Summary
여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.
Abstract
종양 항원을 표적으로 하는 단클론 항체 기반 면역 요법은 현재 암 치료의 중심입니다. 항체의 임상적으로 관련된 작용 기전 중 하나는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)으로, 항체가 암세포에 결합하고 면역 체계의 세포 구성 요소(예: 자연 살해(NK) 세포)와 결합하여 종양 세포를 죽입니다. 이러한 치료법의 효과는 암세포의 민감도 또는 면역 세포의 효능을 증가시키는 보조 화합물을 식별함으로써 향상될 수 있습니다. 또한, 이전 질환 또는 암 관련 증상에 대해 병용투여한 암 환자에서 발견되지 않은 약물 상호작용이 항체 치료의 성공을 결정할 수 있습니다. 따라서 이러한 원치 않는 약물 상호 작용을 제거해야 합니다. 이러한 목표를 염두에 두고 암 ADCC 모델을 만들었으며 ADCC 조절 약물을 찾기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 암세포 스페로이드와 같은 3D 모델은 항암 치료에 대한 종양의 in vivo 반응을 예측하는 데 있어 2D 배양보다 우수하기 때문에 EGFP 발현 HER2+ JIMT-1 유방암 세포와 NK92의 스페로이드 공동 배양. CD16 세포주를 설정하고 HER2 양성 유방암에 대해 임상적으로 승인된 단일클론 항체인 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 유도했습니다. JIMT-1 스페로이드는 세포 발수성 U-바닥 96웰 플레이트에서 형성되도록 허용되었습니다. 3일째에는 NK세포와 트라스투주맙을 추가하였다. 그런 다음 스페로이드를 Annexin V-Alexa 647로 염색하여 자가사멸 세포 사멸을 측정하고, 자동 현미경으로 스페로이드의 주변 영역에서 정량화했습니다. ADCC 조절 분자를 식별하기 위한 분석의 적용 가능성은 전이성 암에 대해 FDA가 승인한 수용체 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib이 ADCC를 거의 완전히 폐지한다는 것을 보여줌으로써 입증되었습니다. 스페로이드 생성과 이미지 획득 및 분석 파이프라인은 암세포 스페로이드의 ADCC 조절 화합물에 대한 고처리량 스크리닝과 호환됩니다.
Introduction
다세포 종양 스페로이드(MCTS)는 부착 세포가 응집하는 경향으로 인해 형성되는 널리 사용되는 3차원(3D) 모델로, 암세포 생물학에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 액체 기반 및 스캐폴드 기반 3D 배양과 같은 다양한 기술을 통해 광범위한 세포 유형에서 생성할 수 있습니다1. 단층 2D 모델에 비해 가장 큰 장점은 종양 세포의 생물학적 거동, 특히 치료 탈출 및 약물 내성으로 이어지는 메커니즘을 모방하여 생체 내 종양의 주요 특징, 즉 구조적 조직 및 저산소증을 요약한다는 것입니다2. 따라서 MCTS는 독성 및 약물 감수성의 예측 가능성을 향상시킬 수 있기 때문에 3D에서 암을 연구하는 데 널리 사용되며 다양한 유형의 암에 대한 효과적인 약물 개발을 향상시킬 수 있습니다3.
모든 질병을 연구하려면 관련성 있고 편리한 모델이 매우 필요합니다. 암 면역학 연구를 위한 모델을 설정하는 것은 면역 체계가 여러 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에 어렵습니다. 각 세포 유형에는 여러 하위 유형과 광범위한 활성화 상태가 있습니다. 이러한 다양한 면역 세포 유형은 암세포 및 기타 종양 구성 요소와 상호 작용하여 궁극적으로 질병의 결과에 영향을 미칩니다. 2D in vitro 세포 배양 방법은 번역성이 부족하고 시스템 수준(예: 조직)에서 약물의 작용을 예측할 수 없기 때문에 이러한 복잡한 세포 상호 작용을 재현하지 못합니다4,5. 더욱이 마우스 모델은 인간과 쥐의 면역 체계 사이의 근본적인 차이로 인해 심각한 한계를 가지고 있습니다. 따라서 3D 배양 시스템은 현재 사용 가능한 모델의 격차를 메우고 대체 방법을 제공하고 암 면역학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다6. 구체적으로, 스페로이드 모델은 면역요법을 시험하는 데 사용될 수 있는데, 이는 주로 스페로이드 표적에 대한 면역세포 침윤 및 항종양 효과를 향상시키기 위한 약물 스크리닝 및 치료용 항체의 효율성을 평가하기 위한 것이다7. 또한, 기질 세포(예: 림프구, 대식세포, 섬유아세포)와 암세포 간의 상호작용을 연구하고 새로운 항암 전략을 개발하기 위한 다양한 대사 및 증식 상태의 세포로 구성된 MCTS의 잠재력은 충분히 입증되었습니다8. 따라서 종양 미세환경의 병태생리학을 고려하여 약물 테스트 프로세스를 강화하기 위해 예측 가능하고 정확한 플랫폼을 확증할 필요가 있습니다.
