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Biology

シミュレーションスタディにおける複雑な脂質混合物を用いた現実的な膜モデリング

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

Summary

膜脂質の構造と組成の多様性は、細胞プロセスに大きく寄与し、疾患のマーカーとなる可能性があります。分子動力学シミュレーションにより、膜と生体分子との相互作用を原子分解能で研究することができます。ここでは、複雑な膜システムを構築、実行、分析するためのプロトコルを提供します。

Abstract

脂質は細胞膜の構造的構成要素です。脂質種は細胞小器官や生物によって異なります。この多様性により、膜の機械的および構造的特性が異なり、この界面で発生する分子やプロセスに直接影響します。脂質組成は動的であり、細胞シグナル伝達プロセスを調節する役割を果たします。計算アプローチは、生体分子間の相互作用を予測し、実験観測物に分子的洞察を提供するためにますます使用されています。分子動力学(MD)は、統計力学に基づく手法であり、原子に作用する力に基づいて原子の動きを予測します。MDシミュレーションは、生体分子の相互作用を特徴付けるために使用できます。ここでは、この手法を簡単に紹介し、脂質二重層のシミュレーションに関心のある初心者向けの実践的な手順を概説し、初心者向けのソフトウェアでプロトコルを実証し、プロセスの代替案、課題、および重要な考慮事項について説明します。特に、複雑な脂質混合物を使用して目的の細胞膜をモデル化し、シミュレーションで適切な疎水性および機械的環境を捉えることの関連性を強調しています。また、膜の組成と特性が二重膜と他の生体分子との相互作用を調節するいくつかの例についても説明します。

Introduction

脂質は膜の主要成分であり、細胞の境界を提供し、細胞内の区画化を可能にします1,2,3。脂質は両親媒性で、極性頭部群と2つの疎水性脂肪酸尾部があります。これらは自己組織化して二重層になり、疎水性鎖と水との接触が最小限に抑えられます3,4。親水性の頭部基と疎水性の尾部のさまざまな組み合わせにより、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロールなど、生体膜にさまざまなクラスの脂質が生じます(図1)1,5,6。グリセロリン脂質は、グリセロリン酸、長鎖脂肪酸、および低分子量の頭部基で構成される真核細胞膜の主要な構成要素です7。脂質の命名法は、ヘッドグループの違いに基づいています。例としては、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルイノシトール(PI)、または非修飾ホスファチジン酸(PA)などがあります5,6。疎水性の尾部に関しては、背骨構造とともに、飽和の長さと程度が異なります。可能な組み合わせは多数あり、その結果、哺乳類細胞には数千の脂質種が生じます6。膜脂質組成の変化は、内在性膜タンパク質と末梢タンパク質の両方の活性に影響を与える異なる機械的および構造的膜特性につながります2,6。

Figure 1
図 1.代表的な脂質構造。 脂肪酸のテールは青色のボックスで、一般的な脂質ヘッドグループはオレンジ色で、サンプルの骨格は紫色で示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

脂質は、細胞プロセス、シグナル伝達カスケードにおけるタンパク質の活性化、および健康な細胞の恒常性における積極的なプレーヤーです8,9。脂質動態の変化は、感染の結果であるか、疾患の病因のマーカーである可能性があります10,11,12,13,14,15。細胞のバリアとして、膜脂質と低分子の浸透におけるそれらの役割の研究は、薬物送達システムと膜破壊メカニズムに関連しています16,17。細胞小器官、組織、生物における化学的多様性と脂質種の比率の違いは、複雑な膜ダイナミクスを引き起こします2。したがって、脂質二重層のモデリング研究において、特に研究の目的が他の生体分子と膜との相互作用を調べることである場合、これらの特性を保持することが重要です。モデルで考慮する脂質種は、対象となる生物と細胞区画によって異なります。例えば、PG脂質は光合成バテリアの電子移動に重要であり18、リン酸化イノシトール脂質(PIP)は哺乳類細胞の原形質膜(PM)の動態とシグナル伝達カスケードの主要な役割を担っている19,20。細胞内では、PM、小胞体(ER)、ゴルジ体、およびミトコンドリア膜には、その機能に影響を与える固有の脂質量が含まれています。例えば、小胞体は脂質の生合成のハブであり、コレステロールをPMとゴルジ体に輸送します。脂質の多様性が高く、PCとPEが豊富に含まれていますが、ステロール含有量は低く、膜の流動性を促進します21,22,23,24。対照的に、PMは、生物25に応じて数百、さらには数千の脂質種を組み込んでおり、高レベルのスフィンゴ脂質およびコレステロールを含み、細胞内の他の膜と比較して特徴的な剛性を与える24。スフィンゴミエリン、PC、コレステロールが豊富な外側のリーフレットと、シグナル伝達カスケードに重要なPE、PI、およびPSが豊富な内側リーフレットを持つPMのような膜では、リーフレットの非対称性を考慮する必要があります24。最後に、脂質の多様性は、脂質ラフトとして知られる、パッキングと内部秩序が異なるミクロドメインの形成も促します24,26。これらは横方向の非対称性を示し、細胞シグナル伝達に重要な役割を果たすと仮定されており26、その一過性の性質のために研究が困難である。

