Summary
פרוטוקול זה מתאר את המודל של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת בעכברים באמצעות חסימה תוך לומינלית של עורק המוח האמצעי. בנוסף, דוגמאות להערכת תוצאות מוצגות באמצעות הדמיית תהודה מגנטית ומבחני התנהגות.
Abstract
שבץ עומד כגורם עיקרי למוות או נכות כרונית ברחבי העולם. עם זאת, הטיפולים האופטימליים הקיימים מוגבלים לטיפולי רפרפוזיה בשלב החריף של שבץ איסכמי. כדי לקבל תובנות על הפיזיופתולוגיה של שבץ מוחי ולפתח גישות טיפוליות חדשניות, מודלים של מכרסמים in vivo של שבץ ממלאים תפקיד בסיסי. זמינותם של בעלי חיים מהונדסים גנטית הניעה במיוחד את השימוש בעכברים כמודלים ניסיוניים לשבץ.
בחולי שבץ, חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA) היא תופעה שכיחה. כתוצאה מכך, המודל הניסיוני הנפוץ ביותר כולל חסימה תוך לומינלית של MCA, טכניקה זעיר פולשנית שאינה דורשת כריתת גולגולת. הליך זה כולל החדרת מונופילמנט דרך עורק התרדמה החיצוני (ECA) וקידומו דרך עורק התרדמה הפנימי (ICA) עד שהוא מגיע לנקודת ההסתעפות של MCA. לאחר חסימת עורקים של 45 דקות, המונופילמנט מוסר כדי לאפשר רפרפוזיה. לאורך כל התהליך, זרימת הדם במוח מנוטרת כדי לאשר את ההפחתה במהלך חסימה ולאחר מכן התאוששות עם זילוח. תוצאות נוירולוגיות ורקמות מוערכות באמצעות בדיקות התנהגותיות ומחקרי דימות תהודה מגנטית (MRI).
Introduction
שבץ מוחי הוא מחלה הרסנית המשפיעה על כ -15 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. כשליש מהחולים נכנעים למצב, ושליש נוסף חווים נכות לצמיתות. שבץ מוחי הוא פתולוגיה מורכבת המערבת סוגי תאים שונים, כגון תאי חיסון עצביים והיקפיים, כלי דם ותגובות מערכתיות1. הרשת המורכבת של תגובות המופעלות על ידי שבץ ברמת המערכות אינה ניתנת כיום לשכפול באמצעות מודלים במבחנה . לפיכך, מודלים ניסיוניים של בעלי חיים חיוניים כדי להתעמק במנגנוני המחלה ולפתח ולבחון טיפולים חדשים. נכון לעכשיו, פרפוזיה מוקדמת של רקמות היא ההתערבות המאושרת היחידה, או באמצעות פקקת עם מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה (tPA) או טרומבקטומיה אנדווסקולרית1.
חסימות של עורק המוח האמצעי (MCA) שכיחות בחולי שבץ. כתוצאה מכך, מודלים של מכרסמים של חסימת MCA חולפת (tMCAo) פותחו בתחילה בחולדות 2,3,4. כיום, עכברים מהונדסים גנטית הם בעלי החיים הנפוצים ביותר במודלים ניסיוניים של שבץ. במחקר זה אנו מתארים מודל זעיר פולשני של tMCAo תוך לומינלי בעכברים. הגישה מתבצעת דרך עורק התרדמה בגובה הצוואר, ללא כריתת גולגולת.
משך תקופת החסימה הוא גורם קריטי הקובע את היקף הנגע האיסכמי. אפילו חסימות קצרות של 10 דקות יכולות לגרום למוות עצבי סלקטיבי ללא אוטם נראה לעין, בעוד שחסימות ארוכות יותר, הנמשכות בדרך כלל 30 עד 60 דקות, גורמות למידה מסוימת של אוטם מוחי. שלא כמו הענפים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה-MCA המספקים את קליפת המוח ויש להם בטחונות, העורקים הלנטיקולו-סטריאטליים המספקים דם לסטריאטום חסרים בטחונות5. כתוצאה מכך, יש ירידה גדולה יותר בזרימת הדם בסטריאטום מאשר בקליפת המוח לאחר tMCAo. לפיכך, חסימות של 30 דקות או פחות משפיעות בדרך כלל על הסטריאטום אך לא על קליפת המוח, בעוד שחסימות ארוכות יותר, מ-45 דקות ואילך, יוצרות לעתים קרובות נגע איסכמי בכל טריטוריית MCA, כולל הסטריאטום וקליפת המוח הגבית-צדית.
