Summary
यह प्रोटोकॉल मध्य मस्तिष्क धमनी के इंट्राल्यूमिनल रोड़ा के माध्यम से चूहों में क्षणिक फोकल सेरेब्रल इस्किमिया के मॉडल का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, परिणाम मूल्यांकन के उदाहरण चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और व्यवहार परीक्षणों का उपयोग करके दिखाए जाते हैं।
Abstract
स्ट्रोक विश्व स्तर पर मृत्यु या पुरानी विकलांगता का एक प्रमुख कारण है। फिर भी, मौजूदा इष्टतम उपचार इस्केमिक स्ट्रोक के तीव्र चरण के दौरान reperfusion चिकित्सा तक सीमित हैं। स्ट्रोक फिजियोपैथोलॉजी में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए, विवो में स्ट्रोक के कृंतक मॉडल एक मौलिक भूमिका निभाते हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की उपलब्धता ने विशेष रूप से प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल के रूप में चूहों के उपयोग को प्रेरित किया है।
स्ट्रोक के रोगियों में, मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) का रोड़ा एक सामान्य घटना है। नतीजतन, सबसे प्रचलित प्रयोगात्मक मॉडल में एमसीए का इंट्राल्यूमिनल रोड़ा शामिल है, एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक जिसे क्रैनिएक्टोमी की आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रक्रिया बाहरी मन्या धमनी के माध्यम से एक monofilament डालने (ईसीए) और यह आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से आगे बढ़ाने (आईसीए) जब तक यह एमसीए की शाखा बिंदु तक पहुँच जाता शामिल है. एक 45 मिनट धमनी रोड़ा के बाद, monofilament reperfusion की अनुमति देने के लिए हटा दिया है. प्रक्रिया के दौरान, मस्तिष्क रक्त प्रवाह रोड़ा के दौरान कमी और reperfusion पर बाद में वसूली की पुष्टि करने के लिए निगरानी की है. व्यवहार परीक्षण और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) अध्ययन का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल और ऊतक परिणामों का मूल्यांकन किया जाता है।
Introduction
डब्ल्यूएचओ के अनुसार, स्ट्रोक एक विनाशकारी बीमारी है जो दुनिया भर में सालाना लगभग 15 मिलियन लोगों को प्रभावित करती है। लगभग एक-तिहाई रोगी इस स्थिति के शिकार हो जाते हैं, जबकि एक अन्य तिहाई स्थायी विकलांगता का अनुभव करते हैं। स्ट्रोक एक जटिल विकृति है जिसमें विभिन्न प्रकार के सेल शामिल हैं, जैसे तंत्रिका और परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाएं, वाहिका, और प्रणालीगत प्रतिक्रियाएं1. सिस्टम स्तर पर स्ट्रोक द्वारा ट्रिगर प्रतिक्रियाओं के जटिल नेटवर्क को वर्तमान में इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके दोहराया नहीं जा सकता है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक पशु मॉडल रोग के तंत्र में तल्लीन करने और नए उपचारों को विकसित करने और परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं। वर्तमान में, प्रारंभिक ऊतक reperfusion एकमात्र अनुमोदित हस्तक्षेप है, या तो ऊतक-प्रकार प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (टीपीए) या एंडोवास्कुलर थ्रोम्बेक्टोमी1 के साथ थ्रोम्बोलिसिस के माध्यम से।
स्ट्रोक के रोगियों में मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के रोड़े अक्सर होते हैं। नतीजतन, क्षणिक एमसीए रोड़ा (tMCAo) के कृंतक मॉडल शुरू मेंचूहों 2,3,4 में विकसित किए गए थे. आजकल, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जानवरों रहे हैं. इस अध्ययन में, हम चूहों में इंट्राल्यूमिनल टीएमसीएओ के न्यूनतम इनवेसिव मॉडल का वर्णन करते हैं। दृष्टिकोण गर्दन के स्तर पर कैरोटिड धमनी के माध्यम से किया जाता है, बिना क्रैनिएक्टोमी के।