蛍光透視法、分光法、巨大単層小胞(GUV)などのモデル膜系などの実験技術を使用して、生体分子と膜の相互作用が研究されてきました。しかし、関与する成分の複雑で動的な性質は、実験的手法だけでは捉えることが困難です。例えば、タンパク質の膜貫通ドメインのイメージング、そのような研究で使用される膜の複雑さ、および関心のあるプロセス中の中間状態または過渡状態の同定には制限があります27,28,29。1980年代に脂質単層および二重膜の分子シミュレーションが登場して以来29、脂質-タンパク質系とその相互作用を分子レベルで定量化できるようになりました。分子動力学(MD)シミュレーションは、分子間力に基づいて粒子の動きを予測する一般的な計算手法です。相加的相互作用ポテンシャルは、系30の粒子間の結合および非結合の相互作用を記述する。これらの相互作用をモデル化するために使用される一連のパラメータは、シミュレーション力場(FF)と呼ばれます。これらのパラメータは、第一原理計算、半経験的計算、量子力学的計算から得られ、X線および電子回折実験、NMR、赤外線、ラマンおよび中性子分光法などの方法から再現されたデータに最適化されています31。

MDシミュレーションは、さまざまなレベルの分解能32、33、34でシステムを研究するために使用できます。特定の生体分子相互作用、水素結合、その他の高分解能の詳細を特徴付けることを目的としたシステムは、全原子(AA)シミュレーションで研究されています。対照的に、粗視化(CG)シミュレーションは、計算コストを削減し、より大きなスケールのダイナミクスを調べるために、原子をより大きな官能基にまとめる33。これら2つの間に位置するのは、水素原子がそれぞれの重原子と組み合わされて計算を高速化する結合原子(UA)シミュレーションです33,35。MDシミュレーションは、脂質膜のダイナミクスと他の分子との相互作用を探索するための強力なツールであり、膜界面で関心のあるプロセスに分子レベルのメカニズムを提供するのに役立ちます。さらに、MDシミュレーションは、実験ターゲットを絞り込み、微視的相互作用に基づいて特定のシステムの高分子特性を予測するのに役立ちます。

簡単に言うと、初期座標、速度、温度や圧力などの条件が一定であれば、相互作用ポテンシャルとニュートンの運動の法則を数値積分して、各粒子の位置と速度が計算されます。これを反復的に繰り返すことで、シミュレーション軌跡30を生成する。これらの計算は MD エンジンで実行されます。いくつかのオープンソースパッケージの中で、GROMACS36は最も一般的に使用されているエンジンの1つであり、ここで説明するエンジンです。また、シミュレーションするシステムの初期座標を解析および構築するためのツールも含まれています37。他のMDエンジンにはNAMD38が含まれます。CHARMM39、およびAMBER40は、ユーザが所与のシステムの計算性能に基づいて自身の裁量で選択することができる。シミュレーション中の軌跡を視覚化し、結果を解析および解釈することが重要です。さまざまなツールが利用可能です。ここでは、拡張的な描画法や色付け法による3次元(3D)可視化、体積データの可視化、MDシミュレーションシステムの構築・準備・解析、メモリに余裕があればシステムサイズに制限のない軌道動画作成など、幅広い機能を提供するVisual Molecular Dynamics(VMD)について述べる41,42,43。

システムコンポーネント間の予測ダイナミクスの精度は、軌跡の伝搬に選択されたフリップフロップに直接影響されます。経験的なFFパラメータ化の取り組みは、少数の研究グループによって追求されています。MDの最も確立され、一般的なFFには、CHARMM39、AMBER 40、Martini44、OPLS 45、およびSIRAH 46が含まれます。全原子添加CHARMM36(C36)力場47は、実験構造データを正確に再現するため、膜系のAA MDに広く用いられている。もともとはCHARMMコミュニティによって開発されたもので、GROMACSやNAMDなどの複数のMDエンジンと互換性があります。一般的なFF全体の改善にもかかわらず、特定の研究システムへの関心に駆り立てられて、実験観測結果を厳密に再現する予測を可能にするためにパラメータセットを改善するための継続的な努力があります48,49。