כדי להבטיח את רווחתם של העכברים, אנו מנהלים משככי כאבים לפני ההליך ומשתמשים בהרדמה במהלך הניתוח. עם זאת, הרדמה יכולה להציג שינויים מלאכותיים בפיזיולוגיה של העכבר ולהשפיע על כמה מדדי תוצאה6. ההתערבות הכירורגית, כאשר היא מבוצעת על ידי צוות מנוסה, נמשכת בדרך כלל כ -15 דקות להשראת MCAo. לאחר מכן, הזמן הכולל תחת הרדמה תלוי בתקופת החסימה. בניסויים בהם יש חשיבות מכרעת למזעור ההרדמה, שלב חלופי בהליך כרוך בהפסקת ההרדמה במהלך תקופת החסימה והגבלתה רק לשלבים הכירורגיים להחדרה והוצאה של חוט הלהט המסתיר את ה-MCA. גישה זו מפחיתה את משך ההרדמה וממזערת את ההשפעות המלאכותיות האפשריות שלה על מודל הניסוי 7,8. לכן, השיטה של גרימת איסכמיה מוקדית חולפת מוצגת על ידי חסימה intraluminal של MCA עם שתי גרסאות: עם העכבר מורדם במהלך כל תקופת חסימה או עם העכבר ער בתקופה זו. בכל מקרה, יש לבצע ניתוח דמה במקביל להתערבות המתבצעת בעכברים האיסכמיים. בנוסף, נתונים על הערכת תוצאות מסופקים כפי שנמדדו על ידי מבחנים התנהגותיים ו- MRI בנקודות זמן שונות לאחר רפרפוזיה. לבסוף, נדונים הגורמים העיקריים שיש לקחת בחשבון בעת יישום הליך הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודת בעלי חיים נעשתה בעקבות החוקים הקטלאניים והספרדיים (Real Decreto 53/2013) והדירקטיבות האירופיות, באישור הוועדה האתית (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) של אוניברסיטת ברצלונה, וגופי הרגולציה המקומיים של Generalitat de Catalunya. מחקרים מדווחים בהתאם להנחיות ARRIVE . הליך זה מיועד לביצוע בעכברים בוגרים, החל מגיל 8 שבועות, ללא הגבלת גיל. דוגמאות להליך כירורגי שפותח בעכברי C57BL/6 בגילאי 10-12 שבועות מובאות כאן. יש לקחת בחשבון הבדלים אנטומיים בהתאם לזן העכבר.
1. הכנת בעלי חיים
- לפני תחילת ההליך הכירורגי, לאסוף ולעקר את כל החומרים והכלים הדרושים. ערכו את שולחן הניתוחים עם כל החומרים הכירורגיים הדרושים (המפורטים בטבלת החומרים).
- מרדימים את בעל החיים באמצעות שאיפת איזופלורן בתערובת של חמצן ותחמוצת החנקן (30%/70%).
- מתן buprenorphine (ראה טבלה של חומרים) תת עורית במינון של 0.05 מ"ג / ק"ג BW כדי לספק שיכוך כאבים ולהקל על כל כאב ואי נוחות.
הערה: שיכוך כאבים הוא חובה, אך פרוטוקולים שונים מתקבלים. סימני כאב ואי נוחות חייבים להיות נשלטים גם בימים הראשונים לאחר MCAo (ראה שלב 4). החל פתרונות מתקנים בעת הצורך. - הכניסו את בעל החיים לקופסת אינדוקציה להרדמה (ראו טבלת חומרים) עם איזופלורן 5% עד שהוא מגיע למצב של הרדמה עמוקה (אובדן רפלקס בניקור כפות ורפלקס עיני).