रोड़ा अवधि की अवधि एक महत्वपूर्ण कारक है जो इस्केमिक घाव की सीमा निर्धारित करता है। यहां तक कि 10 मिनट के छोटे occlusions एक स्पष्ट रोधगलन के बिना चयनात्मक neuronal मौत का कारण बन सकता है, जबकि लंबे समय तक रोड़ा, आम तौर पर स्थायी 30 से 60 मिनट, मस्तिष्क रोधगलन के कुछ डिग्री में परिणाम. एमसीए के समीपस्थ और बाहर का शाखाओं है कि प्रांतस्था की आपूर्ति और संपार्श्विक है के विपरीत, lenticulo-striatal धमनियों स्ट्रिएटम को रक्त प्रदान संपार्श्विक5. नतीजतन, tMCAo के बाद प्रांतस्था की तुलना में स्ट्रिएटम में रक्त के प्रवाह में अधिक कमी होती है। इस प्रकार, 30 मिनट या उससे कम के रोड़ा आम तौर पर स्ट्रिएटम को प्रभावित करते हैं, लेकिन प्रांतस्था नहीं, जबकि लंबे समय तक रोड़ा, 45 मिनट के बाद से, अक्सर स्ट्रिएटम और पृष्ठीय प्रांतस्था सहित पूरे एमसीए क्षेत्र में एक इस्केमिक घाव उत्पन्न करते हैं।
चूहों की भलाई सुनिश्चित करने के लिए, हम प्रक्रिया से पहले एनाल्जेसिक का प्रशासन करते हैं और सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं। फिर भी, संज्ञाहरण संभावित माउस के शरीर क्रिया विज्ञान में कृत्रिम परिवर्तन का परिचय और कुछ परिणाम उपायों6 को प्रभावित कर सकते हैं. सर्जिकल हस्तक्षेप, जब अनुभवी कर्मियों द्वारा किया जाता है, आमतौर पर एमसीएओ को प्रेरित करने के लिए लगभग 15 मिनट तक रहता है। इसके बाद, संज्ञाहरण के तहत कुल समय रोड़ा अवधि पर निर्भर करता है। प्रयोगों के लिए जहां संज्ञाहरण को कम करना महत्वपूर्ण है, प्रक्रिया में एक वैकल्पिक कदम रोड़ा अवधि के दौरान संज्ञाहरण बंद करने और एमसीए को बाधित करने वाले फिलामेंट को डालने और वापस लेने के लिए केवल सर्जिकल चरणों तक सीमित करना शामिल है। यह दृष्टिकोण संज्ञाहरण की अवधि को कम करता है और प्रयोगात्मक मॉडल 7,8 पर इसके संभावित कृत्रिम प्रभावों को कम करता है। इसलिए, क्षणिक फोकल इस्किमिया को प्रेरित करने की विधि एमसीए के इंट्राल्यूमिनल रोड़ा द्वारा दो वेरिएंट के साथ प्रस्तुत की जाती है: माउस के साथ पूरे रोड़ा अवधि के दौरान या इस अवधि के दौरान माउस जागने के साथ। किसी भी मामले में, इस्केमिक चूहों पर किए गए हस्तक्षेप के समानांतर एक शम सर्जरी की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, परिणाम मूल्यांकन पर डेटा प्रदान किया जाता है जैसा कि व्यवहार परीक्षण और एमआरआई द्वारा मापा जाता है, पुनरावृत्ति के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर। अंत में, प्रयोगात्मक प्रक्रिया को लागू करते समय विचार करने के लिए मुख्य कारकों पर चर्चा की जाती है।
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Protocol
कैटलन और स्पेनिश कानूनों (रियल डेक्रेटो 53/2013) और यूरोपीय निर्देशों के बाद, बार्सिलोना विश्वविद्यालय की नैतिक समिति (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) और Generalitat de Catalunya के स्थानीय नियामक निकायों की मंजूरी के साथ पशु कार्य आयोजित किया गया था। अध्ययन ARRIVAL दिशानिर्देशों के अनुपालन में रिपोर्ट किए गए हैं। इस प्रक्रिया वयस्क चूहों में प्रदर्शन किया जा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, उम्र के 8 सप्ताह से शुरू, कोई आयु सीमा के साथ. 10-12 सप्ताह की आयु के C57BL/6 चूहों में विकसित शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के उदाहरण यहां प्रदान किए गए हैं। माउस तनाव के आधार पर शारीरिक मतभेदों पर विचार किया जाना चाहिए।
1. पशु तैयारी