脂質膜をシミュレーションする際の課題は、シミュレーションの軌跡の長さを決定することです。これは、分析する指標と特徴付けるプロセスに大きく依存します。通常、複雑な脂質混合物は、より多くの分子種が膜面上で拡散し、安定した側方組織に到達するのに十分な時間を必要とするため、平衡に達するまでに長い時間を必要とします。シミュレーションは、対象のプロパティがプラトーに達し、一定の値を中心に変動する場合に平衡状態にあると言われます。少なくとも100〜200 nsの平衡軌道を取得して、関心のある特性と相互作用に関する適切な統計分析を実行するのが一般的です。200〜500 nsの間でメンブレンのみのシミュレーションを実行するのが一般的ですが、脂質混合物の複雑さと研究課題によって異なります。タンパク質と脂質の相互作用は、通常、500〜2000nsの長いシミュレーション時間を必要とします。メンブレンシステムによるサンプリングと観察可能なダイナミクスを加速するためのいくつかのアプローチは、(i)膜内の脂質の末端炭素を有機溶媒に置き換えてサンプリングを加速する高移動性膜模倣(HMMM)モデルです50;(ii)水素質量再分配(HMR)は、システム内の重原子の質量の一部を水素原子の質量と組み合わせて、より大きなシミュレーションタイムステップ51の使用を可能にする。

以下のプロトコルでは、AA MD を使用して現実的な膜モデルを構築、実行、および解析するための初心者向けのアプローチについて説明します。MDシミュレーションの性質上、再現性と結果の適切な統計解析を考慮するために、複数の軌跡を実行する必要があります。現在のところ、対象のシステムごとに少なくとも 3 つのレプリカを実行するのが一般的です。目的の生物種とプロセスに脂質種を選択したら、膜のみのシステムのシミュレーション軌跡を構築、実行、および分析するための基本的な手順を概説し、 図 2 にまとめます。

Figure 2
図 2.MDシミュレーションを実行するための回路図。 オレンジ色のボックスは、プロトコルに記載されている 3 つの主要なステップに対応しています。その下には、シミュレーションプロセスのワークフローがあります。システムのセットアップ中に、溶媒和膜システムの初期座標を含むシステムが、CHARMM-GUI Membrane Builderなどのシステム入力ジェネレータを使用して構築されます。入力ファイルをハイパフォーマンスコンピューティングクラスタに転送した後、GROMACSなどのMDエンジンを使用してシミュレーションの軌跡を伝搬します。軌道解析は、コンピュータクラスタまたはローカルワークステーション上で、視覚化とともに行うことができます。その後、GROMACSやVMDなどの解析コードが組み込まれたパッケージ、またはBashスクリプトや各種Pythonライブラリを使用して解析を行います。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Protocol