유방암(BC)은 전 세계적으로 여성에게 가장 많이 진단되는 암입니다. 이 이종 질환의 임상적 분류는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 단백질/종양유전자의 과발현 또는 증폭과 함께 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR) 수용체(총칭하여 호르몬 수용체, HR라고 함)와 같은 막관통 수용체의 존재를 기반으로 합니다. 이러한 수용체의 면역조직화학적 발현에 기초하여 일반적으로 루미날 A(HR+/HER2-), 루미날 B(HR+/HER2+), HER2 양성(HR-/HER2+) 및 삼중음성 유방암(HR-/HER2-)의 4가지 아형이 인식됩니다. HER2+ 그룹은 BC 증례의 10-15%를 차지하며, ER 및 PR이 없는 상태에서 HER2 발현이 높고, 내강 종양에 비해 예후가 나쁘며, HER2/neu 단백질에 대한 특정 약물이 필요한 것이 특징이다9.
BC 발달은 다단계 과정이며, 질병의 성공적인 치료를 위해서는 조기 진단이 필수적이다10. 그러나 최근 등장한 맞춤형 BC 치료 옵션(예: 내분비 및 항-HER2 항체 요법)에도 불구하고 BC는 계속해서 종양학자들에게 도전 과제를 안겨주고 있습니다. 수술, 화학요법 및 방사선 요법과 마찬가지로 이러한 맞춤형 치료법도 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며 환자는 이러한 약제에 대한 내성을 갖게 될 수 있으므로 최상의 전략을 결정하는 것이 장기적으로 어려운 과제가 될 수 있다11,12. 따라서, 종양과 미세환경 사이의 상호작용에 대한 이해의 향상이 필수적이며, 다양한 BC 아형의 특이성을 고려한 새로운 치료법의 개발을 위한 새로운 방향을 제공할 것으로 기대된다13. 항체 약물 접합체, 입양 T 세포 치료제, 백신 및 새로운 HER2 지향 단클론 항체(mAb)와 같은 새로운 면역 요법이 HER2 발현 종양이 있는 광범위한 환자 집단에서 연구되고 있다14.
예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2+ BC에 대한 효율적인 치료 방식을 나타냅니다. 작용 방식의 일환으로 트라스투주맙은 단편 결정화 가능한 감마 수용체(FcγR) 의존성 활성을 매개합니다. FcγR은 Fc 분절에 대한 친화력과 이들이 개시하는 면역 반응으로 구별됩니다. 자연살해(NK) 세포에서 FcγRIIIa(CD16A)를 활성화하는 것은 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개하는 데 중요하며, 대식세포에서 FcγRIIa(CD32A) 및 FcγRIIIa를 유발하면 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 유도합니다15. 동물 모델에 대한 연구에 따르면 FcγRI(CD64) 및 FcγRIII(CD16) 수용체가 결핍된 마우스는 종양 특이적 항원에 대한 보호 면역 반응을 시작할 수 없었으며, 이는 ADCC가 mAb Trastuzumab16의 주요 작용 기전일 가능성이 있음을 보여주었습니다.
NK 세포는 ADCC에 의한 암세포 사멸을 위해 종양 세포 결합 Abs에 의존하기 때문에 Fc 수용체의 발현은 Trastuzumab17 의 효율적인 치료에 매우 중요합니다(그림 1). 더욱이, 이들의 작용은 활성화 및 억제 수용체, 예를 들어, 킬러 세포 면역글로불린 유사(KIR) 수용체(18)의 자극에 의해 효율적으로 균형을 이룬다.
그림 1. 항종양 반응의 맥락에서 ADCC의 메커니즘. 자연살해(NK) 세포의 Fcγ 수용체는 이전에 암세포의 표면 항원에 결합했던 항체의 Fc 영역을 인식합니다. 이 면역학적 시냅스는 NK 세포의 탈과립화로 이어지고, NK 세포는 그랜자임(granzymes)과 퍼포린(perforin)과 같은 세포독성 매개체를 방출합니다. 이 분자는 세포막의 기공 형성에 기여하고 세포 사멸 경로를 활성화하여 표적 세포의 프로그램된 세포 사멸을 유발합니다( Biorender.com 로 생성된 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HER2+ BC에 대한 면역 요법 개발은 진화하는 분야입니다. 이 경우 면역 체계의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 고려해야 합니다. 또한, 이전 간행물에서는 시너지 효과를 내는 조합을 확인하기 위해 모든 유형의 전통적 치료법, 면역 요법 또는 세포 치료법을 포함하는 병용 요법을 광범위하게 테스트했다19.