- सर्जिकल प्रक्रिया शुरू करने से पहले, सभी आवश्यक सामग्रियों और उपकरणों को इकट्ठा और निष्फल करें। सभी आवश्यक सर्जिकल सामग्री ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) के साथ ऑपरेटिंग टेबल सेट करें।
- ऑक्सीजन और नाइट्रस ऑक्साइड (30%/70%) के मिश्रण में आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन का उपयोग करके जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
- एनाल्जेसिया प्रदान करने और किसी भी दर्द और परेशानी को कम करने के लिए 0.05 मिलीग्राम/किग्रा बीडब्ल्यू की खुराक पर चमड़े के नीचे ब्यूप्रेनोर्फिन ( सामग्री की तालिकादेखें) का प्रशासन करें।
नोट: एनाल्जेसिया अनिवार्य है, लेकिन विभिन्न प्रोटोकॉल स्वीकार किए जाते हैं। एमसीएओ के बाद पहले दिनों के दौरान दर्द और असुविधा के संकेतों को भी नियंत्रित किया जाना चाहिए (चरण 4 देखें)। आवश्यक होने पर सुधारात्मक समाधान लागू करें। - पशु को 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एक संज्ञाहरण प्रेरण बॉक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) में रखें जब तक कि यह गहरी संज्ञाहरण (पंजा पंचर और ओकुलर पलटा में पलटा का नुकसान) की स्थिति तक नहीं पहुंच जाता।
- ऑपरेटिंग टेबल पर माउस स्थिति और isoflurane के स्तर को 1.5% तक कम करें, फेस मास्क द्वारा वितरित. प्रक्रिया के दौरान आंखों की सूखापन से बचने के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
- हीटिंग पैड से जुड़े रेक्टल जांच द्वारा नियंत्रित 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
- एक इलेक्ट्रिक रेजर के साथ गर्दन और सिर (कैल्वरिया) के उदर भाग को शेव करें। फर के मलबे को सावधानीपूर्वक हटा दें और आयोडीन-आधारित कीटाणुनाशक और 70% अल्कोहल के साथ परिपत्र आंदोलनों में त्वचा के क्षेत्रों को तीन बार कीटाणुरहित करें।
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2. लेजर डॉपलर फ्लोमेट्री (एलडीएफ) के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) मूल्यांकन
- कैंची के साथ, सिर की त्वचा पर, बाण के समान सिवनी की दिशा में, कान से आंखों के बीच के क्षेत्र में एक चीरा बनाएं।
- त्वचा को वापस लें और खोपड़ी के दाईं ओर पेरीओस्टेम को हटा दें।
- निर्देशांक (ब्रेग्मा से 2.5 मिमी पार्श्व) ढूंढें और साइनोएक्रिलेट का उपयोग करके डॉपलर धारक ( सामग्री की तालिका देखें) संलग्न करें। गोंद सूखने के बाद, डॉपलर जांच को कनेक्ट करें और सही सिग्नल रीडआउट की जांच करें।
3. क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (tMCAo)
- लापरवाह स्थिति के लिए माउस को चालू करें, और इसे मेडिकल टेप के साथ सर्जिकल टेबल पर ठीक करें।
- गर्दन पर एक मिडलाइन चीरा बनाओ। पार्श्व वापस त्वचा और लार ग्रंथियों retractors का उपयोग कर खींच ( सामग्री की तालिका) मन्या क्षेत्र बेनकाब करने के लिए.
- आम मन्या धमनी (सीसीए), आईसीए, और ईसीए, साथ ही उन से व्युत्पन्न विभिन्न धमनियों (मैक्सिलरी और भाषाई, बेहतर थायरॉयड, पश्चकपाल, और pterygopalatine) (चित्रा 1 ए) की संवहनी शरीर रचना की पहचान करें।
- आसन्न संयोजी ऊतक से मुख्य धमनियों को अलग करें ताकि उन्हें संभाला जा सके।
नोट: नसों को नुकसान न पहुंचाने के लिए विशेष ध्यान रखें, विशेष रूप से वेगस तंत्रिका, जो सीसीए के समानांतर चलती है। - मैक्सिलरी/भाषाई द्विभाजन पर ईसीए के चारों ओर एक 6-0 रेशम सिवनी ( सामग्री की तालिकादेखें) लपेटें। परिसंचरण को स्थायी रूप से बाधित करने के लिए कसकर एक गाँठ सुरक्षित करें।
- एक ही धमनी के चारों ओर एक दूसरे सिवनी पास, पहली गाँठ और सीसीए द्विभाजन के बीच, और इस गाँठ ढीला रखना.