1. システム座標の構築

  1. Web ブラウザーを使用して CHARMM-GUI.org (C-GUI) に移動します。トップメニューで[ Input Generator]に移動し、画面左側の垂直オプションから [Membrane Builder ]を選択します。
  2. バイレイヤーを構築するには、[ バイレイヤー ビルダー]を選択します。
    注:初めてのユーザーは、最初の座標セットを作成する前に、無料アカウントをアクティブ化する必要があります。
  3. [メンブレンのみのシステム]を選択します。生成されたジョブ ID を保存してシステムを取得し、必要に応じてプロセス中に中断したところから続行します。
    1. 構築プロセスの各ステップでシステムを視覚化するには、ページ上部のボックスで [構造の表示 ] をクリックするか、結果の PDB ファイルをダウンロードします。成分の欠落、選択したインプット脂質種またはパッチサイズの誤りに注意してください。
  4. システムのコンポーネントを選択します。
    1. [ Heterogeneous Lipid ]オプションを選択すると、単一成分の二重層を構築する場合でも、次のようになります。をクリックしてから、「 矩形ボックス 」タイプを選択します。
    2. 水和オプションには、脂質あたり45個の水分子を選択します。これは、完全に水和された二重層を確保するのに十分です。
    3. 脂質成分の数に基づいてXYの長さを設定します。 次に、モデルに先立って決定された脂質種ごとに含める脂質の数を選択します。次項で説明するケーススタディでは、600種類の脂質が2枚のリーフレットに対称的に分布した膜モデルを構築しました。真核細胞の小胞体をモデル化するために、336 DOPC、132 DPPE、60 CHOL、72 POPI脂質の混合物をPIモデルに使用しました。PI-PS モデルでは、330 DOPC、126 DPPE、54 CHOL、66 POPI、および 24 DOPS の脂質があります。
      注:C-GUIには、選択可能な脂質構造のライブラリが用意されています。化学構造の種名の横にある画像をクリックします。
    4. 上段と下段のリーフレットの脂質名の横にある2つのボックスに、希望の分子数を入力します。ケーススタディでは、対称的な膜組成が望まれます - 上部リーフレットと下部リーフレットの脂質の数が一致しないというエラーがないことを確認してください。非対称性が必要な場合は、各リーフレットの脂質の総数が正しいことを確認してください。非対称二重層の構築の詳細については、Park et al.52,53 の研究を参照してください。
    5. 脂質種リストの一番上に移動し、[ システム情報を表示]ボタンをクリックします。コンポーネントを組み立てて、システムを完成させます。
    6. より高速な収束のために距離ベースのアルゴリズムを用いてイオンを中和するオプションを選択する54。
    7. KCl のデフォルトの溶液濃度は 0.15 mM のままにします。これは、膜二重膜のシミュレーションボックスを中性にするための典型的な塩濃度です。
      注:異なる濃度を使用する場合は、編集後に必ず[ 溶媒組成の計算 ]ボタンをクリックしてください。
  5. シミュレーションの条件と設定を選択します。
    1. FFオプションとして CHARMM36m を選択します。これは脂質およびタンパク質のシミュレーションに一般的に使用されますが、ユーザーはイントロダクションで説明した他のオプションを選択することもできます。
    2. MDエンジンとして GROMACS を選択し、対応するフォーマットのサンプル入力ファイルを取得します。
      注: GROMACS には、サポート用のオンラインリソース、チュートリアル、フォーラムが複数あるため、新規ユーザーにお勧めします。ユーザーは、複数のMDエンジンから選択して、シミュレーションのパフォーマンスとコード構文の観点からオプションを調べることができます。
    3. Constant Particle-Pressure-Temperature(NPT)アンサンブルは、脂質二重層のシミュレーションで最もよく使用される動的アンサンブルです。
    4. ケルビン単位の温度と圧力を、バー単位をそれぞれ 303 K と 1 bar に設定します。生物学的プロセスの研究のために温度を298 Kから310 Kの間で設定し、液体の無秩序状態の二重層を確保するのが一般的です。
      注:温度は、シミュレートするプロセスの条件によって異なり、必要に応じて変更できます。モデル内の脂質種に応じて、シミュレーションを実行する前に、純粋な脂質成分の転移温度よりも高い温度を設定します。
  6. 結果のファイルをダウンロードし、コンピューター クラスターに転送します。
    1. VMD や PyMol などの任意のソフトウェアで最終的なシステムを視覚化し、適切なセットアップを検査します。
      注:例えば、シミュレーション中に脂質が画像原子と相互作用しないように膜の周囲に十分な水があること、およびリーフレットが適切にセットアップされていること(間にスペースや水がない二重層)を確認することをお勧めします。

2. MDシミュレーションの実行

  1. コンピューティングクラスタのC-GUIからファイルをアップロードして解凍します。 Gromacs ディレクトリに移動します。リラクゼーション送信スクリプトを作成します。
  2. 送信スクリプトの形式については、クラスターのガイドラインに従ってください。
    1. README ファイルの # Production コメントのすぐ上までリストされているコマンドを送信スクリプトにコピーします。
      メモ : C-GUI のこのデフォルトは、システムの 6 段階の緩和を実行するループです。別の確立されたプロトコルが必要な場合は、C-GUIから作成してダウンロードした座標を読み取るように編集します。
  3. 緩和スクリプトを送信し、運用実行に移行する前に、すべてのステップですべての出力ファイルがダウンロードされていることを確認します。完了したら、6ステップの実行中に生成されたGROMACSからの次の出力ファイルを確認します:*.log、*.tpr、*.gro、*.edr、*.trr / *.xtc
  4. 運用実行スクリプトを作成します。
    1. 緩和ステップのいずれかのサンプル gmx grompp コマンドと gmx mdrun コマンドの 1 つをテンプレートとして使用します。
    2. スクリプトを使用する前に、提供されている step7_production.mdp ファイルと同様のシミュレーション オプションを含む *.mdp ファイルを作成してください。
      注: 提供されている既定のオプションは、膜シミュレーションの標準です。ディタンスはnmでリストされ、時間はピコ秒またはステップ数(ピコ秒/積分時間ステップ)で与えられます。nsteps を更新して目的のシミュレーション長 (dt * nsteps に等しい) まで実行し、nst[x,v,f]out を更新して積分ステップ数でデータ保存頻度を更新します。ケーススタディでは、シミュレーション長が500nsの場合(シミュレーション時間/積分ステップ=500,000ps/0.002ps)でnstepsを250,000,000に設定し、nst[x,v,f]outを50,000に設定して100psごとにデータを保存します
  5. 実際のシミュレーションを実行する前に、ベンチマーク スタディを実行して、リソースの最適な使用方法を決定します。
    1. 異なる数のコンピューティングノードを使用して、システムを1〜2ns実行します。
      注: ER のケース スタディは、UB Center for Computational Research (CCR) のハイパフォーマンス コンピューティング クラスター55 で 2 ns で提出され、1 から 10 ノードでパフォーマンスがテストされました。
    2. 各設定のパフォーマンス (ns/日) を比較して、実行に最適なリソースを決定します。一般的な方法は、最大パフォーマンスの 75% から 80% になるノードの数を選択することです。
  6. 生産実行を実行します。
    1. 各システムを 3 回に分けて実行し、再現性を確保し、データの統計分析を行います。
    2. ベンチマークに基づいて、コンピューティング クラスターでの送信の許容キュー時間が経過した場合に、軌道を延長します。gmx convert-tpr コマンドを使用し、次に gmx mdrun コマンドを使用して、軌跡収集を続行します。
      注: オプションについては、オンラインの GROMACS ドキュメント (https://manual.gromacs.org/) で説明されています。
    3. メンブレンのみのシステムの場合、時間の経過とともに脂質あたりの面積を計算して、システムが平衡に達しているかどうかを調べます。そうでない場合は、シミュレーションの軌跡を延長します。