HER2+ BC의 여러 3D 모델은 이전에 신약 개발에 사용되었습니다. 예를 들어, Balalaeva 등은 HER2를 과발현하는 SKBR-3 스페로이드를 사용하여 HER2 표적 면역독소 4D5scFv-PE40의 세포 독성을 평가했습니다20. 또 다른 연구에서는 트라스투주맙 및 내분비제에 대한 반응으로 세포 성장을 측정하기 위해 3D Matrigel 기반 HER2+ BC 배양 시스템을 구축했습니다21. 이러한 연구는 치료 반응을 임상적으로 개선하기 위한 효과적인 전략을 나타내는 데 있어 암세포를 과발현하는 HER2의 종양 스페로이드 모델의 중요성을 강조합니다22.
우리 그룹은 이전에 2D 배양 분석에서 JIMT-1 HER2+ BC 세포에서 트라스투주맙 의존성 ADCC의 억제제로 다중표적 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib을 확인했습니다. 이 연구는 수니티닙이 자가포식을 유도하고 NK 세포 사멸 기능을 손상시켜 HER2 발현을 하향 조절하고 JIMT-1 세포의 표면 부착을 향상시킨다는 것을 밝혔다17.
여기에서 우리는 고처리량 스크리닝 응용 분야에 사용할 새로운 3D 스페로이드 ADCC 모델(NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP 암세포)을 확립했으며, 위에서 언급한 결과를 검증하기 위해 Sunitinib을 모델 화합물로 사용했습니다. 먼저, JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고,이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. ADCC는 트라스투주맙과 함께 NK 세포에 의해 유도되었으며, 스페로이드는 시험 화합물의 유무에 관계없이 24시간 동안 배양된 상태로 유지되었습니다(그림 2). ADCC의 정량화는 High-Content Analysis 시스템을 사용한 자가사멸 암세포 사멸(Annexin V 염색) 검출을 기반으로 합니다.
그림 2. 3D 스페로이드 공동 배양 시스템의 ADCC. 당사의 실험 설정은 2D 모델에 비해 생체 내 미세환경을 더 정확하게 모델링할 수 있는 3D 스페로이드 시스템을 기반으로 합니다. JIMT-1 EGFP 유방암 세포를 오목한 세포 퇴치제 바닥에 파종하여 스페로이드라고 하는 둥근 모양의 세포 클러스터를 형성했습니다. 그런 다음 NK92를 추가하여 ADCC를 시작했습니다. CD16 자연살해세포(E:T 비율 = 20:1) 및 항-HER2 단클론 항체인 트라스투주맙. 실험 모델은 ADCC 변형 테스트 화합물( Biorender.com 로 생성된 이미지)의 식별에 효율적이고 쉽게 적용할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 이러한 방식으로 데이터를 수집할 수 있으며 암 약물 발견에서 high-content 스크리닝에 사용하기 위해 통계적으로 견고하다는 것을 입증했습니다. 중요한 것은 이 모델을 사용하면 더 큰 화합물 세트에 대한 확장된 검증이 가능하며 관심 있는 여러 분석에 적용할 수 있다는 것입니다.
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Protocol
1. JIMT-1-강화 형광 단백질(EGFP) 스페로이드 모델 설정
- U자형 세포 발수성 바닥을 형성하려면 96웰 플레이트를 0.5% 아가로스-PBS 용액(30μL/웰)으로 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 배양합니다.
- JIMT-1-EGFP 세포를 2mL의 멸균 PBS로 2회 세척합니다(JIMT1-EGFP 세포주의 생성은 이전 간행물17에서 보고됨). 세포 배양을 위해 T25 조직 배양 플라스크 및 JIMT-1 배지(20% 소 태아 혈청(FBS), 0.3U/mL 인슐린(100IU/mL, Humulin R) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 배지)를 사용합니다.
- 플라스크에 트립신-EDTA 2mL를 넣고CO2 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.
- 플라스크를 탭하여 배양 시간 후에 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다.
- 2mL의 JIMT-1 배지를 사용하여 분해를 중지하고 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다.
- 0.4% 트리판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 Bürker 챔버에서 세포를 계수하고 세포 수를 20,000세포/mL로 조정합니다.
- 셀 현탁액(2000 cells/well)의 100μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다(1.1에 표시된 대로 0.5% 아가로스-PBS 용액으로 사전 코팅됨).
- CO3 인큐베이터에서 37°C에서 2일 동안 배양 기간 동안 세포가 뭉치도록 합니다.
- 도립 현미경으로 스페로이드의 크기와 모양을 정기적으로 확인하십시오.
2. HCS 플레이트의 코팅
참고: JIMT-1-EGFP 스페로이드가 플레이트의 유리 표면에 부착되는 것을 방지하려면 HCS(High-Content Screening) 플레이트를 코팅하는 것이 중요합니다(그렇지 않으면 High-Content 분석이 불가능함).