- सीसीए के चारों ओर एक तीसरा धागा रखें और एक पर्ची गाँठ बाँधें जिसे आसानी से खोला जा सके।
नोट: यह एक संवहनी क्लिप के साथ भी किया जा सकता है, लेकिन धागा अधिक आंदोलन और लचीलेपन की अनुमति देता है। इस स्तर पर एलडीएफ सिग्नल में सीबीएफ में पहली कमी का निरीक्षण करना संभव है। - आईसीए से रक्त परिसंचरण को बाधित करने वाली एक संवहनी क्लिप ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
- ईसीए में एक छोटा चीरा बनाओ, उस क्षेत्र के करीब जहां तंग गाँठ स्थित है।
- मोनोफिलामेंट डालें जब तक कि मोटी कोटिंग पूरी तरह से धमनी लुमेन में प्रवेश न कर जाए।
- धमनी के अंदर मोनोफिलामेंट को पकड़ने के लिए दूसरी गाँठ को कस लें और रक्त द्वारा लगाए गए दबाव को इसे बाहर धकेलने से रोकें(चित्र 1बी)।
- आईसीए से संवहनी क्लिप निकालें।
- पहली गाँठ के नीचे ईसीए काटें और आईसीए(चित्रा 1सी)की दिशा में उन्मुख करने के लिए स्टंप को घुमाएं।
- आईसीए के माध्यम से मोनोफिलामेंट को उस बिंदु तक आगे बढ़ाएं जहां एमसीए शाखाएं बाहर हैं।
नोट: रोड़ा एलडीएफ रीडआउट में अचानक रक्त प्रवाह ड्रॉप में परिलक्षित होता है। हम एक सफल रोड़ा पर विचार करते हैं जब सीबीएफ में गिरावट बेसल मूल्य से 70% से अधिक होती है। यदि सीबीएफ माप प्रणाली उपलब्ध नहीं है, तो रोड़ा के बिंदु को अग्रिम के प्रतिरोध द्वारा नोट किया जा सकता है, जो वयस्क चूहों में आमतौर पर सीसीए के द्विभाजन से लगभग 11 मिमी होता है।- संज्ञाहरण रोड़ा अवधि के दौरान जारी है, माउस की निगरानी और 45 मिनट के लिए निरंतर अवलोकन के तहत रखने के लिए.
- यदि माउस रोड़ा अवधि के दौरान जागृत है, तो कई टांके के साथ गर्दन की त्वचा को सीवन करें। एलडीएफ जांच डिस्कनेक्ट किए बिना, तापमान नियंत्रित बॉक्स में माउस जगह, संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति.
नोट: माउस के लिए इस अवधि के दौरान सहज चक्कर व्यवहार प्रदर्शित करना आम बात है, जो सफल रोड़ा का संकेत है। - 40 मिनट के बाद, माउस फिर से एक ही संज्ञाहरण और कीटाणुशोधन प्रक्रियाओं के बाद anesthetize के रूप में अंक 1.4, 1.5 और 1.7 में संकेत दिया है. इसे वापस सर्जिकल टेबल पर रखें, और गर्दन से टांके हटा दें।
- रोड़ा के 45 मिनट के बाद, जगह में monofilament पकड़े गाँठ ढीला. फिलामेंट पर धीरे-धीरे और धीरे से खींचें और जांचें कि ऊतक पुनर्नवीनीकरण होता है।
- फिलामेंट को बाहर निकालें और खून की कमी को रोकने के लिए गाँठ को कस लें।
- सीसीए गाँठ खोलना. सुनिश्चित करें कि कोई धमनी दीवार क्षति नहीं है।
- रिट्रैक्टर निकालें और मांसपेशियों, ग्रंथियों और त्वचा को फिर से स्थिति में लाएं। त्वचा को सीवन करें (6-0) और कीटाणुनाशक लागू करें।
- डॉपलर जांच को डिस्कनेक्ट करें, और धारक को अलग करें। सिर की त्वचा को सीवन और कीटाणुरहित करें।
- संज्ञाहरण से वसूली की अवधि के दौरान, तापमान बनाए रखने के लिए हीटर के साथ प्रदान की एक पिंजरे में माउस छोड़ दें. इसे तब तक निरंतर निगरानी में रखें जब तक कि यह एनेस्थीसिया से पूरी तरह से ठीक न हो जाए। वसूली के बाद, माउस अपने पिंजरे में वापस किया जा सकता है.
नोट: सामाजिक संवर्धन के साथ आवास अत्यधिक अनुशंसित है। हालांकि, आक्रामकता को रोकने के लिए किसी भी शारीरिक जुदाई के बिना एक ही पिंजरे में गैर-संचालित चूहों के साथ संचालित चूहों को कभी न मिलाएं।
4. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल
- समय-समय पर स्थानीय नियमों के अनुसार स्थापित प्रक्रियाओं और नियमों का पालन करते हुए जानवरों की निगरानी करें। सर्जरी के बाद दर्द को कम करने के लिए उचित समय पर एनाल्जेसिक उपचार प्रदान करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, सर्जरी के बाद 6 घंटे और 24 घंटे में हस्तक्षेप (ब्यूप्रेनोर्फिन 0.05 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) की शुरुआत में एक ही एनाल्जेसिक लागू किया गया था। - संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, पर्यवेक्षण मापदंडों का संकेत मिलने पर इच्छामृत्यु करें।
- दैनिक जानवरों के वजन की निगरानी करें। सर्जरी के बाद पहले कुछ दिनों के दौरान जानवरों को नरम भोजन प्रदान करें। इसके अलावा, सर्जरी के तुरंत बाद खारा (200 μL) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा उन्हें हाइड्रेट करें और समय-समय पर उसके बाद अगर यह देखा जाता है कि माउस अपने आप हाइड्रेट नहीं करता है। भोजन और पानी को इस तरह से व्यवस्थित करें जो जानवर के लिए आसानी से सुलभ हो।
- एक बार विवो अध्ययन पूरा हो जाने के बाद, चूहों को एनेस्थेटाइज करें, उन्हें इच्छामृत्यु दें, और आगे हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण (यदि आवश्यक हो) के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को हटा दें।
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Representative Results
tMCAo प्रक्रिया के परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण हैं। विवो न्यूरोइमेजिंग विधियों (एमआरआई) और व्यवहार परीक्षण में यहां उपयोग किया जाता है।
चूहे मस्तिष्क में इस्केमिक घावों का विकास, मुख्य रूप से रोड़ा करने के लिए एमसीए ipsilateral द्वारा आपूर्ति क्षेत्र को प्रभावित, इस तरह के स्ट्रिएटम और dorsolateral प्रांतस्था के रूप में. घाव की सीमा निर्धारित करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें 2,3,5-ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) ऊतक धुंधला, हिस्टोलॉजिकल धुंधला (हेमेटोक्सिलिन / ईोसिन, थियोनीन एसीटेट), और एमआरआई जैसे विवो न्यूरोइमेजिंग तौर-तरीकों में शामिल हैं। एमआरआई को इसकी गैर-आक्रामक प्रकृति और अन्य अध्ययनों के लिए एक ही ऊतक का उपयोग करने की क्षमता के कारण यहां चुना गया है, जो प्रत्येक माउस में घाव का व्यापक मूल्यांकन प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, एमआरआई एक ही जानवरों में बार-बार माप की अनुमति देता है, परिणामों की प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है और अक्सर एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है।