- מקם את העכבר על שולחן הניתוחים ולהפחית את רמת isoflurane ל 1.5%, מועבר על ידי מסכת פנים. יש למרוח משחה וטרינרית כדי למנוע יובש בעיניים במהלך ההליך.
- שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ± 0.5 ° C נשלט על ידי בדיקה רקטלית המחוברת כרית חימום (ראה טבלה של חומרים).
- לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ואת הראש (calvaria) עם סכין גילוח חשמלי. יש להסיר בזהירות שאריות פרווה ולחטא את אזורי העור שלוש פעמים בתנועות מעגליות עם חומר חיטוי על בסיס יוד ו-70% אלכוהול.
.
2. הערכת זרימת דם מוחית (CBF) באמצעות מד זרימה דופלר בלייזר (LDF)
- עם מספריים, לעשות חתך על העור של הראש, לכיוון התפר sagittal, מן האוזניים לאזור בין העיניים.
- למשוך את העור ולהסיר את periosteum בצד ימין של הגולגולת.
- מצאו את הקואורדינטות (2.5 מ"מ רוחביות מברגמה) וחברו את מחזיק הדופלר (ראו טבלת חומרים) באמצעות ציאנואקרילט. לאחר שהדבק התייבש, חברו את בדיקת דופלר ובדקו את קריאת האות הנכונה.
3. חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (tMCAo)
- הפוך את העכבר למצב שכיבה, וקבע אותו לשולחן הניתוחים עם סרט רפואי.
- בצע חתך קו אמצע בצוואר. משוך לרוחב את העור ואת בלוטות הרוק באמצעות retractors (ראה טבלה של חומרים) כדי לחשוף את אזור התרדמה.
- זהו את האנטומיה של כלי הדם של עורק התרדמה המשותף (CCA), האגודה למלחמה בסרטן וה-ECA, כמו גם את העורקים השונים הנגזרים מהם (מקסילרי ולשוני, בלוטת התריס העליונה, העורפית והפטריגופלטין) (איור 1A).
- נתקו את העורקים הראשיים מרקמת החיבור הסמוכה כדי שניתן יהיה לטפל בהם.
הערה: היזהר במיוחד לא לפגוע בעצבים, במיוחד בעצב התועה, הפועל במקביל ל- CCA. - יש לעטוף תפר משי 6-0 (ראו טבלת חומרים) סביב ה-ECA בהתפצלות המקסילרית/לשונית. אבטח היטב קשר כדי להפריע לצמיתות את זרימת הדם.
- מעבירים תפר שני סביב אותו עורק, בין הקשר הראשון לביפורקציה של CCA, ושומרים על קשר זה רופף.
- מניחים חוט שלישי סביב CCA וקושרים קשר מחליק שניתן להתיר בקלות.
הערה: זה יכול להתבצע גם עם קליפס כלי דם, אבל החוט מאפשר יותר תנועה וגמישות. בשלב זה ניתן לראות ירידה ראשונה ב- CBF באות LDF. - הניחו אטב כלי דם (ראו טבלת חומרים) המפריע לזרימת הדם מהאגודה למלחמה בסרטן.
- בצע חתך קטן ב- ECA, קרוב לאזור בו נמצא הקשר ההדוק.
- הכנס את המונופילמנט עד שהציפוי העבה נכנס לחלוטין ללומן העורקי.
- הדקו את הקשר השני כדי להחזיק את המונופילמנט בתוך העורק ומנעו מהלחץ שהדם מפעיל לדחוף אותו החוצה (איור 1B).
- הסר את אטב כלי הדם מהאגודה למלחמה בסרטן.
- חתכו את ה-ECA מתחת לקשר הראשון וסובבו את הגדם כדי לכוון אותו לכיוון ה-ICA (איור 1C).
- מקדמים את המונופילמנט דרך האגודה למלחמה בסרטן עד לנקודה שבה ה-MCA מסתעף.