- 스페로이드 유도 후 3일째에 96웰 고함량 스크리닝 플레이트에 Pluronic-F127(DMSO에서 0.5%, 50μL/웰)을 코팅하고 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양합니다.
- 코팅 용액을 흡인하고 DMEM/F-12-무혈청 배지(100μL/well)로 웰을 두 번 세척합니다.
3. HCS 플레이트로 스페로이드 이송
- 1mL 피펫을 사용하여 스페로이드를 유리 바닥 96웰 HCS 플레이트에 세 번 옮깁니다.
4. JIMT-1 EGFP 스페로이드를 시험 화합물로 전처리
- 10μL/웰을 피펫팅하여 테스트 화합물(예: 40μM 농도로 DMSO에 희석된 Sunitinib)을 추가하고 대조군(CTL) 웰에 10μL의 신선한 JIMT-1 배지를 추가합니다.
- 플레이트를 37°C의 CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
5. effector cell을 추가하여 ADCC 유도
참고: CD16.176V.NK92 세포(이하 NK 세포라고 함)는 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-피루브산, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 100IU/mL의 IL-2가 보충된 α-MEM에서 배양되었습니다.
- 플라스크의 NK 세포를 15mL 튜브에 모읍니다. 트리판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 세포를 계수하고 세포 밀도를 20:1 이펙터 대 표적(E:T) 비율(40,000 NK 세포/웰)로 조정합니다.
- 10μM Cell Tracker Blue(CTB, α-MEM NK 배지 1mL에 1μL)로 NK 세포를 염색하고 37°C의 CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
- NK 세포를 실온에서 150 x g 에서 3분 동안 2회 원심분리하여 1mL의 α-MEM 배지로 과잉 염료를 세척합니다.
- NK 세포 펠릿을 1mL의 신선한 JIMT-1 배지에 재현탁시킵니다.
- JIMT-1 배지에서 CTB 염색 NK 세포 55μL/웰 및 10μg/mL Ab 55μL/웰을 피펫팅하여 항-HER2 항체(Ab)(트라스투주맙, 멸균 증류 H2O에 용해됨)와 함께 염색된 NK 세포를 표적 JIMT-1 스페로이드에 추가합니다(ADCC에 추가된 처리의 총 부피는 110μL/웰이고 최종 수니티닙 농도는 20μM).
참고: Ab 농도 및 E:T 비율의 선택을 위해 이전 간행물17에 의존했습니다. 스페로이드에서 ADCC를 유도하는 데 가장 효과적인 것을 평가하기 위해 Trastuzumab의 다양한 E:T 비율과 농도로 예비 실험을 수행했습니다(보충 그림 S1). - 110μL/웰의 신선한 JIMT-1 배지를 대조군(CTL) 웰에 추가합니다.
- 37°C의 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
참고: NK92 세포는 비특이적 세포독성 기능을 발휘하는 것으로 알려져 있으므로 대조군의 경우 JIMT-1 세포를 NK 세포 단독으로 또는 동형 대조군 또는 F(ab')2 Ab와 함께 공동 배양합니다. 여기서, F(ab')2-트라스투주맙(TR-F(ab')2)을 음성 CTL로 사용하였다. TR-F(ab')2 단편은 Tóth et al.19 에 의해 보고된 바와 같이 제조되었으며, 5.5에 기술된 바와 같이 NK 세포와 함께 Trastuzumab과 동일한 부피로 첨가되었습니다. 농도는 Trastuzumab23으로 등몰 농도에 해당하는 6.6μg/mL로 조정되었습니다.
6. 스페로이드의 Annexin V-647 염색
- 자가사멸 세포 사멸을 측정하려면 50μL/웰을 피펫팅하여 JIMT-1 배지(1:100)에서 1시간 동안 Annexin V-Alexa Fluor 647 conjugate로 스페로이드를 염색합니다.
7. 이미징
참고: 플레이트는 NK effector cell을 target cell에 추가한 후 24시간 후에 촬영됩니다. 이미징에는 High-Content Analyzer와 이미지 분석 소프트웨어가 사용됩니다.
- 플레이트 유형(Plate Type) 옵션을 사용하여 플레이트 목록에서 마이크로플레이트 유형을 선택합니다. 96웰 HCS(High-Content Screening) 플레이트를 사용하십시오.
- 각각 Autofocus 및 Objective 옵션을 사용하여 0.3개의 개구수(NA)를 가진 10x 대물렌즈가 있는 플레이트에서 분석이 수행되므로 Two Peak 자동 초점을 선택합니다. 옵션 모드(Opt. Mode) 옵션을 사용하여 공초점 모드를 선택하고 비닝(Binning) 옵션을 사용하여 비닝 2(Binning 2)를 적용합니다.