आइसोफ्लुरेन (प्रेरण 5%, रखरखाव 1.5%) के साथ एक ही संज्ञाहरण प्रोटोकॉल एमआरआई सत्रों में इस्तेमाल किया गया था। घाव मात्रा मूल्यांकन के लिए, एक तेजी से टी 2 भारित अनुक्रम (T2w टर्बो दुर्लभ तेजी से स्पिन-गूंज)9 पशु anesthetized है, जो महत्वपूर्ण है जब अलग अलग समय पर एमआरआई अधिग्रहण के साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन एक ही चूहों में प्रदर्शन किया जा रहे हैं कम से कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह प्रक्रिया एक ही जानवरों में समय के साथ घाव में परिवर्तन के मूल्यांकन की अनुमति देती है, और न्यूरोप्रोटेक्शन अध्ययन के लिए या दूसरों के बीच दवा प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए लागू होने पर यह बहुत उपयोगी होता है। छवि प्रयोगों एक 7T क्षैतिज पशु स्कैनर पर आयोजित किए गए. शारीरिक अनुक्रम की तकनीकी विशिष्टताएं (चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के आधार पर भिन्न हो सकती हैं): T2_TurboRARE; 22 कोरोनल सेक्शन; 0.5 मिमी मोटी; प्रतिध्वनि समय (TE) = 33 ms; पुनरावृत्ति समय (TR) = 2336.39 ms. 2 औसत। फ्लिप कोण, 90°; देखने का क्षेत्र (FOV) = 20 मिमी x 20 मिमी, 256 x 256 के मैट्रिक्स आकार के साथ। चित्रा 2 ए एक ही माउस में घाव के विकास के एमआर छवियों का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है, जिसका मूल्यांकन 40 मिनट, 6 एच, 24 एच और 48 एच के बाद किया जाता है। घाव की मात्रा की प्रगति को पूरा होने में घंटों से लेकर लगभग दो दिन लगते हैं। घाव की मात्रा का ठहराव समय के साथ इस विकास को दर्शाता है (चित्र 2बी)।
इस्केमिक अपमान के कारण न्यूरोलॉजिकल हानि का आकलन करने के लिए विभिन्न प्रकार के न्यूरोलॉजिकल तराजू का वर्णन किया गया है। हम न्यूरोस्कोर परीक्षणों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं जिन्हें पिछले पांडुलिपियों में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, ओरसिनी एट अल (2012)10 द्वारा विस्तार से रिपोर्ट किए गए परीक्षण की सिफारिश की जाती है।
व्यवहार परीक्षणों की एक विस्तृत विविधता उपलब्ध है, मुख्य रूप से मोटर और संवेदी कार्य हानि में अंतर का पता लगाने के लिए। इस उद्देश्य के लिए, पकड़ शक्ति परीक्षण और कोने परीक्षण का उपयोग किया गया था। पकड़ शक्ति परीक्षण का उपयोग मोटर फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। फोरलिंब्स की ताकत को एक डिजिटल बल ट्रांसड्यूसर से जुड़े ग्रिप स्ट्रेंथ मीटर से मापा जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें)। माउस दोनों forepaws के साथ एक क्षैतिज पट्टी पर रखती है, जबकि धीरे से यह पूंछ के माध्यम से पीछे की ओर खींच. फोरपॉज़ रिलीज से पहले पकड़ की अधिकतम ताकत नोट की जाती है। प्रति जानवर पांच परीक्षण किए जाते हैं, और मुख्य मूल्य की गणना अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों को छोड़कर की जाती है। कोने के परीक्षण का उपयोग संवेदी और मोटर कार्यों की एकतरफा असामान्यताओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। तंत्र में दो बोर्डों (30 सेमी × 20 सेमी × 1 सेमी) के साथ एक कोने होता है जो 30 डिग्री के कोण से जुड़ा होता है और अंत में एक छोटा सा उद्घाटन होता है। माउस को कोने का सामना करना पड़ आधा रखा गया है। जब माउस कोने में गहराई से प्रवेश करता है, तो वाइब्रिसा के दोनों किनारों को एक साथ उत्तेजित किया जाता है। माउस फिर खुले सिरे का सामना करने के लिए वापस मुड़ता है। प्रति जानवर कुल 10 परीक्षण किए जाते हैं, और चुने हुए पक्षों को नोट किया जाता है। 50% बाएं और दाएं शारीरिक परिस्थितियों में बदल जाता है, जबकि सही एमसीएओ के साथ चूहों में एक सही वरीयता की उम्मीद है। एक परीक्षण वैध माना जाता है जब एक पूर्ण मोड़ प्राप्त होता है या जब माउस अपना सिर 90º ≥ घुमाता है। परिणाम सही (ipsilateral) मोड़ के प्रतिशत के रूप में दिखाए जाते हैं।