3. 軌跡の解析

  1. 分析を実行する前にシステムを可視化して、目的の分子と特性評価を目的とした軌跡の部分を決定します。
  2. ファイル形式を *.xtc に変更したり、フレームをスキップしたりして、未加工の軌跡ファイル(*.trr)を圧縮し、ファイルサイズを縮小し、視覚化と分析のためにローカルステーションへのより効率的な転送を容易にします。
    注:大型メンブレンシステムの場合、弾道から水を取り除くことで、ファイルサイズをさらに小さくすることができます。これは、GROMACSのインデックスファイル、VMDのTCLスクリプト、またはMDAnalysisやMDTrajなどのPythonライブラリを使用して実行できます。
  3. 脂質あたりの面積の時系列から決定された軌跡の平衡化部分で、選択した分析を実行します。
    注:一般的な膜分析とその実行方法の詳細については、ディスカッションを参照してください。

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Representative Results

プロトコルの使用と得られる結果を説明するために、小胞体(ER)の膜モデルの比較研究について説明します。この研究の2つのモデルは、(i)ERで見つかった上位4つの脂質種を含むPIモデルと、(ii)アニオン性ホスファチジルセリン(PS)脂質種を追加したPI-PSモデルでした。これらのモデルは、後にウイルスタンパク質の研究に使用され、それが膜とどのように相互作用するか、PSへの関心は、ウイルスタンパク質の透過活性にとって重要であると指摘されている23。脂質テール構造に多様性を取り込むために、膜組成をDOPC:DPPE:CHOL:POPI(56:22:10:12 mol%)およびDOPC:DPPE:CHOL:POPI:DOPS(55:21:11:9:4 mol%)に設定しました。

メンブレンは、CHARMM-GUI Membrane Builderで生成しました。4つの異なる脂質種と後にタンパク質に対応するために、対称膜は600の脂質/リーフレットを含むように設定されました。プロトコルで推奨されている設定を使用し、温度は 303 K でした。独立したレプリカを確保するために、各膜モデルに対して構築プロセスを3回繰り返し、毎回異なるランダムな脂質混合物が得られました。システム構築後、入力ファイルをUB Center for Computational Research(CCR)のハイパフォーマンスコンピューティングクラスタ55 に移動させ、GROMACSバージョン2020.5を用いてMDシミュレーションを実行しました。6段階の緩和プロトコルが完了した後、原子の数はすべてのレプリカで類似しているため、ベンチマークはモデルごとに1つのシステムでのみ実行されました(図3)。最大パフォーマンスの 75% は ~78 ns/日であったため、本番環境での実行には、クラスター上で最大 6 つのノードが要求されました。*.mdp ファイルで nstep = 25 x 107 を設定し、ベンチマークに基づいて必要に応じてクラスターに拡張機能を送信することで、各レプリカを最大 500 ns 実行しました。

Figure 3
図 3.サンプルのベンチマーク実行。PIモデル(315,000原子)の性能を決定するために使用されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