- 스페로이드를 이미징하려면 Channel Selection 옵션을 사용하여 적절한 채널을 선택합니다. EGFP transduced JIMT-1 세포를 검출하려면 EGFP(통합 시간 200ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 2.0μm, 예: 488nm em: 500-550nm)를 선택하고 자가사멸 세포를 검출하려면 Alexa 647(통합 시간 100ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 10.0μm, 예: 640nm em: 650-760nm)을 선택합니다. 스페로이드 내의 NK 세포를 시각화하려면 DAPI(통합 시간 100ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 2.0μm, 예: 405nm em: 435-480nm) 채널을 선택합니다.
- Layout Selection 옵션에서 스페로이드의 세포가 현미경의 다른 초점면에 있는 경향이 있으므로 Z-stack을 선택합니다. 10개의 평면(거리 10μm)은 전체 스페로이드 영역을 덮기에 충분합니다. 첫 번째 평면과 마지막 평면의 값을 각각 0μm와 90μm로 설정합니다.
알림: 측정을 시작하기 전에amp올바른 설정을 확인하기 위해 스냅샷 기능으로 이미지를 촬영할 수 있습니다. - Define Layout 옵션을 사용하여 이미징을 위한 웰과 필드의 개수를 설정합니다.
8. 고함량 분석(HCA)
알림: Harmony 소프트웨어로 이미지를 분석하거나 선호하는 타사 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 이미지를 내보냅니다. ADCC 효율 분석을 위해 Annexin V 647의 형광 강도를 측정합니다. ADCC에 의해 사멸된 표적 세포는 스페로이드의 주변 영역에 나타납니다. 따라서 Annexin V 양성 세포는 이 스페로이드 "고리"에서 측정됩니다. 이 방법을 검증하기 위해 어떤 것이 가장 신뢰할 수 있고 최상의 결과를 산출하는지 평가하기 위해 다양한 매개변수로 분석을 수행했습니다(보충 그림 S2). 이미지 분석 프로세스를 단계별로 시연하기 위해 ADCC 웰이 비디오에 나와 있습니다.
- Find Texture Regions 옵션을 사용하여 JIMT-1 세포의 EGFP 형광으로 스페로이드를 식별하고 크기별로 필터링합니다(> 25,000μm2).
- Select Population 옵션으로 경계 객체를 제거합니다.
- Annexin V 양성(자가사멸) 세포는 스페로이드의 주변부에 나타나기 때문에 자가사멸 세포 사멸을 결정하기 위해 영역 선택 옵션(외부 테두리 -90%)으로 선택한 이 자가사멸 '고리'에서 Annexin 강도를 측정합니다.
- Annexin V 강도 값을 평균 강도로 표현합니다.
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Representative Results
JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고, 이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. 수니티닙은 이전에 ADCC17의 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 시험 화합물로 사용되었습니다. 스페로이드는 72시간 동안 뭉치도록 허용되었습니다. 3일째에, 10μg/mL의 트라스투주맙(또는 등몰 6.6μg/mL TR-F(ab')219) 및 NK 세포(20:1)를 20μM Sunitinib(1시간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 스페로이드에 첨가하여 총 24시간 동안 JIMT-1 단독으로 및 NK 세포와 함께 배양한 JIMT-1(20:1)을 CTL로 사용했습니다. 스페로이드를 Annexin V 647로 1시간 동안 염색하여 자가사멸 세포 사멸을 검출하고 그런 다음 High-Content Analyzer로 이미지화했습니다.
Annexin V 염색에서 알 수 있듯이 JIMT-1 세포에 Trastuzumab과 함께 NK 세포를 추가하면 종양 스페로이드에서 세포 사멸이 발생했습니다. Annexin 양성(apoptotic) 세포는 그림 3A에서 볼 수 있듯이 스페로이드의 주변 영역에서 나타났습니다. 반면, NK세포를 단독으로 추가해도 종양세포 사멸이 일어나지 않았습니다. 트라스투주맙의 ADCC 모집 능력과 직접적인 생물학적 효과를 구별하기 위해, 트라스투주맙의 음성 대조군으로 기능적 FcR 결합 능력이 결여된 TR-F(ab')2 를 사용하였다. 이 모델에서는 TR-F(ab')2 가 효과가 없는 것으로 나타났기 때문에(그림 3B), 이 효과는 ADCC를 통해 매개될 가능성이 높습니다. 또한, 수니티닙을 사용한 전처리는 스페로이드에서 Annexin V 염색을 감소시켜 Sunitinib 유도 ADCC 내성을 확인했으며 NK 세포 및 Trastuzumab과 함께 배양한 JIMT-1 스페로이드에서 세포사멸 세포 사멸을 예방하는 것으로 나타났습니다.
