitis C. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c (2021).
  69. Braun, E., et al. Best Practices for Foundations in Molecular Simulations [Article v1.0]. Living Journal of Computational Molecular Science. 1 (1), 5957 (2018).
  70. Moradi, S., Nowroozi, A., Shahlaei, M. Shedding light on the structural properties of lipid bilayers using molecular dynamics simulation: a review study. RSC Advances. 9 (8), 4644-4658 (2019).
  71. Monje-Galvan, V., Klauda, J. B. Modeling Yeast Organelle Membranes and How Lipid Diversity Influences Bilayer Properties. Biochemistry. 54 (45), 6852-6861 (2015).
  72. Michaud-Agrawal, N., Denning, E. J., Woolf, T. B., Beckstein, O. MDAnalysis: A toolkit for the analysis of molecular dynamics simulations. Journal of Computational Chemistry. 32 (10), 2319-2327 (2011).
  73. Gowers, R., et al. MDAnalysis: A Python Package for the Rapid Analysis of Molecular Dynamics Simulations. SciPy. , (2016).
  74. McGibbon, R. obert T., et al. MDTraj: A Modern Open Library for the Analysis of Molecular Dynamics Trajectories. Biophysical Journal. 109 (8), 1528-1532 (2015).
  75. Fortunato, M. E., Colina, C. M. pysimm: A python package for simulation of molecular systems. SoftwareX. 6, 7-12 (2017).
  76. Scherer, M. K., et al. PyEMMA 2: A Software Package for Estimation, Validation, and Analysis of Markov Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (11), 5525-5542 (2015).
  77. Song, W., et al. PyLipID: A Python Package for Analysis of Protein-Lipid Interactions from Molecular Dynamics Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation. 18 (2), 1188-1201 (2022).
  78. Monje-Galvan, V., Klauda, J. B. Peripheral membrane proteins: Tying the knot between experiment and computation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (7, Part B), 1584-1593 (2016).
  79. Monje-Galvan, V., Voth, G. A. Binding mechanism of the matrix domain of HIV-1 gag on lipid membranes. eLife. 9, e58621 (2020).
  80. Wang, B., Guo, C. Concentration-Dependent Effects of Cholesterol on the Dimerization of Amyloid-β Peptides in Lipid Bilayers. ACS Chemical Neuroscience. 13 (18), 2709-2718 (2022).

Tags

نمذجة الأغشية الواقعية ، مخاليط الدهون المعقدة ، دراسات المحاكاة ، أغشية الخلايا ، أنواع الدهون ، الخواص الميكانيكية ، الخواص الهيكلية ، تكوين الغشاء ، عمليات إشارات الخلية ، النهج الحسابية ، التفاعلات الجزيئية الحيوية ، الديناميات الجزيئية ، محاكاة MD ، طبقات الدهون الثنائية ، البرامج الصديقة للمبتدئين ، البيئة الكارهة للماء ، البيئة الميكانيكية ، خصائص الغشاء ، تفاعلات الجزيئات الحيوية
نمذجة الغشاء الواقعية باستخدام مخاليط الدهون المعقدة في دراسات المحاكاة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, O., Le, V., Aguirre, A.,… More

Campbell, O., Le, V., Aguirre, A., Monje-Galvan, V. Realistic Membrane Modeling Using Complex Lipid Mixtures in Simulation Studies. J. Vis. Exp. (199), e65712, doi:10.3791/65712 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter