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Biology

सिमुलेशन अध्ययन में जटिल लिपिड मिश्रण का उपयोग करते हुए यथार्थवादी झिल्ली मॉडलिंग

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

Summary

संरचना और संरचना में झिल्ली लिपिड विविधता सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है और बीमारी का एक मार्कर हो सकता है। आणविक गतिशीलता सिमुलेशन हमें परमाणु संकल्प पर बायोमोलेक्यूल्स के साथ झिल्ली और उनकी बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यहां, हम जटिल झिल्ली प्रणालियों के निर्माण, चलाने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

लिपिड कोशिका झिल्ली के संरचनात्मक निर्माण खंड हैं; लिपिड प्रजातियां सेल ऑर्गेनेल और जीवों में भिन्न होती हैं। इस किस्म के परिणामस्वरूप झिल्ली में विभिन्न यांत्रिक और संरचनात्मक गुण होते हैं जो सीधे इस इंटरफ़ेस पर होने वाले अणुओं और प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। लिपिड संरचना गतिशील है और सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को संशोधित करने के लिए काम कर सकती है। बायोमोलेक्यूल्स के बीच बातचीत की भविष्यवाणी करने और प्रयोगात्मक अवलोकनों को आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण का तेजी से उपयोग किया जाता है। आणविक गतिशीलता (एमडी) सांख्यिकीय यांत्रिकी पर आधारित एक तकनीक है जो उन पर कार्य करने वाले बलों के आधार पर परमाणुओं के आंदोलन की भविष्यवाणी करती है। एमडी सिमुलेशन का उपयोग बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम संक्षेप में तकनीक का परिचय देते हैं, शुरुआती लोगों के लिए व्यावहारिक कदमों की रूपरेखा तैयार करते हैं जो लिपिड बाइलेयर का अनुकरण करने में रुचि रखते हैं, शुरुआती अनुकूल सॉफ्टवेयर के साथ प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, और विकल्पों, चुनौतियों और प्रक्रिया के महत्वपूर्ण विचारों पर चर्चा करते हैं। विशेष रूप से, हम सिमुलेशन में उपयुक्त हाइड्रोफोबिक और यांत्रिक वातावरण को पकड़ने के लिए रुचि के सेल झिल्ली को मॉडल करने के लिए जटिल लिपिड मिश्रण का उपयोग करने की प्रासंगिकता पर जोर देते हैं। हम कुछ उदाहरणों पर भी चर्चा करते हैं जहां झिल्ली संरचना और गुण अन्य बायोमोलेक्यूल्स के साथ बाइलेयर की बातचीत को संशोधित करते हैं।

Introduction

लिपिड झिल्ली के प्रमुख घटक हैं, जो कोशिकाओं के लिए सीमाएं प्रदान करते हैं और इंट्रासेल्युलर कंपार्टमेंटलाइजेशन 1,2,3 को सक्षम करते हैं। लिपिड एम्फीफिलिक होते हैं, जिसमें एक ध्रुवीय सिर समूह और दो हाइड्रोफोबिक फैटी एसिड पूंछ होते हैं; ये पानी के साथ हाइड्रोफोबिक श्रृंखलाओं के संपर्क को कम करने के लिए एक बाईलेयर में स्वयं इकट्ठा होते हैं 3,4. हाइड्रोफिलिक हेड ग्रुप और हाइड्रोफोबिक पूंछ के विभिन्न संयोजनों के परिणामस्वरूप जैविक झिल्ली में लिपिड के विभिन्न वर्ग होते हैं, जैसे ग्लिसरोफॉस्फोलिपिड्स, स्फिंगोलिपिड्स और स्टेरोल्स (चित्रा 1)1,5,6। ग्लिसरोफॉस्फोलिपिड्स यूकेरियोटिक कोशिका झिल्ली के प्राथमिक निर्माण खंड हैं जो ग्लिसरोफॉस्फेट, लंबी श्रृंखला फैटी एसिड और कम आणविक भारके सिर समूहों से बने होते हैं। लिपिड नामकरण सिर समूहों में अंतर पर आधारित है; उदाहरणों में फॉस्फेटिडिल-कोलीन (पीसी), फॉस्फेटिडिल-इथेनॉलमाइन (पीई), फॉस्फेटिडिल-सेरीन (पीएस), फॉस्फेटिडिल-ग्लिसरॉल (पीजी), फॉस्फेटिडिल-इनोसिटोल (पीआई), या असंशोधित फॉस्फेटिडिक एसिड (पीए) 5,6 शामिल हैं। हाइड्रोफोबिक पूंछ के लिए, रीढ़ की संरचना के साथ संतृप्ति की लंबाई और डिग्री भिन्न होती है। संभावित संयोजन कई हैं, जिसके परिणामस्वरूप स्तनधारी कोशिकाओं में हजारों लिपिड प्रजातियांहैं। झिल्ली लिपिड संरचना में परिवर्तन विभिन्न यांत्रिक और संरचनात्मक झिल्ली गुणों को जन्म देता है जो अभिन्न झिल्ली प्रोटीन और परिधीय प्रोटीन 2,6 दोनों की गतिविधि को प्रभावित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1. प्रतिनिधि लिपिड संरचनाएं। फैटी एसिड पूंछ नीले बक्से में दिखाए जाते हैं, नारंगी में सामान्य लिपिड हेड समूह, और बैंगनी में नमूना बैकबोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लिपिड सेलुलर प्रक्रियाओं में सक्रिय खिलाड़ी हैं, सिग्नलिंग कैस्केड में प्रोटीन सक्रियण, और स्वस्थ सेल होमियोस्टैसिस 8,9। परिवर्तित लिपिड गतिशीलता संक्रमण का परिणाम है या रोग10,11,12,13,14,15 के रोगजनन के मार्कर हो सकते हैं। कोशिका के लिए बाधाओं के रूप में, झिल्ली लिपिड का अध्ययन और छोटे अणुओं के पारगम्यता में उनकी भूमिका दवा वितरण प्रणाली और झिल्ली विघटन तंत्र16,17 के लिए प्रासंगिक है। रासायनिक विविधता और ऑर्गेनेल, ऊतकों और जीवों में लिपिड प्रजातियों के विभिन्न अनुपात जटिलझिल्ली गतिशीलता को जन्म देते हैं। इसलिए लिपिड बाइलेयर के मॉडलिंग अध्ययन में इन विशेषताओं को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, खासकर जब एक अध्ययन का लक्ष्य झिल्ली के साथ अन्य बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत की जांच करना है। एक मॉडल में विचार करने के लिए लिपिड प्रजातियां जीव और रुचि के सेलुलर डिब्बे पर निर्भर करती हैं। उदाहरण के लिए, पीजी लिपिड प्रकाश संश्लेषक बटेरिया18 में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि फॉस्फोराइलेटेड इनोसिटोल लिपिड (पीआईपी) प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) गतिशीलता और स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नलिंग कैस्केड 19,20 में प्रमुख खिलाड़ी हैं। कोशिका के अंदर, पीएम, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), गोल्गी और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में अद्वितीय लिपिड बहुतायत होते हैं जो उनके कार्य को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, ईआर लिपिड बायोजेनेसिस के लिए केंद्र है और कोलेस्ट्रॉल को पीएम और गोल्गी तक पहुंचाता है; इसमें पीसी और पीई की प्रचुरता के साथ एक उच्च लिपिड विविधता होती है, लेकिन कम स्टेरोल सामग्री, जो झिल्ली तरलता21,22,23,24 को बढ़ावा देती है। इसके विपरीत, पीएम जीव25 के आधार पर सैकड़ों और यहां तक कि हजारों लिपिड प्रजातियों को शामिल करता है, इसमें स्फिंगोलिपिड्स और कोलेस्ट्रॉल के उच्च स्तर होते हैं जो इसे सेल24 में अन्य झिल्ली की तुलना में एक विशिष्ट कठोरता देते हैं। पत्रक विषमता को पीएम जैसी झिल्लियों के लिए माना जाना चाहिए, जिसमें स्फिंगोमाइलिन, पीसी और कोलेस्ट्रॉल से भरपूर एक बाहरी पत्रक होता है, और पीई, पीआई और पीएस में समृद्ध एक आंतरिक पत्रक होता है जो सिग्नलिंग कैस्केड24 के लिए महत्वपूर्ण होता है। अंत में, लिपिड विविधता भी माइक्रो-डोमेन के गठन को प्रेरित करती है जो पैकिंग और आंतरिक क्रम में भिन्न होती है, जिसे लिपिड राफ्ट24,26 के रूप में जाना जाता है; ये पार्श्व विषमता प्रदर्शित करते हैं, सेलुलर सिग्नलिंग26 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए परिकल्पित हैं, और उनकी क्षणिक प्रकृति के कारण अध्ययन करना कठिन है।

फ्लोरोस्कोपी, स्पेक्ट्रोस्कोपी, और मॉडल झिल्ली प्रणालियों जैसे विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) जैसी प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग झिल्ली के साथ बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत की जांच करने के लिए किया गया है। हालांकि, इसमें शामिल घटकों की जटिल और गतिशील प्रकृति को अकेले प्रयोगात्मक तरीकों से पकड़ना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन की इमेजिंग, ऐसे अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली झिल्ली की जटिलता और ब्याज की प्रक्रिया के दौरान मध्यवर्ती या क्षणिक अवस्थाओं की पहचान27,28,29 पर सीमाएं हैं। 1980 के दशक में लिपिड मोनोलेयर औरबाइलेयर के आणविक सिमुलेशन के आगमन के बाद से, लिपिड-प्रोटीन सिस्टम और उनकी बातचीत को अब आणविक स्तर पर निर्धारित किया जा सकता है। आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन एक सामान्य कम्प्यूटेशनल तकनीक है जो कणों के आंदोलन की भविष्यवाणी उनके इंटरमॉलिक्युलर बलों के आधार पर करती है। एक योजक इंटरैक्शन क्षमता सिस्टम30 के कणों के बीच बंधुआ और गैर-बंधुआ बातचीत का वर्णन करती है। इन इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों के सेट को सिमुलेशन फोर्सफील्ड (एफएफ) कहा जाता है। इन मापदंडों को प्रारंभिक गणनाओं, अर्ध-अनुभवजन्य और क्वांटम यांत्रिक गणनाओं से प्राप्त किया जाता है, और एक्स-रे और इलेक्ट्रॉन विवर्तन प्रयोगों, एनएमआर, इन्फ्रारेड, रमन और न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी से डेटा को पुन: पेश करने के लिए अनुकूलित किया जाताहै।

एमडी सिमुलेशन का उपयोग संकल्प32,33,34 के विभिन्न स्तरों पर सिस्टम का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सिस्टम जो विशिष्ट बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन, हाइड्रोजन बॉन्ड और अन्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवरणों को चिह्नित करने का लक्ष्य रखते हैं, उनका अध्ययन ऑल-एटम (एए) सिमुलेशन के साथ किया जाता है। इसके विपरीत, मोटे-दाने वाले (सीजी) सिमुलेशन कम्प्यूटेशनल लागत को कम करने और बड़े पैमाने पर गतिशीलता33 की जांच करने के लिए बड़े कार्यात्मक समूहों में गांठ परमाणुओं को जोड़ते हैं। इन दोनों के बीच में स्थित हैं संयुक्त-परमाणु (यूए) सिमुलेशन, जहां हाइड्रोजन परमाणुओं को उनके संबंधित भारी परमाणुओं के साथ जोड़ा जाता है ताकि गणना33,35 में तेजी लाई जा सके। एमडी सिमुलेशन लिपिड झिल्ली की गतिशीलता और अन्य अणुओं के साथ उनकी बातचीत की खोज के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं और झिल्ली इंटरफ़ेस पर रुचि की प्रक्रियाओं के लिए आणविक स्तर के तंत्र प्रदान करने के लिए काम कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एमडी सिमुलेशन प्रयोगात्मक लक्ष्यों को कम करने और सूक्ष्म इंटरैक्शन के आधार पर किसी दिए गए सिस्टम के मैक्रोमोलेक्यूलर गुणों की भविष्यवाणी करने के लिए काम कर सकते हैं।

संक्षेप में, प्रारंभिक निर्देशांक, वेग और निरंतर तापमान और दबाव जैसी स्थितियों के एक सेट को देखते हुए, प्रत्येक कण की स्थिति और वेग की गणना इंटरैक्शन पोटेंशियल और न्यूटन के गति के नियम के संख्यात्मक एकीकरण के माध्यम से की जाती है। यह पुनरावृत्ति रूप से दोहराया जाता है, जिससे सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र30 उत्पन्न होता है। ये गणना एमडी इंजन के साथ की जाती है; कई ओपन-सोर्स पैकेजों के बीच, GROMACS36 सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले इंजनों में से एक है और जिसे हम यहां वर्णित करते हैं। इसमें विश्लेषण और सिस्टम के प्रारंभिक निर्देशांक के निर्माण के लिए उपकरण भी शामिल हैं जिन्हें सिम्युलेटेडकिया जा सकता है। अन्य एमडी इंजनों में एनएएमडी38 शामिल हैं; चार्मम39, और एम्बर40, जिसे उपयोगकर्ता किसी दिए गए सिस्टम के कम्प्यूटेशनल प्रदर्शन के आधार पर अपने विवेक पर चुन सकता है। सिमुलेशन के दौरान प्रक्षेपपथ की कल्पना करना और साथ ही परिणामों के विश्लेषण और व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रकार के उपकरण उपलब्ध हैं; यहां हम दृश्य आणविक गतिशीलता (वीएमडी) पर चर्चा करते हैं जो सुविधाओं की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है, जिसमें विस्तृत ड्राइंग और रंग विधियों के साथ तीन आयामी (3-डी) विज़ुअलाइज़ेशन, वॉल्यूमेट्रिक डेटा विज़ुअलाइज़ेशन, एमडी सिमुलेशन सिस्टम के निर्माण, तैयारी और विश्लेषण और सिस्टम आकार पर कोई सीमा नहीं होने के साथ प्रक्षेपवक्र-फिल्म बनाना शामिल है, अगर मेमोरी41,42,43 उपलब्ध है।

सिस्टम घटकों के बीच अनुमानित गतिशीलता की सटीकता सीधे प्रक्षेपवक्र के प्रसार के लिए चुने गए एफएफ से प्रभावित होती है। अनुभवजन्य एफएफ परमेट्राइजेशन प्रयासों को कुछ शोध समूहों द्वारा आगे बढ़ाया जाता है। एमडी के लिए सबसे स्थापित और आम एफएफ में चार्मम39, एम्बर 40, मार्टिनी 44, ओपीएलएस45 और एसआईआरएएच 46 शामिल हैं। ऑल-एटम एडिटिव CHARMM36 (सी 36) बल क्षेत्र47 का व्यापक रूप से झिल्ली प्रणालियों के एए एमडी के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि यह प्रयोगात्मक संरचनात्मक डेटा को सटीक रूप से पुन: पेश करता है। यह मूल रूप से चार्मम समुदाय द्वारा विकसित किया गया था, और यह ग्रोमाक्स और एनएएमडी जैसे कई एमडी इंजनों के साथ संगत है। सामान्य एफएफ में सुधार के बावजूद, पैरामीटर सेटों में सुधार करने के लिए निरंतर प्रयास किया जाता है ताकि उन भविष्यवाणियों की अनुमति मिल सके जो प्रयोगात्मक अवलोकनों को बारीकी से पुन: पेश करते हैं, जो अध्ययनकी विशेष प्रणालियों में रुचियों से प्रेरित हैं।

लिपिड झिल्ली का अनुकरण करते समय एक चुनौती सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र की लंबाई निर्धारित कर रही है। यह काफी हद तक विश्लेषण किए जाने वाले मैट्रिक्स और उस प्रक्रिया पर निर्भर करता है जिसे कोई चिह्नित करना चाहता है। आमतौर पर, जटिल लिपिड मिश्रण को संतुलन तक पहुंचने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, क्योंकि अधिक प्रजातियों को झिल्ली तल पर फैलने और एक स्थिर पार्श्व संगठन तक पहुंचने के लिए पर्याप्त समय होना चाहिए। एक सिमुलेशन को संतुलन में कहा जाता है जब ब्याज की संपत्ति एक पठार पर पहुंच जाती है और एक स्थिर मूल्य के बारे में उतार-चढ़ाव करती है। रुचि के गुणों और अंतःक्रियाओं पर उचित सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए कम से कम 100-200 एनएस समतुल्य प्रक्षेपवक्र प्राप्त करना आम बात है। लिपिड मिश्रण और शोध प्रश्न की जटिलता के आधार पर 200-500 एनएस के बीच झिल्ली-केवल सिमुलेशन चलाना आम है। प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को आमतौर पर 500-2000 एनएस के बीच लंबे सिमुलेशन समय की आवश्यकता होती है। झिल्ली प्रणालियों के साथ नमूनाकरण और अवलोकन योग्य गतिशीलता में तेजी लाने के लिए कुछ दृष्टिकोण हैं: (i) अत्यधिक मोबाइल झिल्ली मिमेटिक (एचएमएमएम) मॉडल, जो नमूना करण में तेजी लाने के लिए कार्बनिक विलायक के साथ झिल्लीमें लिपिड के अंत कार्बन को प्रतिस्थापित करता है; और (ii) हाइड्रोजन द्रव्यमान पुनर्विभाजन (एचएमआर), जो हाइड्रोजन परमाणुओं के साथ एक प्रणाली के भीतर भारी परमाणुओं के द्रव्यमान के एक अंश को जोड़ता है ताकि एक बड़े सिमुलेशन टाइमस्टेप51 के उपयोग की अनुमति मिल सके।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एए एमडी का उपयोग करके यथार्थवादी झिल्ली मॉडल बनाने, चलाने और विश्लेषण करने के लिए एक शुरुआती-अनुकूल दृष्टिकोण पर चर्चा करता है। एमडी सिमुलेशन की प्रकृति को देखते हुए, परिणामों की प्रजनन क्षमता और उचित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कई प्रक्षेपपथ चलाए जाने चाहिए। यह वर्तमान प्रथा है कि रुचि की प्रति प्रणाली में कम से कम तीन प्रतिकृतियां चलाई जाती हैं। एक बार जब जीव और रुचि की प्रक्रिया के लिए लिपिड प्रजातियों का चयन किया जाता है, तो झिल्ली-केवल प्रणाली के सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र के निर्माण, चलाने और विश्लेषण करने के लिए बुनियादी चरणों को चित्र 2 में रेखांकित और सारांशित किया जाता है।

Figure 2
चित्र 2. एमडी सिमुलेशन चलाने के लिए योजनाबद्ध। नारंगी बक्से प्रोटोकॉल में वर्णित तीन मुख्य चरणों के अनुरूप हैं। नीचे सिमुलेशन प्रक्रिया का वर्कफ़्लो है। सिस्टम सेटअप के दौरान, सॉल्वेटेड मेम्ब्रेन सिस्टम के प्रारंभिक निर्देशांक वाले सिस्टम को चार्म-जीयूआई मेम्ब्रेन बिल्डर जैसे सिस्टम इनपुट जनरेटर के साथ बनाया जाता है। इनपुट फ़ाइलों को उच्च-प्रदर्शन कंप्यूटिंग क्लस्टर में स्थानांतरित करने के बाद, सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र को एमडी इंजन का उपयोग करके प्रचारित किया जाता है, जैसे कि GROMACS। प्रक्षेपवक्र विश्लेषण कंप्यूटर क्लस्टर या विज़ुअलाइज़ेशन के साथ एक स्थानीय कार्य स्टेशन पर किया जा सकता है। विश्लेषण तब किया जाता है, या तो अंतर्निहित विश्लेषण कोड जैसे GROMACS और VMD के साथ पैकेज का उपयोग करके, या बैश स्क्रिप्ट या विभिन्न पायथन पुस्तकालयों का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. सिस्टम निर्देशांक का निर्माण

  1. वेब ब्राउज़र का उपयोग करके CHARMM-GUI.org (C-GUI) पर नेविगेट करें। शीर्ष मेनू पर, इनपुट जनरेटर पर नेविगेट करें, फिर स्क्रीन के बाईं ओर ऊर्ध्वाधर विकल्पों से मेम्ब्रेन बिल्डर का चयन करें।
  2. बाइलेयर बनाने के लिए, बाइलेयर बिल्डर का चयन करें।
    नोट: पहली बार उपयोगकर्ताओं को निर्देशांक का अपना पहला सेट बनाने से पहले अपने मुफ्त खाते को सक्रिय करना होगा।
  3. केवल मेम्ब्रेन सिस्टम का चयन करें। सिस्टम को पुनर्प्राप्त करने के लिए जेनरेट की गई JOB ID सहेजें और यदि आवश्यक हो तो प्रक्रिया के दौरान जहां से आपने छोड़ा था, वहां से जारी रखें।
    1. पृष्ठ के शीर्ष पर स्थित बॉक्स में संरचना देखें क्लिक करके, या परिणामी पीडीबी फ़ाइल डाउनलोड करके बिल्डिंग प्रक्रिया के हर चरण के दौरान सिस्टम को विज़ुअलाइज़ करें। लापता घटकों, चयनित इनपुट लिपिड प्रजातियों या पैच आकार में गलतियों की तलाश करें।
  4. सिस्टम के घटकों का चयन करें।
    1. विषम लिपिड विकल्प चुनें, भले ही एकल-घटक बाईलेयर का निर्माण हो; फिर एक आयताकार बॉक्स प्रकार का चयन करें।
    2. हाइड्रेशन विकल्प के लिए प्रति लिपिड 45 पानी के अणुओं का चयन करें; यह पूरी तरह से हाइड्रेटेड बाइलेयर सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है।
    3. लिपिड घटकों की संख्या के आधार पर एक्सवाई की लंबाई सेट करें। फिर, मॉडल के आगे निर्धारित प्रत्येक लिपिड प्रजातियों के लिए शामिल किए जाने वाले लिपिड की संख्या का चयन करें। अगले खंड में चर्चा की गई केस स्टडी के लिए, दो पत्रकों में सममित रूप से वितरित 600 लिपिड के साथ एक झिल्ली मॉडल बनाया गया था। यूकेरियोटिक कोशिकाओं के ईआर को मॉडल करने के लिए पीआई मॉडल के लिए 336 डीओपीसी, 132 डीपीपीई, 60 चोल, 72 पीओपीआई लिपिड के मिश्रण का उपयोग किया गया था; और पीआई-पीएस मॉडल के लिए 330 डीओपीसी, 126 डीपीपीई, 54 चोल, 66 पीओपीआई और 24 डीओपीएस लिपिड।
      नोट: सी-जीयूआई चुनने के लिए लिपिड संरचनाओं की एक लाइब्रेरी प्रदान करता है; इसकी रासायनिक संरचना के लिए प्रजातियों के नाम के बगल में छवियों पर क्लिक करें।
    4. लिपिड नाम के बगल में दो बक्से में ऊपरी और निचले पत्रक में अणुओं की वांछित संख्या टाइप करें। मामले के अध्ययन के लिए, एक सममित झिल्ली संरचना वांछित है - सुनिश्चित करें कि ऊपरी पत्रक और निचले पत्रक में लिपिड की बेजोड़ संख्या के बारे में कोई त्रुटि नहीं है। यदि विषमता वांछित है, तो सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पत्रक में लिपिड की कुल संख्या सही है। असममित बाइलेयर के निर्माण के बारे में विवरण के लिए, पार्क एट अल .52,53 द्वारा किए गए काम को देखें।
    5. लिपिड प्रजातियों की सूची के शीर्ष पर जाएं और सिस्टम जानकारी दिखाएं बटन पर क्लिक करें। घटकों को इकट्ठा करें और सिस्टम को पूरा करें।
    6. तेजी से अभिसरण54 के लिए दूरी-आधारित एल्गोरिथ्म का उपयोग करके आयनों को निष्क्रिय करने के विकल्प का चयन करें।
    7. KCl की डिफ़ॉल्ट समाधान एकाग्रता को 0.15 mM पर छोड़ दें। यह झिल्ली बाइलेयर के लिए सिमुलेशन बॉक्स को तटस्थ करने के लिए एक विशिष्ट नमक एकाग्रता है।
      नोट: यदि किसी भिन्न एकाग्रता का उपयोग किया जाना है, तो इसे संपादित करने के बाद विलायक संरचना की गणना करें बटन पर क्लिक करना सुनिश्चित करें।
  5. सिमुलेशन स्थितियों और सेटिंग्स का चयन करें।
    1. एफएफ विकल्प के रूप में चार्मएम 36 एम का चयन करें; यह आमतौर पर लिपिड और प्रोटीन सिमुलेशन के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन उपयोगकर्ता परिचय में चर्चा किए गए अन्य विकल्पों का चयन कर सकता है।
    2. संबंधित स्वरूप में नमूना इनपुट फ़ाइलों को प्राप्त करने के लिए एमडी इंजन के रूप में GROMACS का चयन करें।
      नोट: GROMACS नए उपयोगकर्ताओं के लिए अनुशंसित है क्योंकि इसमें समर्थन के लिए कई ऑनलाइन संसाधन, ट्यूटोरियल और फ़ोरम हैं। उपयोगकर्ता सिमुलेशन प्रदर्शन और कोड सिंटैक्स के संदर्भ में विकल्पों का पता लगाने के लिए कई एमडी इंजनों में से चयन कर सकता है।
    3. निरंतर कण-दबाव-तापमान (एनपीटी) पहनावा का चयन करें, जो लिपिड बाइलेयर के सिमुलेशन में अब तक का सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला गतिशील पहनावा है।
    4. केल्विन और सलाखों में तापमान और दबाव क्रमशः 303 K और 1 बार के रूप में सेट करें। तरल विकार की स्थिति में बाईलेयर सुनिश्चित करने के लिए जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए तापमान 298 K और 310 K के बीच निर्धारित करना विशिष्ट है।
      नोट: तापमान अनुकरण की जाने वाली प्रक्रिया की स्थितियों पर निर्भर करता है और आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है। मॉडल में लिपिड प्रजातियों के आधार पर, सिमुलेशन चलाने से पहले तापमान को शुद्ध लिपिड घटकों के संक्रमण तापमान से ऊपर सेट करें।
  6. परिणामी फ़ाइलें डाउनलोड करें और कंप्यूटर क्लस्टर में स्थानांतरित करें।
    1. VMD या PyMol जैसे पसंद के सॉफ़्टवेयर पर अंतिम सिस्टम की कल्पना करें, और उचित सेटअप के लिए निरीक्षण करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, यह जांचना अच्छा है कि झिल्ली के चारों ओर पर्याप्त पानी है जैसे कि लिपिड सिमुलेशन के दौरान छवि परमाणुओं के साथ बातचीत नहीं करते हैं, और उचित पत्रक सेटअप (बीच में कोई जगह या पानी नहीं होने वाला एक बाइलेयर)।

2. एमडी सिमुलेशन चलाना

  1. अपने कंप्यूटिंग क्लस्टर पर C-GUI से फ़ाइलों को अपलोड और अनज़िप करें। Gromacs निर्देशिका पर नेविगेट करें। एक विश्राम सबमिशन स्क्रिप्ट बनाएँ।
  2. सबमिशन स्क्रिप्ट के स्वरूप के लिए क्लस्टर के दिशानिर्देशों का पालन करें।
    1. रीडमी फ़ाइल में # उत्पादन टिप्पणी के ठीक ऊपर तक सूचीबद्ध आदेशों को सबमिशन स्क्रिप्ट में कॉपी करें।
      नोट: C-GUI से यह डिफ़ॉल्ट एक लूप है जो सिस्टम की 6-चरणछूट चलाता है। यदि एक अलग और अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल वांछित है, तो सी-जीयूआई से निर्मित और डाउनलोड किए गए निर्देशांक को पढ़ने के लिए इसे संपादित करें।
  3. विश्राम स्क्रिप्ट सबमिट करें और पुष्टि करें कि उत्पादन रन पर जाने से पहले सभी आउटपुट फ़ाइलों को सभी चरणों के लिए डाउनलोड किया गया है। पूरा होने पर, 6 चरण ों के दौरान उत्पन्न GROMACS से निम्न आउटपुट फ़ाइलों की जाँच करें: *.log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc
  4. एक उत्पादन चलाने की स्क्रिप्ट बनाएँ।
    1. टेम्पलेट के रूप में किसी भी छूट चरण से नमूने GMX grompp और gmx mdrun आदेशों में से एक का उपयोग करें।
    2. स्क्रिप्ट का उपयोग करने से पहले, एक *.mdp फ़ाइल बनाना सुनिश्चित करें जिसमें प्रदान की गई step7_production.mdp फ़ाइल के समान सिमुलेशन विकल्प हों.
      नोट: प्रदान किए गए डिफ़ॉल्ट विकल्प झिल्ली सिमुलेशन के लिए मानक हैं; डिटेंस को एनएम में सूचीबद्ध किया गया है और समय पिकोसेकंड या चरणों की संख्या (पिकोसेकंड / एकीकरण समय चरण) में दिया गया है। एकीकरण चरणों की संख्या में डेटा बचत आवृत्ति को अपडेट करने के लिए वांछित सिमुलेशन लंबाई (यह dt * nsteps के बराबर है) और nst[x,v,f] तक चलाने के लिए nsteps को अपडेट करें। केस स्टडी के लिए, 500 ns (सिमुलेशन समय / एकीकरण चरण = 500,000 ps / 0.002ps) की सिमुलेशन लंबाई के लिए nsteps को 250,000,000 पर सेट करें, और nst [x, v, f] को हर 100 ps डेटा बचाने के लिए 50,000 तक सेट करें।
  5. वास्तविक सिमुलेशन चलाने से पहले, संसाधनों का सबसे अच्छा उपयोग निर्धारित करने के लिए बेंचमार्क अध्ययन चलाएं।
    1. विभिन्न कंप्यूटिंग नोड्स का उपयोग करके 1-2 एनएस के लिए सिस्टम चलाएं।
      नोट: ईआर केस स्टडी को 2 एनएस के लिए यूबी सेंटर फॉर कम्प्यूटेशनल रिसर्च (सीसीआर) उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग क्लस्टर55 पर प्रस्तुत किया गया था, जहां प्रदर्शन का परीक्षण 1-10 नोड्स के लिए किया गया था।
    2. रन के लिए इष्टतम संसाधन निर्धारित करने के लिए प्रत्येक सेटिंग के लिए एनएस / दिन में प्रदर्शन की तुलना करें। नोड्स की संख्या का चयन करना आम बात है जिसके परिणामस्वरूप अधिकतम प्रदर्शन का 75% -80% होता है।
  6. उत्पादन चलाएँ।
    1. पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने और डेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक प्रणाली को तीन प्रतियों में चलाएं।
    2. यदि कंप्यूटिंग क्लस्टर पर सबमिशन के लिए अनुमत कतार समय समाप्त हो जाता है तो बेंचमार्क के आधार पर प्रक्षेपवक्र का विस्तार करें। प्रक्षेपवक्र संग्रह जारी रखने के लिए gmx convert-tpr, फिर gmx mdrun आदेशों का उपयोग करें।
      नोट: विकल्प GROMACS दस्तावेज़ऑनलाइन (https://manual.gromacs.org/) में वर्णित हैं।
    3. एक झिल्ली-केवल प्रणाली के लिए, जांचें कि क्या सिस्टम समय के साथ क्षेत्र-प्रति-लिपिड की गणना करके संतुलन तक पहुंच गया है। यदि ऐसा नहीं है, तो सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र का विस्तार करें।

3. प्रक्षेपवक्र का विश्लेषण

  1. रुचि के अणुओं और प्रक्षेपवक्र के हिस्से को निर्धारित करने के लिए विश्लेषण चलाने से पहले सिस्टम की कल्पना करें जो लक्षण वर्णन के लिए अभिप्रेत है।
  2. फ़ाइल आकार को कम करने और विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के लिए स्थानीय स्टेशन पर अधिक कुशल स्थानांतरण की सुविधा के लिए फ़ाइल स्वरूप को *.xtc और/या स्किपिंग फ़्रेम में बदलकर कच्ची प्रक्षेपवक्र फ़ाइलों (*.trr) को संपीड़ित करें।
    नोट: बड़ी झिल्ली प्रणालियों के लिए, कोई फ़ाइल आकार को और कम करने के लिए प्रक्षेपवक्र से पानी को पट्टी करने का विकल्प चुन सकता है। यह GROMACS पर इंडेक्स फ़ाइलों, VMD पर TCL स्क्रिप्ट, या MDAnalysis और MDTraj जैसे पायथन पुस्तकालयों के साथ किया जा सकता है।
  3. क्षेत्र-प्रति-लिपिड टाइमसीरीज़ से निर्धारित प्रक्षेपवक्र के समतुल्य भाग के दौरान चुने हुए विश्लेषण करें।
    नोट: विशिष्ट झिल्ली विश्लेषण और उन्हें चलाने के तरीके पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के उपयोग और प्राप्त किए जा सकने वाले परिणामों को चित्रित करने के लिए, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के लिए झिल्ली मॉडल के लिए एक तुलनात्मक अध्ययन पर चर्चा की गई है। इस अध्ययन में दो मॉडल थे (i) पीआई मॉडल, जिसमें ईआर में पाए जाने वाले शीर्ष चार लिपिड प्रजातियां शामिल हैं, और (ii) पीआई-पीएस मॉडल, जिसने आयनिक फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस) लिपिड प्रजातियों को जोड़ा। इन मॉडलों को बाद में एक वायरल प्रोटीन के अध्ययन में उपयोग किया गया था और यह झिल्ली के साथ कैसे बातचीत करता है, पीएस पर रुचि को वायरल प्रोटीन23 की परमेबिलाइजेशन गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण बताया गया है। लिपिड पूंछ संरचनाओं में विविधता को शामिल करने के लिए, झिल्ली रचनाओं को DOPC: DPPE: CHOL: POPI (56: 22: 10: 12 mol%) और DOPC: DPPE: CHOL: POPI: DOPS (55: 21: 11: 9: 4 mol%) के रूप में सेट किया गया था।

झिल्ली चार्म-जीयूआई मेम्ब्रेन बिल्डर के साथ उत्पन्न हुई थी। 4 अलग-अलग लिपिड प्रजातियों और बाद में प्रोटीन को समायोजित करने के लिए, सममित झिल्ली को 600 लिपिड / पत्रक में सेट किया गया था। प्रोटोकॉल में अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग 303 K के तापमान के साथ किया गया था। स्वतंत्र प्रतिकृतियां सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक झिल्ली मॉडल के लिए निर्माण प्रक्रिया को तीन बार दोहराया गया, जिसके परिणामस्वरूप हर बार लिपिड का एक अलग यादृच्छिक मिश्रण हुआ। सिस्टम के निर्माण के बाद, इनपुट फाइलों को जीआरओएमएसीएस संस्करण 2020.5 का उपयोग करके एमडी सिमुलेशन चलाने के लिए यूबी सेंटर फॉर कम्प्यूटेशनल रिसर्च (सीसीआर) हाई-परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग क्लस्टर55 में ले जाया गया। 6-चरण छूट प्रोटोकॉल पूरा होने के बाद, बेंचमार्किंग प्रति मॉडल केवल एक प्रणाली पर की गई थी (चित्रा 3) क्योंकि परमाणुओं की संख्या सभी प्रतिकृतियों में समान है। अधिकतम प्रदर्शन का 75% ~ 78 एनएस / दिन था, इसलिए, उत्पादन चलाने के लिए क्लस्टर पर अधिक से अधिक 6 नोड्स का अनुरोध किया गया था। *.mdp फ़ाइल में nstep = 25 x 107 सेट करके और बेंचमार्क के आधार पर आवश्यकतानुसार क्लस्टर को एक्सटेंशन सबमिट करके प्रत्येक प्रतिकृति को 500 ns तक चलाया गया था।

Figure 3
चित्र 3. नमूना बेंचमार्क चलता है। पीआई मॉडल (315,000 परमाणुओं) के प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रत्येक प्रतिकृति के लिए क्षेत्र-प्रति-लिपिड (एपीएल) चित्रा 4 में दिखाया गया है। यह ऊर्जा अंतर्निहित कार्यक्रम का उपयोग करके GROMACS से *edr सिमुलेशन आउटपुट फ़ाइल में संग्रहीत सिमुलेशन बॉक्स के XY आयामों से गणना की गई थी। फिर, प्रत्येक मॉडल में एपीएल का अनुमान प्रदान करने के लिए कुल सतह क्षेत्र को प्रति पत्रक कुल लिपिड की संख्या से विभाजित किया गया था। सभी प्रणालियों के लिए, संतुलन को उस बिंदु के रूप में निर्धारित किया गया था जहां एपीएल एक पठार तक पहुंचता है और एक स्थिर मूल्य के बारे में उतार-चढ़ाव करता है। इन सभी प्रणालियों में, संतुलन प्रक्षेपवक्र के पहले 100 एनएस के भीतर पहुंच जाता है ( चित्र 4 देखें)। इस मीट्रिक के आधार पर, 500 एनएस के प्रक्षेपपथ को इन प्रणालियों के लिए पर्याप्त माना गया था। इन बाइलेयर पर अन्य सभी विश्लेषण प्रक्षेपवक्र के अंतिम 400 एनएस पर किए गए थे, जिन्हें समतुल्य या उत्पादन चरण के रूप में जाना जाता है। प्रत्येक गणना मूल्य में अनिश्चितता निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक 10-20 एनएस को ब्लॉक-औसत करने की सिफारिश की जाती है। एपीएल विश्लेषण से, पीआई-पीएस झिल्ली मॉडल में औसतन, पीआई मॉडल की तुलना में 0.7 ए2 बड़ा सतह क्षेत्र है।

Figure 4
चित्र 4. क्षेत्र-प्रति-लिपिड उदाहरण। (ए) पीआई और (बी) पीआई-पीएस मॉडल। प्रत्येक मॉडल के लिए प्रतिकृति 1, प्रतिकृति 2, और प्रतिकृति 3 लाल, नीले और हरे रंग में दिखाए गए हैं। सभी प्रणालियों के लिए संतुलन पहले 100 एनएस के भीतर होता है। अनिश्चितता को माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके अलावा, झिल्ली संरचना पर दो सरल विश्लेषण प्रस्तुत किए गए हैं। चित्र 5 झिल्ली की मोटाई को दर्शाता है, जो शीर्ष और निचले पत्रक में फॉस्फोलिपिड्स के फॉस्फेट परमाणुओं के द्रव्यमान केंद्र (सीओएम) के बीच की दूरी से अनुमानित है। इसकी गणना GROMACS में दूरी कार्यक्रम का उपयोग करके की गई थी, जिसके लिए एक इंडेक्स फ़ाइल की आवश्यकता होती है जो दो परमाणु समूहों को सूचीबद्ध करती है, एक शीर्ष पत्रक में फॉस्फेट समूहों के लिए और दूसरा समूह नीचे पत्रक में उन लोगों के लिए। परिणाम दो झिल्ली मॉडल की मोटाई के बीच एक सांख्यिकीय अंतर दिखाते हैं, जो एपीएल और झिल्ली मोटाई के बीच एक विपरीत संबंध को दर्शाता है। अंत में, चित्रा 6 प्रत्येक लिपिड प्रजातियों के ड्यूटेरियम ऑर्डर मापदंडों को दर्शाता है, एक उपाय जो बाइलेयर हाइड्रोफोबिक कोर56 के भीतर लिपिड पूंछ के क्रम को निर्धारित करता है। फैटी एसिड पूंछ को एसएन 1 के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो ग्लिसरॉल रीढ़ की हड्डी के टर्मिनल ऑक्सीजन से जुड़ा होता है, और एसएन 2, ग्लिसरॉल समूह के केंद्रीय ऑक्सीजन से जुड़ा होता है। परिणाम बताते हैं कि मॉडल के बीच लिपिड पूंछ के क्रम के बीच कोई अंतर नहीं है, डीपीपीई को छोड़कर जो पीआई मॉडल में एसएन 1 पूंछ के क्रम में मामूली वृद्धि दिखाता है।

Figure 5
चित्र 5. झिल्ली मोटाई उदाहरण। (ए) पीआई और (बी) पीआई-पीएस मॉडल। प्रत्येक मॉडल के लिए प्रतिकृति 1, प्रतिकृति 2, और प्रतिकृति 3 लाल, नीले और हरे रंग में दिखाए गए हैं। अनिश्चितता को माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. ड्यूटेरियम ऑर्डर पैरामीटर उदाहरण। (ए) डीओपीसी, (बी) डीपीपीई, (सी) पीओपीआई, और (डी) डीओपीएस लिपिड प्रजातियां। एसएन 1 के लिए ठोस लाइनें, एसएन 2 के लिए डैश लाइनें, लाल रंग में पीआई मॉडल और नीले रंग में पीआई-पीएस मॉडल। अनिश्चितता को माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जटिल झिल्ली मॉडल का उपयोग विशिष्ट लिपिड प्रजातियों की प्रासंगिकता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और ये झिल्ली के साथ बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत को कैसे नियंत्रित करते हैं। प्रयोगशाला से नमूना अध्ययन से पता चलता है: (1) झिल्ली संरचना प्रोटीन19 की बातचीत को नियंत्रित करती है, और (2) लिपिड पूंछ संतृप्ति और झिल्ली सतह चार्ज प्रभाव पारगम्यता और छोटे अणुओं के पार्श्व संगठन17,57। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल और पिछले पैराग्राफ में प्रस्तुत किए गए समान विश्लेषण का उपयोग करते हुए, ली एट अल द्वारा किया गया काम डी 112, एक संभावित फोटोडायनामिक थेरेपी एजेंट और विभिन्न लिपिड मिश्रण17 के बीच परस्पर क्रिया पर प्रयोग और सिमुलेशन से अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। बाइलेयर में डी 112 विभाजन को चिह्नित करने के लिए एक प्रयोग में पीसी और पीएस लिपिड के साथ एक बाईलेयर की जांच की गई थी। हमने डी 112-झिल्ली इंटरैक्शन पर सतह चार्ज और हाइड्रोफोबिक वातावरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अलग-अलग फैटी एसिड पूंछ की लंबाई और संतृप्ति, यानी डबल बॉन्ड की संख्या के साथ पीसी और पीएस लिपिड के विभिन्न राशनों के सिमुलेशन किए। जबकि इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन आयनिक पीएस लिपिड के लिए डी 112 के प्रारंभिक बंधन को चलाते हैं, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन अणु को दो संभावित तंत्रों के माध्यम से झिल्ली कोर में खींचते हैं (चित्रा 7 ए-बी देखें)। झिल्ली के अंदर, डी 112 अधिमानतः पीसी-समृद्ध डोमेन के लिए स्थानीयकृत होता है, या तो मोनोमर या डिमर के रूप में।

Figure 7
चित्र 7. प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए अतिरिक्त नमूना प्रणाली। मॉडल झिल्ली के साथ डी 112 के सिमुलेशन दो सम्मिलन तंत्र (ए) हार्पून और (बी) फ्लिप की पहचान करते हैं; (सी) डी 112 डिमर का अभिविन्यास; और (डी) चार्ज किए गए लिपिड (नारंगी क्लस्टर) के संबंध में एक झिल्ली मॉडल पर डी 112 अणुओं (नीले समोच्च मानचित्र) का पार्श्व वितरण। पूर्ण अध्ययन 17 में पाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रायोगिक तकनीक क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) 58, फ्लोरेसेंस तकनीक और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) 59 का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन पर बायोमोलेक्यूल्स की कल्पना कर सकती है। हालांकि, आणविक इंटरैक्शन की परस्पर क्रिया और गतिशीलता को पकड़ना चुनौतीपूर्ण है जो परमाणु या अमीनो एसिड स्तर पर जैविक मार्गों, रोग रोगजनन और चिकित्सीय वितरण को रेखांकित करता है। यहां, लिपिड झिल्ली का अध्ययन करने के लिए एमडी सिमुलेशन की क्षमताओं और इन प्रणालियों को डिजाइन, निर्माण, चलाने और विश्लेषण करने के मुख्य चरणों पर चर्चा की गई थी। इस कम्प्यूटेशनल विधि का लाभ परमाणु विस्तार और अंतर्निहित समीकरण हैं जो झिल्ली इंटरफ़ेस पर आणविक तंत्र का प्रस्ताव और विशेषता करने के लिए आणविक इंटरैक्शन को मॉडल करते हैं।

कोशिका झिल्ली का अनुकरण करते समय एक महत्वपूर्ण कदम अध्ययन की जाने वाली जैविक प्रणाली की एक ठोस समझ है। शामिल की जाने वाली लिपिड प्रजातियां जीव, सेलुलर डिब्बे और, सबसे महत्वपूर्ण बात, अध्ययन की जाने वाली प्रक्रिया पर निर्भर करती हैं। सममित झिल्ली के साथ सिमुलेशन शुरुआती एमडी उपयोगकर्ताओं के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। विषमता, हालांकि पीएम जैसे झिल्ली की एक ज्ञात विशेषता है, संभावित कठिनाइयों को जोड़ती है क्योंकि पत्रक के बीच पार्श्व प्रसार और स्टेरोल्स के आदान-प्रदान का ठीक से नमूना लेने के लिए लंबे समय तक सिमुलेशन समय की आवश्यकता होती है। विषमता प्रत्येक पत्रक के एपीएल में एक बेमेल का भी परिचय देती है जिसे सिमुलेशन52,53 में सावधानीपूर्वक इलाज किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम सिम्युलेटेड किए जाने वाले झिल्ली पैच के आकार को निर्धारित करना है, जो लिपिड मिश्रण की जटिलता और उपलब्ध कम्प्यूटेशनल संसाधनों पर निर्भर करता है; बड़े झिल्ली पैच में अधिक कंप्यूटिंग समय लगता है, जो हमेशा संभव नहीं हो सकता है। सजातीय या द्विआधारी प्रणालियों के लिए कम से कम 150 लिपिड / पत्रक का आकार, और अधिक जटिल रचनाओं के लिए 600 लिपिड / पत्रक तक की सिफारिश की जाती है। यदि प्रोटीन-झिल्ली अध्ययन के लिए झिल्ली मॉडल का उपयोग किया जाता है, तो अंगूठे का एक अच्छा नियम एक झिल्ली पैच बनाना है जो प्रोटीन के सबसे लंबे आयाम के 2-3 गुना के बीच समायोजित कर सकता है। छोटे अणुओं की जांच करते समय, परिमित आकार के प्रभावों से बचने के लिए पैच आकार कवरेज 30% -40% से नीचे रहना चाहिए। संतुलन निर्धारित करने के लिए मीट्रिक के आधार पर, जटिल लिपिड मिश्रण को शुद्ध लिपिड या बाइनरी मिश्रण की तुलना में कम से कम 3 गुना अधिक सिमुलेशन समय की आवश्यकता हो सकती है।

बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन के लिए प्रारंभिक निर्देशांक स्थापित करने के लिए कई विकल्प हैं। सामान्य सॉफ्टवेयर पैकेजों में GROMACS36, VMD 42, PACKMOL60, Moltemplate 61 और CHARMM-GUI 62 शामिल हैं। सी-जीयूआई एक वेब-आधारित मंच है जिसे इन प्रणालियों के निर्माण की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, इसकी लिपिड लाइब्रेरी में अणुओं की एक विस्तृत विविधता के साथ। यह विभिन्न एमडी इंजनों और बल क्षेत्र मापदंडों के लिए इनपुट फाइलें प्रदान करता है, जिससे यह शुरुआती लोगों के लिए एक महान प्रारंभिक बिंदु बन जाता है। निर्माण चरणों के दौरान, सी-जीयूआई व्यक्तिगत लिपिड प्रजातियों के लिए क्षेत्र-प्रति-लिपिड का अनुमान प्रदान करता है। जटिल लिपिड मिश्रण (5+ प्रजातियों) का निर्माण करते समय इस अनुमान को 10% -15% तक बढ़ाना उपयोगी है, खासकर यदि मॉडल में स्टेरोल्स का उपयोग किया जाता है। यदि सी-जीयूआई लाइब्रेरी में रुचि का लिपिड नहीं पाया जाता है, तो कोई स्थान धारक के रूप में एक करीबी लिपिड संरचना का उपयोग कर सकता है और फिर सिस्टम के निर्माण और प्रारंभिक छूट के बाद वीएमडी या पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग करके संरचना को संशोधित कर सकता है। चूंकि सी 36 एम एक योजक बल क्षेत्र63 है, इसलिए आमतौर पर अद्यतन लिपिड संरचना के लिए कोई पुन: परमेट्राइजेशन की आवश्यकता नहीं होती है, बशर्ते नए अणु में सभी परमाणु प्रकार बल क्षेत्र में मौजूद हों। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सी-जीयूआई पर उपलब्ध हर विकल्प को इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया है, लेकिन शुरुआती लोगों के लिए प्रासंगिक और क्षेत्र में सामान्य प्रथाओं के अनुरूप दिखाए गए हैं; उन्नत विकल्पों को डेवलपर्स54,62,64 द्वारा संबोधित और प्रकाशित किया गया है।

थर्मोडायनामिक पहनावा, तापमान और दबाव जैसे सिमुलेशन की स्थिति अध्ययन की प्रकृति पर निर्भर करेगी। इस प्रोटोकॉल के लिए, सी-जीयूआई में डिफ़ॉल्ट के रूप में शर्तों को रखा गया था, जो द्रव चरण में झिल्ली सिमुलेशन के लिए विशिष्ट हैं। जेल चरण जैविक झिल्ली को मॉडल करने के लिए वांछनीय नहीं है, यह लिपिड के संक्रमण तापमान से नीचे होता है, और एक कोण पर लिपिड पूंछ के समानांतर संरेखण द्वारा पहचानना आसान है। यह विभिन्न अध्ययन उद्देश्यों के लिए या सहयोगियों के प्रयोगों के अनुसार, यदि कोई हो, बदल सकता है। एमडी रन के दौरान, झिल्ली बाइलेयर के लिए विशिष्ट सेटिंग्स में शामिल हैं: (1) हाइड्रोजन-ऑक्सीजन बॉन्ड65 की सबसे तेज कंपन गति को पकड़ने के लिए एए एमडी के लिए 1-4 एफएस टाइमस्टेप; आमतौर पर 2 एफएस का उपयोग उत्पादन के लिए किया जाता है, लेकिन 1 एफएस का उपयोग विश्राम और न्यूनीकरण चरणों के दौरान किया जाता है, और यदि एचएमआर51 नियोजित किया जाता है तो 4 एफएस का उपयोग किया जा सकता है; (2) 0.05-0.2 एनएस के बीच डेटा बचत आवृत्तियों आम अभ्यास हैं; (3) वैन डेर वाल इंटरैक्शन के लिए 1.0 और 1.2 एनएम के नरम और हार्ड कटऑफ के साथ वर्लेट कटऑफ स्कीम66। बड़ी कटऑफ त्रिज्या सेट करने से सिमुलेशन प्रदर्शन कम हो जाता है क्योंकि परमाणु जोड़े के बीच अधिक इंटरैक्शन की गणना की जाती है; हालांकि, पार्श्व दबाव प्रोफाइल की गणना करने के लिए एक बड़ी कटऑफ की आवश्यकता होती है, जिसके लिए आमतौर पर 2.0-2.4 एनएम के कटऑफ की आवश्यकता होती है; (4) कण जाल एडवर्ड (पीएमई) योजना67 1.2 एनएम के कटऑफ के साथ लंबी दूरी के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए उपयोग किया जाता है; (5) LINCS एल्गोरिथ्म68 का उपयोग GROMACS में हाइड्रोजन बांड को बाधित करने के लिए किया जाता है; (6) एक सामान्य दबाव नियंत्रक है पेरिनेलो-रहमान बैरोस्टैट जो बाइलेयर के लिए अर्ध-आइसोट्रोपिक रूप से लागू होता है; (7) एक सामान्य तापमान नियंत्रक नोज-हूवर थर्मोस्टेट है। ध्यान दें कि कई प्रकार के बैरोस्टैट्स और थर्मोस्टैट्स हैं जिनका उपयोग सिमुलेशन में किया जा सकता है और अध्ययनकी प्रकृति पर निर्भर करता है।