그림 3. 3D 스페로이드 모델에서 ADCC 이펙터 화합물 검출. 종양 스페로이드는 JIMT-1-EGFP 세포로 생성되었습니다. 3일의 배양 시간 후, 스페로이드를 HCS 플레이트로 옮겼고, 세포 부착을 방지하기 위해 이전에 Pluronic F-127로 코팅했습니다. 다음날 10μg/mL 트라스투주맙(TR)(또는 등몰 6.6μg/mL TR-F(ab')2 를 음성 CTL로 표시) 및 NK92. CD16 세포(Cell Tracker Blue로 사전 염색됨)를 20μM Sunitinib(SUN)이 없거나 존재하는 상태에서 웰(E:T 비율 20:1)에 첨가했습니다. JIMT-1 스페로이드 단독과 NK 세포와 함께 배양한 JIMT-1 스페로이드(20:1)를 CTL로 사용했습니다. (A) 24시간의 배양 시간 후, Annexin V 647(빨간색)을 사용하여 자가사멸 세포를 시각화하기 위해 1시간 동안 스페로이드를 염색했습니다. (B) 3개의 스페로이드/조건의 이미지를 촬영하여 스페로이드의 주변 영역(고리 영역)에서 Annexin V 647의 형광 강도를 분석했습니다. 히스토그램은 4개의 독립적인 실험(평균±SEM)을 보여줍니다. 데이터는 Kruskal-Wallis 검정 후 Dunn의 사후 검정으로 분석되었습니다(*p < 0.05, #p < 0.05, ns: 유의하지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 데이터는 수니티닙이 ADCC를 억제한다는 것을 확인시켜준다. ADCC 강화 화합물도 유사한 방식으로 확인될 것으로 예상됩니다. 요약하면, 당사의 HCS 분석은 ADCC에 영향을 미치는 화합물의 식별에 적합할 수 있습니다.
보충 그림 S1. E:T 비율과 트라스투주맙 농도의 최적화. JIMT-1-EGFP 세포를 사용하여 스페로이드를 생성하였다. 3일째에 스페로이드를 HCS 플레이트로 옮기고 NK 세포를 10, 20 및 50μg/mL 트라스투주맙(TR)과 함께 다양한 E:T 비율(20:1, 40:1 및 60:1)로 추가하여 스페로이드의 세포 사멸을 유도할 수 있는 가장 효과적인 치료법을 확인했습니다. 대조군(JIMT-1-EGFP)은 JIMT-1 세포 배양 배지로 처리하였다. (A) 24시간 후, 세포를 Annexin V 647(적색)로 1시간 동안 염색하고, 자가사멸 세포 사멸을 HCA로 측정하였다. 히스토그램은 3개의 독립적인 실험(평균±SEM)을 보여줍니다. 컬럼은 JIMT-1 스페로이드 주변의 Annexin V 647의 강도를 나타냅니다. (B) 고리 영역의 Annexin V 647 강도에 대해 3개의 스페로이드/조건의 이미지를 분석했습니다. 데이터는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 사후 검정(*p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음)을 사용하여 분석했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2. 스페로이드의 JIMT-1 세포 사멸 평가. JIMT-1-EGFP 세포를 사용하여 스페로이드를 생성하였다. 3일째에 스페로이드를 HCS 플레이트로 옮기고 20μM 수니티닙(SUN)으로 1시간 동안 전처리한 다음 NK 세포를 10μg/mL 트라스투주맙으로 20:1 E:T 비율로 첨가했습니다. 24시간 후, 세포를 Annexin V 647로 1시간 동안 염색하고, 자가사멸 세포 사멸을 HCA로 측정하였다. Annexin V 647 강도(대조군: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK 세포+10μg/mL 트라스투주맙, ADCC+SUN: 20μM Sunitinib+20:1 NK 세포+10μg/mL 트라스투주맙)에 대해 3개의 스페로이드/조건의 이미지를 분석했습니다. 열은 JIMT-1 스페로이드(링) (A), 전체 스페로이드 (B) 및 전체 웰 (C) 주위의 Annexin V 647의 강도를 나타냅니다. 히스토그램은 3개의 독립적인 실험(평균±SEM)을 보여줍니다. 데이터는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 사후 검정(*p < 0.05, **p < 0.01, ns: 유의하지 않음)을 사용하여 분석했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 수십 년 동안 BC 치료가 크게 개선되었음에도 불구하고 환자들은 여전히 정기적으로 약물 내성을 일으키거나 부작용을 경험한다24. BC주와 관련된 높은 이환율과 사망률은 치료제 개발에 사용할 수 있는 새로운 분자를 식별하기 위한 강력한 스크리닝 플랫폼과 마찬가지로 근본적인 분자 메커니즘에 대한 지속적인 연구를 요구한다25. 이러한 전략에는 세포 배양 기반 중개 분석이 필요합니다. 스페로이드 및 종양 오가노이드와 같은 3D 종양 배양 시스템은 최근 기존의 단층 배양보다 종양 병태생리학의 주요 측면을 더 밀접하게 나타내는 저렴하고 구현하기 쉬운 모델로 부상했습니다. 이러한 특징 중 하나는 다양한 종양 관련 면역 세포와 암세포 간의 공간적으로 조정된 상호 작용입니다. 따라서 3D 공동 배양 모델은 악성 종양을 치료하기 위해 면역 세포에 작용하는 조절제에 맞춰진 약물 스크리닝을 위한 우수한 도구입니다26.