הערה: החסימה משתקפת בירידה פתאומית בזרימת הדם בקריאת LDF. אנו רואים חסימה מוצלחת כאשר הירידה ב- CBF גדולה מ -70% מהערך הבסיסי. אם מערכות מדידה CBF אינן זמינות, ניתן לציין את נקודת החסימה על ידי ההתנגדות להתקדמות, אשר בעכברים בוגרים היא בדרך כלל כ -11 מ"מ מההתפצלות של CCA.- אם ההרדמה נמשכת במהלך תקופת החסימה, לפקח על העכבר ולשמור אותו תחת השגחה מתמדת במשך 45 דקות.
- במקרה שהעכבר מתעורר במהלך תקופת החסימה, תפרו את עור הצוואר במספר תפרים. מבלי לנתק את בדיקת LDF, הניחו את העכבר בקופסה מבוקרת טמפרטורה, המאפשרת התאוששות מהרדמה.
הערה: זה נפוץ עבור העכבר להפגין התנהגות סיבובית ספונטנית במהלך תקופה זו, המעיד על חסימה מוצלחת. - לאחר 40 דקות, יש להרדים את העכבר שוב לאחר אותם הליכי הרדמה וחיטוי כפי שמצוין בנקודות 1.4, 1.5 ו-1.7. הניחו אותו בחזרה על שולחן הניתוחים, והוציאו את התפרים מהצוואר.
- לאחר 45 דקות של חסימה, שחררו את הקשר המחזיק את המונופילמנט במקומו. משוך לאט ובעדינות על חוט הלהט ובדוק שמתרחשת התחדשות רקמות.
- משוך את חוט הלהט והדק את הקשר כדי למנוע איבוד דם.
- להתיר את קשר CCA. יש לוודא שאין נזק לדופן העורק.
- הסר את המחזירים ומקם מחדש את השרירים, הבלוטות והעור. תפרו את העור (6-0) ומרחו חומר חיטוי.
- נתקו את גשושית דופלר, ונתקו את המחזיק. לתפור ולחטא את העור של הראש.
- במהלך תקופת ההחלמה מהרדמה, השאירו את העכבר בכלוב המסופק עם תנור חימום כדי לשמור על הטמפרטורה. שמור אותו תחת השגחה מתמדת עד שהוא מתאושש לחלוטין מהרדמה. לאחר ההתאוששות, ניתן להחזיר את העכבר לכלוב שלו.
הערה: דיור עם העשרה חברתית מומלץ מאוד. עם זאת, לעולם אל תערבבו עכברים המופעלים עם עכברים שאינם מופעלים באותו כלוב ללא כל הפרדה פיזית על מנת למנוע תוקפנות.
4. טיפול לאחר הניתוח
- מעת לעת לפקח על בעלי החיים בהתאם לנהלים ולתקנות שנקבעו על פי התקנות המקומיות. לספק טיפול משכך כאבים בלוח הזמנים המתאים כדי למזער את הכאב לאחר הניתוח.
הערה: במחקר הנוכחי, אותו משכך כאבים יושם כמו בתחילת ההתערבות (Buprenorphine 0.05mg / kg BW) ב 6 שעות ו 24 שעות לאחר הניתוח. - לבצע המתת חסד כאשר פרמטרי הפיקוח מצביעים על כך, בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי המוסד.
- מדי יום לפקח על המשקל של בעלי החיים. לספק מזון רך לבעלי החיים בימים הראשונים לאחר הניתוח. בנוסף, לחות אותם על ידי הזרקה תת עורית של מלוחים (200 μL) מיד לאחר הניתוח מעת לעת לאחר מכן אם הוא ציין כי העכבר אינו hydrate בכוחות עצמו. סדרו את המזון והמים בצורה שתהיה נגישה לבעל החיים.
- לאחר השלמת מחקר in vivo , הרדימו את העכברים, הרדימו אותם והוציאו את רקמת המוח לניתוח היסטופתולוגי נוסף (במידת הצורך).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ישנן גישות שונות להערכת התוצאה של הליך tMCAo. שיטות דימות מוחי In vivo (MRI) ובדיקות התנהגותיות משמשות כאן.