各レプリカの脂質あたりの面積(APL)を 図 4 に示します。これは、energy組み込みプログラムを使用して、GROMACSの*edrシミュレーション出力ファイルに格納されているシミュレーションボックスのXY寸法から計算されました。次に、総表面積をリーフレットあたりの総脂質数で割って、各モデルのAPLの推定値を提供しました。すべてのシステムについて、平衡化は、APLがプラトーに達し、一定の値を中心に変動するポイントとして決定されました。これらすべてのシステムにおいて、軌道の最初の100 ns以内に平衡に達します( 図4を参照)。この指標に基づいて、これらのシステムには500nsの軌跡で十分であると見なされました。これらの二重層に関する他のすべての分析は、平衡化または生産段階として知られる最後の400 nsの軌跡にわたって実施されました。各計算値の不確実性を判断するには、10〜20nsごとにブロック平均化することをお勧めします。APL解析から、PI-PS膜モデルはPIモデルよりも平均で0.7 Å2 大きな表面積を持っています。

Figure 4
図4.脂質あたりの面積の例。 (A)PIモデルと(B)PI-PSモデル。各モデルの反復 1、反復 2、および反復 3 は、赤、青、緑で示されます。すべてのシステムの平衡化は、最初の 100 ns 以内に行われます。不確かさは、平均の標準誤差(SEM)として報告されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

さらに、膜構造に関する2つの簡単な解析が提示されます。 図5 は、上部と下部のリーフレット中のリン脂質のリン酸原子の重心(COM)間の距離によって推定された膜厚を示しています。これは、GROMACSの距離プログラムを使用して計算されましたが、このプログラムには、2つの原子グループ(1つは上部リーフレットのリン酸基、もう1つは下部リーフレットのリン酸基)をリストするインデックスファイルが必要です。この結果は、2つの膜モデルの膜厚の間に統計的な差があることを示しており、APLと膜厚の間に逆相関があることを示しています。最後に、 図6 は、各脂質種の重水素順序パラメータ、二層疎水性コア56内の脂質テールの順序を定量化する尺度を示す。脂肪酸の尾部は、グリセロール骨格の末端酸素に結合するsn1と、グリセロール基の中心酸素に結合するsn2に分類されます。結果は、PIモデルでsn1テールの順序がわずかに増加しているDPPEを除いて、モデル間の脂質テールの順序にほとんど差がないことを示しています。

Figure 5
図5.膜厚の例。 (A)PIモデルと(B)PI-PSモデル。各モデルの反復 1、反復 2、および反復 3 は、赤、青、緑で示されます。不確かさは、平均の標準誤差(SEM)として報告されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6.重水素次数パラメータの例。 (A)DOPC、(B)DPPE、(C)POPI、および(D)DOPS脂質種。sn1 は実線、sn2 は破線、赤は PI モデル、青は PI-PS モデル。不確かさは、平均の標準誤差(SEM)として報告されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

複雑な膜モデルを使用して、特定の脂質種の関連性と、これらが生体分子と膜との相互作用をどのように調節するかを研究することができます。研究室のサンプル研究は、(1)膜組成がタンパク質の相互作用を調節する19、および(2)脂質テール飽和度と膜表面電荷が低分子の透過と横方向の組織化に影響を与えることを示している17,57。上記のプロトコルおよび前の段落で提示されたものと同様の分析を使用して、Liらによる研究は、潜在的な光線力学療法剤であるD112と異なる脂質混合物との間の相互作用に関する実験およびシミュレーションからの洞察を提供する17。PC脂質とPS脂質を含む二重層を実験で調べ、二重層におけるD112分配を特徴付けました。我々は、D112と膜の相互作用に対する表面電荷と疎水性環境の影響を決定するために、さまざまな脂肪酸テール長と飽和度(二重結合の数)で、PC脂質とPS脂質のさまざまな比率のシミュレーションを実施しました。静電相互作用はD112の陰イオン性PS脂質への初期結合を促進しますが、疎水性相互作用は2つの可能なメカニズムを介して分子を膜コアに引き込みます(図7A-Bを参照)。膜内では、D112はモノマーまたは二量体としてPCリッチドメインに優先的に局在します。

Figure 7
図7.提示されたプロトコルに従った追加のサンプルシステム。 2つの挿入メカニズム(A)銛と(B)フリップを識別するモデル膜を使用したD112のシミュレーション。(c)D112二量体の配向、(D)荷電脂質(オレンジ色のクラスター)に対する膜モデル上のD112分子の横方向分布(青色の等高線マップ)。完全な調査は 17で見つけることができる。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Discussion