पकड़ शक्ति परीक्षण द्वारा मापा tMCAo के बाद चूहों 24h द्वारा प्रदर्शित ताकत के नुकसान को दिखाने वाले प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं(चित्रा 3ए), साथ ही कोने परीक्षण(चित्रा 3बी)में उत्तेजित होने पर घाव के पक्ष में मुड़ने के लिए उनकी प्राथमिकता। सर्जरी के एक ही दिन व्यवहार परीक्षण करना कम सटीक हो सकता है क्योंकि संज्ञाहरण की निकटता और पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि के कारण कुछ मापदंडों को बदला जा सकता है।
चित्रा 1: गर्दन (दाईं ओर) के संवहनी पेड़ का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) छवि मुख्य धमनियों (आम मन्या धमनी-सीसीए, बाहरी मन्या धमनी-ईसीए, आंतरिक मन्या धमनी-आईसीए) और विभिन्न शाखाओं (Pterygopalatine धमनी Pt; ओसीसीपिटल धमनी Occ; सुपीरियर थायरॉयड धमनी सेंट; मैक्सिलर और भाषाई धमनियां मैक्स / (बी) सर्जिकल प्रक्रिया के पहले चरण, सीवन द्वारा बंधे सीसीए के साथ, आईसीए परिसंचरण एक संवहनी क्लैंप द्वारा बाधित होता है, और मोनोफिलामेंट ईसीए के माध्यम से पेश किया जाता है। (सी) मोनोफिलामेंट को रोड़ा क्षेत्र में धकेलने के लिए ईसीए का पुन: अभिविन्यास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रतिनिधि एमआर छवियों. (ए)reperfusion के बाद अलग अलग समय अंक पर एक ही माउस के टी 2 डब्ल्यू छवियों तीव्र चरण में घाव के विकास से पता चलता है. रोधगलितांश से प्रभावित क्षेत्र पहले घंटों में तेजी से बढ़ता है और उसके बाद थोड़ा बदलाव का अनुभव करता है। (बी) एमसीएओ के बाद तीव्र चरण में घाव की मात्रा का विकास। प्रत्येक बार घाव की मात्रा के प्रतिशत (%) के एसडी ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। reperfusion के बाद पहले 24 घंटे के दौरान घाव की मात्रा काफी बढ़ जाती है (* पी = 0.0182; ** पी = 0.0088; 1-रास्ता एनोवा / क्रुस्कल-वालिस परीक्षण)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: व्यवहार परीक्षण से पहले (बेसल) और 24 घंटे tMCAo (एन = 16 चूहों) के बाद। (ए) पकड़ शक्ति परीक्षण प्रति माउस अधिकतम (अधिकतम) ताकत दिखाता है। (बी) कॉर्नर परीक्षण दाएं मोड़ के प्रतिशत (%) को दर्शाता है। रेखांकन प्रति समूह बॉक्स और मूंछ (न्यूनतम से अधिकतम मान) दिखाते हैं, और अंक व्यक्तिगत चूहों (**** पी < 0.0001; विलकॉक्सन मिलान-जोड़े ने रैंक टेस्ट पर हस्ताक्षर किए)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इंट्राल्यूमिनल टीएमकेओ प्रक्रिया बुनियादी अनुसंधान में पुनरावृत्ति के साथ फोकल मस्तिष्क इस्किमिया का सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। वर्तमान में, आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की उपलब्धता के कारण चूहों को पसंदीदा पशु मॉडल हैं। हालांकि, यह स्वीकार करना आवश्यक है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और उनकी आनुवंशिक पृष्ठभूमि मस्तिष्क संवहनीकरण को प्रभावित कर सकती है। विभिन्न धमनी क्षेत्रों के बीच संपार्श्विक परिसंचरण और anastomoses की उपस्थिति काफी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं11 के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं.