본 연구에서는 JIMT-1 유방암 세포에 대한 NK세포 매개 트라스투주맙 의존성 ADCC에 대한 새로운 스페로이드 모델을 소개하고, NK세포 매개 암세포 사멸 평가를 위한 자동화된 이미징 및 분석 워크플로우를 설명했습니다. 이 시술은 암세포 사멸을 유도하는 NK 세포의 질병 관련 능력을 모니터링할 수 있는 high-content imager 및 이미지 분석 소프트웨어에 대해 구현되었습니다. 2D 세포 배양 분석에서 JIMT-1 세포에서 트라스투주맙 의존성 ADCC에 대한 내성을 유도하는 화합물로서 다중표적 티로신 키나아제 억제제 수니티닙(Sunitinib)이 이전에 확인되었습니다. 수니티닙은 NK세포의 사멸 기능을 손상시키고 자가포식, HER2 발현의 하향조절을 유도하며 JIMT-1 세포의 부착을 강화한다17. 화합물 식별을 위한 스페로이드 분석 파이프라인을 검증하기 위해 수니티닙을 모델 화합물로 테스트한 결과, NK 세포가 암세포 스페로이드를 죽이는 능력을 크게 저해하여 단층에서 입증된 효과를 재현할 수 있음을 보여주었습니다.
당사의 분석법은 간단하며, 아가로스 코팅된 96웰 조직 배양 플레이트에서 스페로이드의 성장, 형성된 스페로이드를 HCS 및 HCA 응용 분야에 적합한 유리 바닥 마이크로플레이트로 1회 이동, 테스트 화합물 및 Trastuzumab 투여로 사멸하도록 활성화된 별도 염색된 NK 세포의 추가, 단일 단계 세포 사멸 염색 및 현미경 분석으로 구성됩니다. 스페로이드의 무결성을 손상시키지 않기 위해 두 세포 유형의 공동 배양 및 약물 처리가 시작된 후 웰에 심각한 조작이 적용되지 않습니다. 분석은 수행하는 데 4일밖에 걸리지 않습니다. 절차의 일환으로 96웰 조직 배양 플레이트의 바닥을 1% 저융점 아가로스로 코팅하는 것은 JIMT-1 세포가 플레이트 표면에 부착되는 것을 방지하고 종양 세포가 스페로이드로 자발적으로 조직되는 것을 촉진하기 위해 초저 부착 플레이트를 사용하는 것보다 저렴한 대안입니다. 아가로스 쿠션과 U자형 플라스틱 표면을 가로질러 이미지를 캡처할 수 없기 때문에 스페로이드를 이미징 플레이트로 옮겨야 했습니다. 중요한 것은 스페로이드 이송 전에 생체 불활성 계면활성제인 Pluronic-F127을 사용하여 HCS 플레이트의 유리 표면을 패시베이션하는 것이었습니다. 이 단계가 없으면 스페로이드가 웰 바닥에 퍼져 이미징 및 분석이 어려워집니다.
EGFP를 안정적으로 발현하는 인간 종양 세포주를 사용하여 스페로이드를 형성하였다17. 유전적으로 인코딩된 마커는 세포 염색 대신 프로토콜 전체에 걸쳐 지속적인 형광을 제공합니다. EGFP 신호의 비지도 텍스처 분석은 세포 사멸 유도 없이 전체 스페로이드를 구성하는 스페로이드의 컴팩트 커널을 인식하기 위한 기초를 제공합니다. NK 세포를 추가하고 ADCC를 유도했을 때, 윤곽의 현저한 붕괴로 인해 이미지 분석 알고리즘이 스페로이드의 윤곽을 묘사하는 데 어려움이 있었습니다. Annexin V-양성 세포는 주로 스페로이드의 주변부에서 발견되었기 때문에 잘 정의된 스페로이드 코어를 확장하여 소프트웨어의 내장 이미지 분할 모듈에 의해 생성된 주변 환형 영역의 세포 사멸을 평가함으로써 이 문제를 피할 수 있었습니다. 이 영역의 외부 경계를 정의하는 확장 계수는 수백 개의 스페로이드 이미지를 시각적으로 큐레이팅한 후 모든 경우에 죽어가고, 파쇄되고, 분산된 세포의 반그림자를 포함하도록 선택되었습니다. Z 스택 이미지의 최대 투영에서 자가사멸 고리 영역의 총 형광을 측정하면 전체 스페로이드 영역 또는 전체 웰 영역을 측정하는 것보다 실험 오류가 낮고 ADCC 효과가 더 뚜렷합니다(보충 그림 S2). 형광 라벨은 채널 분리의 필요성을 없애기 위해 BC 세포(EGFP)를 마킹하고 세포 사멸(Alexa 647)을 감지하기 위해 선택되었습니다. 시간 경과에 따른 스페로이드의 생존력을 결정하기 위해 EGFP 형광의 감소를 모니터링하는 것과는 대조적으로 apoptotic marker인 노출된 포스파티딜세린에 대한 형광 표지를 기반으로 end-point 판독을 선택했으며, 이는 또 다른 옵션이 될 수 있습니다. Annexin 염색을 통해 세포 사멸을 보다 정확하고 민감하게 식별할 수 있었습니다. 원칙적으로, 현재의 1차원 염색 접근법은 세포 사멸 양식(예: 형광 카스파아제 기질) 및 소멸된 세포 유형을 식별할 수 있는 보다 정밀한 세포 사멸 마커로 보완함으로써 개선할 수 있습니다.