実験技術では、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)58、蛍光技術、原子間力顕微鏡(AFM)59を用いて、生体分子を高分解能で可視化することができます。しかし、生物学的経路、疾患の病因、治療送達の根底にある分子相互作用の相互作用とダイナミクスを原子レベルまたはアミノ酸レベルで捉えることは困難です。ここでは、脂質膜を研究するためのMDシミュレーションの機能と、これらのシステムを設計、構築、実行、および分析するための主なステップについて説明しました。この計算方法の利点は、膜界面での分子メカニズムを提案および特徴付けるために分子間相互作用をモデル化する原子論的詳細と基礎となる方程式です。

細胞膜をシミュレートする際の重要なステップは、研究対象の生物学的システムをしっかりと理解することです。含める脂質種は、生物、細胞区画、そして最も重要なこととして、研究するプロセスによって異なります。対称膜を用いたシミュレーションは、MDの初心者ユーザーにとって良い出発点となります。非対称性は、PMなどのメンブレンの既知の特徴ですが、リーフレット間のステロールの横方向の拡散と交換を適切にサンプリングするには、より長いシミュレーション時間を必要とするため、潜在的な困難が加わります。非対称性はまた、各リーフレットのAPLにミスマッチをもたらし、シミュレーション52,53において慎重に扱わなければならない。もう1つの重要なステップは、脂質混合物の複雑さと利用可能な計算リソースに依存する、シミュレートするメンブレンパッチのサイズを決定することです。メンブレンパッチが大きいほど計算時間が長くなり、常に実現できるとは限りません。均質系またはバイナリー系には少なくとも150脂質/リーフレットのサイズ、より複雑な組成には最大600脂質/リーフレットのサイズが推奨されます。膜モデルをタンパク質-膜研究に使用する場合、経験則として、タンパク質の最長寸法の2〜3倍に対応できる膜パッチを作成することをお勧めします。低分子を調べる場合、有限サイズの影響を避けるために、パッチサイズのカバレッジは30%〜40%未満に維持する必要があります。平衡状態を判断する指標によっては、複雑な脂質混合物は、純粋な脂質混合物やバイナリー混合物と比較して、少なくとも3倍のシミュレーション時間を必要とする場合があります。

生体分子シミュレーションの初期座標を設定するには、複数のオプションがあります。一般的なソフトウェアパッケージには、GROMACS36、VMD42、PACKMOL 60、Moltemplate 61、CHARMM-GUI 62 などがあります。C-GUIは、脂質ライブラリーに多種多様な分子を含む、これらのシステムの構築を容易にするために設計されたウェブベースのプラットフォームです。さまざまなMDエンジンと力場パラメータの入力ファイルを提供し、初心者にとって素晴らしい出発点となっています。構築ステップでは、C-GUIは個々の脂質種の脂質あたりの面積の推定値を提供します。複雑な脂質混合物(5+種)を構築する場合、特にモデルでステロールを使用する場合、この推定値を10%〜15%増やすと便利です。目的の脂質がC-GUIライブラリに見つからない場合は、近い脂質構造をプレースホルダーとして使用し、システムの構築と初期緩和後にVMDまたはPythonスクリプトを使用して構造を変更できます。C36mは加法的な力場63であるので、新しい分子中のすべての原子型が力場中に存在する限り、通常、更新された脂質構造のために必要な再パラメータ化はない。C-GUIで利用可能なすべてのオプションがこのプロトコルでカバーされているわけではありませんが、初心者に関連するオプションや、この分野での一般的な慣行に沿ったオプションが示されていることに注意してください。高度なオプションは、開発者54,62,64によって対処され、公開されています。

熱力学的アンサンブル、温度、圧力などのシミュレーション条件は、研究の性質によって異なります。このプロトコルでは、流体相での膜シミュレーションに典型的な条件をC-GUIのデフォルトとして維持しました。ゲル相は生体膜のモデル化には望ましくなく、脂質の転移温度以下で発生し、脂質尾部が斜めに平行に並ぶことで容易に認識できます。これは、研究の目的によって、または共同研究者の実験(ある場合)によって変更される可能性があります。MD実行中、膜二重膜の典型的な設定には、(1)水素-酸素結合の最速の振動運動を捕捉するためのAA MDの1〜4fsタイムステップが含まれます65;通常、生産には 2 つの FS が使用されますが、緩和および最小化のステップでは 1 つの FS が使用され、HMR51 が採用されている場合は 4 つの FS を使用できます。(2)0.05〜0.2nsのデータ保存頻度が一般的な方法です。(3)ベルレカットオフスキーム66、ファンデルワール相互作用のソフトカットオフとハードカットオフは1.0 nmと1.2 nm。カットオフ半径を大きく設定すると、原子ペア間の相互作用が多くなるため、シミュレーションのパフォーマンスが低下します。ただし、横方向の圧力プロファイルを計算するには、より大きなカットオフが必要であり、通常は2.0〜2.4 nmのカットオフが必要です。(4)カットオフが1.2 nmの粒子メッシュエドワード(PME)スキーム67 は、長距離静電相互作用に使用されます。(5)LINCSアルゴリズム68 は、水素結合を拘束するためにGROMACSにおいて用いられる。(6)一般的な圧力コントローラーは、二層に半等方的に適用されるParrinello-Rahmanバロスタットです。(7)一般的な温度コントローラーはノーズフーバーサーモスタットです。シミュレーションで使用できる気圧とサーモスタットには複数のタイプがあり、研究の性質に依存することに注意してください69。