इस प्रक्रिया का संचालन करते समय, कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। एमसीए के क्षेत्र के बाहर चोटें हो सकती हैं, हिप्पोकैम्पस, थैलेमस या हाइपोथैलेमस जैसे क्षेत्रों को प्रभावित करती हैं, आमतौर पर पीछे की संचार धमनी के रोड़ा के कारण। इसके अतिरिक्त, चूहों का एक छोटा प्रतिशत प्रतीत होता है कि सफल शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के बावजूद स्पष्ट रोधगलन प्रदर्शित नहीं कर सकता है।
कई चर प्रक्रिया के दौरान निगरानी की आवश्यकता होती है। मस्तिष्क के घावों का विकास सीधे मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) ड्रॉप की गंभीरता औरइस कमी 5,12 की अवधि पर निर्भर करता है। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान सीबीएफ को ट्रैक करने और रोड़ा के दौरान और पुनरावृत्ति के बाद प्रवाह परिवर्तनों का आकलन करने के लिए, एलडीएफ (लेजर डॉपलर फ्लोमेट्री) या लेजर स्पेकल फ्लोमेट्री13,14 जैसी प्रणालियों का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। रोड़ा की अवधि भी घाव की सीमा को प्रभावित करती है, 30 मिनट या उससे कम समय तक चलने वाले रोड़े मुख्य रूप से स्ट्रिएटम को प्रभावित करते हैं और 45 मिनट से अधिक समय तक रोड़ा करते हैं, एमसीए द्वारा आपूर्ति किए गए प्रांतस्था क्षेत्रों को भी प्रभावित करते हैं। कई परिवर्तनशीलता कारकों को ध्यान में रखते हुए, अध्ययन शुरू होने से पहले समावेश/बहिष्करण मानदंड स्थापित करना और उनकी रिपोर्ट करना महत्वपूर्ण है।
इसके अलावा, रक्तचाप, शरीर के तापमान और रक्त शर्करा जैसे अन्य कारक स्ट्रोक के परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। रोड़ा के दौरान संज्ञाहरण के तहत चूहों को बनाए रखने इस तरह के रक्तचाप के रूप में मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं, synaptic उत्तेजना, यासूजन 6,15. एक वैकल्पिक विकल्प रोड़ा के दौरान जानवरों को जगाना है।
संज्ञाहरण रक्तचाप को प्रभावित कर सकता है, जो बदले में रोधगलितांश15 के आकार को प्रभावित करता है। उचित शरीर के तापमान को बनाए रखने मस्तिष्क ischemia16 पर hypothermia और अतिताप की अच्छी तरह से प्रलेखित प्रभाव के कारण आवश्यक है. इसके साथ ही, hyperglycemia इस्कीमिक क्षति17 को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, उम्र और लिंग ऐसे कारक हैं जिन पर प्रयोगों को डिजाइन करते समय और परिणामों का विश्लेषण करते समय विचार किया जाना चाहिए।
एक खामी के रूप में देखा जाने के बजाय, कारकों की बहुलता को एक लाभ के रूप में देखा जाना चाहिए, लेकिन नमूना आकार की गणना करते समय चर रिकॉर्ड करना और परिवर्तनशीलता पर विचार करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक अनुसंधान से नैदानिक अभ्यास के परिणामों का अनुवाद करने में विफलताओं को आंशिक रूप से, कम-संचालित प्रयोगात्मक समूहों और पशु मॉडल के उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो मनुष्यों में रोग संबंधी स्थितियों का पर्याप्त रूप से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। आमतौर पर, युवा, स्वस्थ, ज्यादातर पुरुष चूहों का उपयोग प्रयोगात्मक मॉडल में किया जाता है, लेकिन इन्हें उच्च रक्तचाप, हाइपरग्लाइसेमिया या हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिया के साथ-साथ विभिन्न आयु समूहों और लिंगों जैसे सहरुग्णताओं के साथ चूहों की जांच करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 और "यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ERDF) द्वारा वित्त पोषित अनुदान PID2020-113202RB-I00 द्वारा समर्थित अध्ययन। यूरोप बनाने का एक तरीका"। NCC और MAR के पास MCIN/AEI/10.13039/501100011033 और "यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF) द्वारा वित्त पोषित प्रीडॉक्टोरल फेलोशिप (क्रमशः PRE2021-099481 और PRE2018-085737, क्रमशः) और "यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF) आपके भविष्य में निवेश" द्वारा वित्त पोषित थी। हम फ्रांसिस्का रुइज़-जेन और लियोनार्डो मर्केज़-किसिनोस्की को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इंस्टीट्यूट डी'इन्वेस्टिगेशन बायोमेडिक्स अगस्त पाई आई सुनीर (IDIBAPS) की एमआरआई इमेजिंग सुविधा के समर्थन को स्वीकार करते हैं। Generalitat de Catalunya का Centre de Recerca de Catalunya (CERCA) कार्यक्रम IDIBAPS का समर्थन करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
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