이 방법은 다른 effector 면역 세포 유형(대식세포, T 세포 및 키메라 항원 수용체[CAR] 발현 면역 세포) 및 활성화 분자(예: 사이토카인, 인터류킨)를 연구하기 위해 최소한의 변경으로 수정할 수 있습니다. 단순성, 견고성 및 짧은 처리 시간을 목표로 HCA가 이 분석에 제공할 수 있는 가능성을 모두 소진하지 않았습니다. 이미징 및 분석 프로토콜은 추가 형광 라벨을 추가할 수 있습니다. 이 분석법은 다양한 유형의 세포를 추가하고 다중 형광 프로브를 사용하여 해당 세포 유형과 특정 형광 마커를 구별하여 진행 중인 세포 이벤트와 연결함으로써 보다 복잡한 스페로이드를 연구하는 데 적용할 수 있습니다 4,5. 이 프로토콜은 모든 HC 이미저에 적용할 수 있으며 텍스처 분석 모듈을 통합한 모든 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요성의 핵심 측면은 스페로이드의 사용입니다. 따라서 여러 매개 변수를 고려해야 합니다. 3D 배양 중인 세포는 단층21,22에서 성장한 세포와 비교할 때 화합물에 대해 감쇠된 반응을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 2D 세포 배양을 사용한다고 해서 전체 유기체에서 테스트된 약제의 유효 농도 범위를 예측할 수 있는 것은 아닙니다. 3D 모델을 설정할 때 2D에서 보고된 것보다 더 높은 화합물 농도와 E:T 비율을 테스트했습니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 2D ADCC 분석17에 사용된 E:T 비율을 2:1에서 암 스페로이드에 대해 20:1로 증가시켜 최적화되었습니다. 그 이면의 근거는 약물이 스페로이드의 코어를 효과적으로 관통할 수 없었고 주로 바깥층의 세포에 영향을 미쳤기 때문일 수 있습니다. 반면에, 트라스투주맙의 농도를 증가시키는 것은 ADCC 반응을 더 강화시키지 않았다(보충 그림 S1). 이 선택은 세포주와 표적 간에 다를 수 있습니다. 따라서, HER2 발현 수준이 ADCC 반응(20)의 중요한 결정인자라는 점을 고려하여, 다른 세포주, 예를 들어, 비-HER2 BC 세포주에 대해 이 프로토콜을 시험하는 것은 흥미로울 것이다.
요약하자면, 당사의 새로운 방법은 고처리량 약물 스크리닝에 사용될 수 있는 잠재력과 함께 3D 면역 암 모델에서 화합물의 효과를 분석할 수 있는 빠르고 강력한 플랫폼을 나타냅니다. 이는 HER2+ BC 스페로이드와 NK92 사용의 관련성을 강조합니다. CD16 세포는 트라스투주맙의 분자 메커니즘에 대한 이해를 더욱 향상시켜 트라스투주맙 의존성 ADCC의 효과를 생체 내 치료 잠재력으로 예측할 수 있는 기회를 제공합니다 27. 새로운 항종양 면역 조절제에 대한 탐구는 이 분석에서 큰 이점을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 환자 유래 종양 세포 배양의 맞춤형 화학감수성 검사로 확장될 수 있습니다. 면역 세포 사멸 및 ADCC 검사에 사용되는 기존의 2D 공동 배양을 3D 스페로이드 분석으로 전환하여 잠재적으로 중개 관련성을 높일 수 있음을 입증했습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언했습니다.
Acknowledgments
LV는 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 및 K147482. 이 프로젝트는 HUN-REN 헝가리 연구 네트워크로부터 자금을 지원받았습니다. CD16.176V.NK-92 세포는 Kerry S. Campbell 박사(Brink Biologics, lnc. San Diego, CA)는 전 세계 특허에 의해 보호되며 Nantkwest, lnc의 라이선스를 받았습니다. (www.nantkwest.com). 저자들은 NK-92 세포주와 TR-F(ab')2의 사용에 도움을 주고 기술적 조언을 해준 György Vereb과 Árpád Szöőr에게 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
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