עכברים מפתחים נגעים איסכמיים במוח, המשפיעים בעיקר על השטח המסופק על ידי MCA ipsilateral לחסימה, כגון הסטריאטום וקליפת המוח הגבית. קיימות מספר שיטות לקביעת היקף הנגע, כולל צביעת רקמות 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), צביעה היסטולוגית (hematoxylin/eosin, thionine אצטט), ושיטות דימות מוחי in vivo כמו MRI. MRI נבחר כאן בשל אופיו הלא פולשני והיכולת להשתמש באותה רקמה למחקרים אחרים, ומספק הערכה מקיפה של הנגע בכל עכבר. בנוסף, MRI מאפשר מדידות חוזרות באותם בעלי חיים, מגדיל את יכולת השחזור של התוצאות ולעתים קרובות מפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר.
אותו פרוטוקול הרדמה עם איזופלורן (אינדוקציה 5%, תחזוקה 1.5%) שימש במפגשי MRI. לצורך הערכת נפח הנגעים, נעשה שימוש ברצף משוקלל T2 מהיר (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 כדי למזער את זמן ההרדמה של החיה, דבר חשוב כאשר יש לבצע מחקרי אורך עם רכישות MRI בזמנים שונים באותם עכברים. הליך זה מאפשר הערכה של שינויים בנגע לאורך זמן באותם בעלי חיים, והוא שימושי מאוד כאשר מוחל על מחקרים neuroprotection או כדי לבדוק את יעילות התרופה, בין היתר. ניסויי תמונה נערכו על סורק בעלי חיים אופקי 7T. המפרט הטכני של הרצף האנטומי (עשוי להשתנות בהתאם לעוצמת השדה המגנטי): T2_TurboRARE; 22 קטעים קורונליים; עובי 0.5 מ"מ; זמן הד (TE) = 33 אלפיות השנייה; זמן חזרה (TR) = 2336.39 ms. 2 ממוצעים. זווית היפוך, 90°; שדה ראייה (FOV) = 20 מ"מ x 20 מ"מ, עם גודל מטריצה של 256 x 256. איור 2A מראה דוגמה מייצגת של תמונות MR של אבולוציה של נגעים באותו עכבר, שהוערכו במשך 40 דקות, 6 שעות, 24 שעות ו-48 שעות לאחר רפרפוזיה. התקדמות נפח הנגע אורכת שעות עד יומיים בקירוב. כימות נפח הנגע מראה את ההתפתחות הזו לאורך זמן (איור 2B).
מגוון סולמות נוירולוגיים תוארו כדי להעריך את הליקוי הנוירולוגי שנגרם על ידי עלבון איסכמי. אנו מציעים להשתמש במבחני ניקוד עצבי שתוארו בהרחבה בכתבי יד קודמים. לדוגמה, הבדיקה שדווחה בפירוט על ידי Orsini et al. (2012)10 מומלצת.
קיים מגוון רחב של מבחנים התנהגותיים, בעיקר כדי לאתר הבדלים בפגיעה בתפקוד המוטורי והתחושתי. לשם כך נעשה שימוש במבחן חוזק האחיזה ובמבחן הפינות. מבחן חוזק האחיזה משמש להערכת תפקוד מוטורי. חוזק הפורלימב נמדד באמצעות מד חוזק אחיזה המחובר למתמר כוח דיגיטלי (ראה טבלת חומרים). העכבר אוחז במוט אופקי עם שתי הכפות הקדמיות תוך משיכה עדינה לאחור דרך הזנב. מצוין החוזק המרבי של האחיזה לפני שחרור הכפות הקדמיות. חמישה ניסויים לכל חיה מבוצעים, והערך העיקרי מחושב לאחר ניכוי ערכי המקסימום והמינימום. הבדיקה הפינתית משמשת לאיתור חריגות חד צדדיות של תפקודים סנסוריים ומוטוריים. המנגנון מורכב מפינה עם שני לוחות (30 ס"מ × 20 ס"מ × 1 ס"מ) מחוברים בזווית של 30° ופתח קטן בקצהו. העכבר ממוקם באמצע הדרך מול הפינה. כאשר העכבר נכנס עמוק לתוך הפינה, שני הצדדים של הוויבריסה מגורים יחד. לאחר מכן העכבר מסתובב לאחור כדי לפנות אל הקצה הפתוח. בסך הכל מבוצעים 10 ניסויים לכל חיה, והצדדים שנבחרו מצוינים. 50% פניות ימינה ושמאלה צפויות בתנאים פיזיולוגיים, בעוד שהעדפה ימינה צפויה בעכברים עם MCAo ימני. ניסוי נחשב תקף כאשר סיבוב מלא מושגת או כאשר העכבר מסובב את ראשו ≥ 90 מעלות. התוצאות מוצגות כאחוז הפניות ימינה (ipsilateral).