APL、膜厚、ステロールフリップフロップは、システムが熱平衡に達しているかどうかを判断するための一般的な指標であり、選択した指標に応じて、純粋な二重層の50 nsから複雑な不斉混合物の4000 nsまでの範囲です。二重層の機械的、構造的、および動的特性の解析は、平衡に達した後、つまり、目的の特性がプラトーに達し、平均値に対して変動した後に計算する必要があります。軌道の平衡部分は生産段階とも呼ばれ、適切な統計分析と不確実性の推定のために少なくとも100nsの長さにする必要があります。シミュレーションから計算することができる一般的な膜特性には、重水素次数パラメータ、電子密度プロファイル、半径方向分布関数、脂質尾部または頭群の傾斜角、圧縮率、脂質回転の緩和時間、曲げ弾性率、横方向圧力プロファイル、脂質クラスタリングパターン、および膜界面近傍の水力学が含まれるが、これらに限定されない35,70、71歳。Moradiらによるレビューでは、これらのいくつかをより詳細に説明しています70。これらの分析は、GROMACSやVMDの組み込み分析ツール、またはPython、Bash、またはTCLスクリプトを使用して実行できます。また、MDAnalysis 72,73、MDTraj 74、Pysimm 75、Pyemma 76、PyLipID 77など、シミュレーション軌跡の解析を容易にするオープンソースのPythonライブラリも多数あります。

このプロトコルは調査の目的が大きい膜パッチと相互作用する大きい蛋白質の原動力を特徴付けることなら計算上要求が高い全原子アプローチに焦点を合わせる。それにもかかわらず、計算能力の向上とグラフィックユニットプロセッサ(GPU)の使用により、大規模なシステムのシミュレーションが好まれています。MDシミュレーションでは、実験値を正確に再現する特性平均を計算するために、システムのコンフォメーションを十分にサンプリングする必要があります。リアリスティックメンブレンモデリングは、他の生体分子の相互作用に直接影響を与え、まれなイベントのサンプリングを容易にする、関心のある細胞膜の正確な機械的および構造的環境を再現することを目的としています78,79,80。データを解釈する際には、モデルシステムがシミュレーションのアーティファクトや非生理学的事象を構成していないことを確認するために、実験的傾向または類似システムの実際の値で観察値を検証するように注意する必要があります78。結論として、MDシミュレーションは、統計熱力学に基づいて分子間相互作用を調べるための強力なモデルです。MDシミュレーションは、脂質の多様性が膜の構造的および機械的特性に及ぼす影響を調べるために使用でき、その結果、細胞プロセス中に生体分子とのさまざまな相互作用が生じます。このプロトコルは、複雑な脂質膜システムの設計、構築、実行、分析に初心者に優しいアプローチを提供します。これらのステップは、膜のみのシステムだけでなく、膜界面付近のタンパク質や低分子のシミュレーションにも役立ちます。

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Disclosures

著者は、開示すべき競合する利害関係を有していません。

Acknowledgments

著者らは、この原稿の執筆中にシミュレーションの軌跡と議論をしてくれたJinhui Li氏とRicardo X. Ramirez氏に感謝します。O.C.は、バッファロー大学プレジデンシャルフェローシップと国立衛生研究所のイニシアチブの学生開発トレーニング助成金1T32GM144920-01によって支援され、マルガリータL.デュボコビッチ(PI)に授与されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaconda3 Anaconda Inc (Python & related libraries) N/A
CHARMM-GUI.org Im lab, Lehigh University N/A
GROMACS GROMACS development team N/A
Linux HPC Cluster UB CCR N/A
MATLAB MathWorks N/A
VMD Theoretical and Computational Biophysics Group N/A

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シミュレーションスタディにおける複雑な脂質混合物を用いた現実的な膜モデリング
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