एपीएल, झिल्ली मोटाई, और स्टेरोल फ्लिप-फ्लॉप यह निर्धारित करने के लिए सामान्य मीट्रिक हैं कि क्या कोई प्रणाली थर्मल संतुलन तक पहुंच गई है, जो पसंद के मीट्रिक के आधार पर शुद्ध बाइलेयर के लिए 50 एनएस से लेकर जटिल असममित मिश्रण के लिए 4000 एनएस तक हो सकती है। संतुलन तक पहुंचने के बाद बाइलेयर के यांत्रिक, संरचनात्मक और गतिशील गुणों का विश्लेषण किया जाना चाहिए, यानी, एक बार जब ब्याज की संपत्ति एक पठार तक पहुंच जाती है और औसत मूल्य के संबंध में उतार-चढ़ाव होती है। प्रक्षेपवक्र का समतुल्य भाग, जिसे उत्पादन चरण के रूप में भी जाना जाता है, उचित सांख्यिकीय विश्लेषण और अनिश्चितता के अनुमानों के लिए कम से कम 100 एनएस लंबा होना चाहिए। सिमुलेशन से गणना किए जा सकने वाले सामान्य झिल्ली गुणों में ड्यूटेरियम ऑर्डर पैरामीटर, इलेक्ट्रॉन घनत्व प्रोफाइल, रेडियल वितरण फ़ंक्शन, लिपिड पूंछ या हेडग्रुप के झुकाव कोण, संपीड़ित ता मापांक, लिपिड रोटेशन का विश्राम समय, झुकने का मापांक, पार्श्व दबाव प्रोफाइल, लिपिड क्लस्टरिंग पैटर्न और झिल्ली इंटरफ़ेस35,70 के पास पानी की गतिशीलता शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं। 71; मोराडी एट अल द्वारा एक समीक्षा इनमें से कुछ काअधिक विस्तार से वर्णन करती है। इन विश्लेषणों को GROMACS और VMD से अंतर्निहित विश्लेषणात्मक उपकरणों के साथ या पायथन, बैश या टीसीएल स्क्रिप्टिंग का उपयोग करके किया जा सकता है। कई ओपन-सोर्स पायथन लाइब्रेरी भी हैं जैसे कि एमडीएनालिसिस 72,73, एमडीट्राज 74, पाइसिम 75, पाइम्मा76, और पाइलिपआईडी 77 जो सिमुलेशन ट्रैजेक्टरीज के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं।

यह प्रोटोकॉल एक ऑल-एटम दृष्टिकोण पर केंद्रित है, जो कम्प्यूटेशनल रूप से मांग कर रहा है यदि एक अध्ययन का लक्ष्य बड़े झिल्ली पैच के साथ बातचीत करने वाले बड़े प्रोटीन की गतिशीलता को चिह्नित करना है। बहरहाल, कम्प्यूटेशनल शक्ति में वृद्धि और ग्राफिकल-यूनिट प्रोसेसर (जीपीयू) के उपयोग ने बड़े सिस्टम के सिमुलेशन का पक्ष लिया है। एमडी सिमुलेशन को संपत्ति औसत की गणना करने के लिए सिस्टम अनुरूपता के पर्याप्त नमूने की आवश्यकता होती है जो प्रयोगात्मक मूल्यों को सटीक रूप से पुन: पेश करते हैं। यथार्थवादी झिल्ली मॉडलिंग का उद्देश्य रुचि की कोशिका झिल्ली के लिए एक सटीक यांत्रिक और संरचनात्मक वातावरण को पुन: पेश करना है, जो सीधे अन्य बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत को प्रभावित करता है और दुर्लभ घटनाओं 78,79,80 के नमूने की सुविधा प्रदान करता है। डेटा की व्याख्या करते समय, किसी को प्रयोगात्मक रुझानों या समान प्रणालियों के लिए वास्तविक मूल्यों के साथ टिप्पणियों को मान्य करने के लिए सावधान रहना चाहिए ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि मॉडल सिस्टम न केवल सिमुलेशन की एक कलाकृति हैं या अशारीरिकघटनाओं का गठन करते हैं। निष्कर्ष में, एमडी सिमुलेशन सांख्यिकीय ऊष्मप्रवैगिकी के आधार पर आणविक इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। एमडी सिमुलेशन का उपयोग झिल्ली संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों पर लिपिड विविधता के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान बायोमोलेक्यूल्स के साथ अलग-अलग बातचीत होती है। प्रोटोकॉल जटिल लिपिड झिल्ली प्रणालियों के डिजाइन, निर्माण, रन और विश्लेषण के लिए एक शुरुआती-अनुकूल दृष्टिकोण प्रदान करता है। ये चरण झिल्ली-केवल प्रणालियों के साथ-साथ झिल्ली इंटरफ़ेस के पास प्रोटीन या छोटे अणुओं को अनुकरण करने का काम करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ों ने इस पांडुलिपि के लेखन के दौरान अपने सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र और चर्चाओं के लिए जिनहुई ली और रिकार्डो एक्स रामिरेज़ को धन्यवाद दिया। ओ.सी. को बफ़ेलो प्रेसिडेंशियल फैलोशिप विश्वविद्यालय और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ की पहल फॉर मैक्सिममाइज़िंग स्टूडेंट डेवलपमेंट ट्रेनिंग ग्रांट 1T32GM144920-01 द्वारा मार्गरीटा एल डुबोकोविच (पीआई) को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaconda3 Anaconda Inc (Python & related libraries) N/A
CHARMM-GUI.org Im lab, Lehigh University N/A
GROMACS GROMACS development team N/A
Linux HPC Cluster UB CCR N/A
MATLAB MathWorks N/A
VMD Theoretical and Computational Biophysics Group N/A

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References

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Campbell, O., Le, V., Aguirre, A., Monje-Galvan, V. Realistic Membrane Modeling Using Complex Lipid Mixtures in Simulation Studies. J. Vis. Exp. (199), e65712, doi:10.3791/65712 (2023).

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