התוצאות המייצגות המראות את אובדן הכוח שהפגינו העכברים 24 שעות לאחר tMCAo שנמדד במבחן חוזק האחיזה מוצגות (איור 3A), כמו גם את העדפתם לפנות לצד האיפסילטרלי לנגע כאשר הם מגורים במבחן הפינה (איור 3B). ביצוע בדיקות התנהגותיות באותו יום של הניתוח עשוי להיות פחות מדויק שכן פרמטרים מסוימים יכולים להשתנות בשל סמיכות ההרדמה ואת התקופה שלאחר הניתוח.
איור 1: ייצוג סכמטי של עץ כלי הדם של הצוואר (צד ימין). (A) התמונה מראה את העורקים הראשיים (עורק התרדמה המשותף-CCA, עורק התרדמה החיצוני-ECA, עורק התרדמה הפנימי-ICA) ואת הענפים השונים (Pterygopalatine artery Pt; עורק עורפי Occ; עורק בלוטת התריס העליון St; מקסילר ועורקים לשוניים מקס/לין). (B) השלבים הראשונים של ההליך הכירורגי, כאשר CCA קשור על ידי תפר, זרימת הדם של ICA נקטעת על ידי מהדק כלי דם, והמונופילמנט מוכנס דרך ECA. (C) כיוון מחדש של ECA כדי לדחוף את המונופילמנט לאזור החסימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות MR מייצגות. (A) תמונות T2-w של אותו עכבר בנקודות זמן שונות לאחר רפרפוזיה מראות את התפתחות הנגע בשלב החריף. האזור המושפע מהאוטם גדל במהירות בשעות הראשונות וחווה שונות מועטה לאחר מכן. (B) אבולוציה של נפח הנגע בשלב החריף לאחר MCAo. כל סרגל מייצג את הממוצע ± SD של אחוז (%) מנפח הנגע. נפח הנגע גדל באופן משמעותי במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הרפרפוזיה (*p = 0.0182; **p = 0.0088; בדיקת ANOVA / Kruskal-Wallis בכיוון אחד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבחנים התנהגותיים לפני (בסיסי) ו-24 שעות אחרי tMCAo (n = 16 עכברים). (A) בדיקת חוזק אחיזה מראה את החוזק המרבי (מרבי) לכל עכבר. (B) מבחן הפינה מראה את אחוז (%) הפניות ימינה. גרפים מציגים קופסה ושפם (ערכי מינימום עד מקסימום) לקבוצה, והנקודות מתאימות לעכברים בודדים (****p < 0.0001; ווילקוקסון השווה זוגות חתומים מבחן דרגה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך tMCAo intraluminal הוא המודל הנפוץ ביותר של איסכמיה מוחית מוקדית עם רפרפוזיה במחקר בסיסי. כיום, עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל זמינותם של זנים מהונדסים גנטית. עם זאת, חיוני להכיר בכך שעכברים מהונדסים גנטית והרקע הגנטי שלהם יכולים להשפיע על כלי הדם במוח. נוכחות של זרימת בטחונות ואנסטומוזות בין טריטוריות עורקים שונות יכולה להשפיע באופן משמעותי על התוצאות של הליכים ניסיוניים11.
בעת ביצוע הליך זה, יש לקחת בחשבון נקודות מכריעות מסוימות. פציעות יכולות להתרחש מחוץ לשטח של MCA, המשפיעים על אזורים כמו ההיפוקמפוס, התלמוס, או ההיפותלמוס, בדרך כלל עקב חסימה של עורק התקשורת האחורי. בנוסף, אחוז קטן של עכברים עשויים שלא להציג אוטם נראה לעין למרות הליך כירורגי מוצלח לכאורה.
מספר משתנים דורשים מעקב במהלך ההליך. התפתחות נגעים במוח תלויה ישירות בחומרת ירידת זרימת הדם המוחית (CBF) ומשך ירידה זו 5,12. כדי לעקוב אחר CBF במהלך התהליך הכירורגי ולהעריך את שינויי הזרימה במהלך חסימה ולאחר רפרפוזיה, מומלץ מאוד להשתמש במערכות כמו LDF (Laser Doppler Flowmetry) או Laser Speckle flowmetry13,14. משך החסימה משפיע גם על היקף הנגע, כאשר חסימות הנמשכות 30 דקות או פחות משפיעות בעיקר על הסטריאטום וחסימות ארוכות יותר מ-45 דקות, ומשפיעות גם על אזורי קליפת המוח המסופקים על-ידי ה-MCA. בהתחשב בגורמי השונות המרובים, חיוני לקבוע קריטריונים להכללה/אי-הכללה לפני תחילת המחקר ולדווח עליהם.
יתר על כן, גורמים אחרים כמו לחץ דם, טמפרטורת הגוף וגלוקוז בדם יכולים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות שבץ. שמירה על עכברים תחת הרדמה במהלך חסימה עשויה להשפיע על פרמטרים כגון לחץ דם, רגישות סינפטית, או דלקת 6,15. אפשרות חלופית היא להעיר את בעלי החיים במהלך החסימה.
הרדמה יכולה להשפיע על לחץ הדם, אשר בתורו משפיע על גודל אוטם15. שמירה על טמפרטורת גוף נאותה חיונית בשל ההשפעות המתועדות היטב של היפותרמיה והיפרתרמיה על איסכמיה מוחית16. בנוסף, היפרגליקמיה הוכחה כמגבירה נזק איסכמי17. יתר על כן, גיל ומין הם גורמים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים וניתוח תוצאות.
במקום להיתפס כחיסרון, יש לראות בריבוי הגורמים יתרון, אך חשוב לרשום משתנים ולקחת בחשבון שונות בעת חישוב גודל המדגם. כשלים בתרגום תוצאות ממחקר ניסיוני לפרקטיקה קלינית ניתן לייחס, בין השאר, לקבוצות ניסוי מוחלשות ולשימוש במודלים של בעלי חיים שאינם מייצגים כראוי מצבים פתולוגיים בבני אדם. בדרך כלל, עכברים צעירים, בריאים, בעיקר זכרים משמשים במודלים ניסיוניים, אבל אלה יכולים להיות מוגברת כדי לחקור עכברים עם תחלואה נלווית כגון יתר לחץ דם, היפרגליקמיה, או hypercholesterolemia, כמו גם קבוצות גיל ומינים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי מענק PID2020-113202RB-I00 במימון Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 ו-"European Regional Development Fund (ERDF). דרך לעשות את אירופה". NCC ו- MAR קיבלו מלגות קדם-דוקטורט (PRE2021-099481 ו- PRE2018-085737, בהתאמה) שמומנו על ידי MCIN/AEI / 10.13039/501100011033 ועל ידי "הקרן החברתית האירופית (ESF) משקיעה בעתיד שלך". אנו מודים לפרנסיסקה רואיז-חאן וללאונרדו מארקס-קיסינוסקי על תמיכתם הטכנית. אנו מכירים בתמיכת מתקן הדמיית MRI של Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). תוכנית Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) של Generalitat de Catalunya תומכת ב- IDIBAPS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
