Summary
Her præsenterer vi en metode til at identificere forbindelser, der modulerer ADCC-mekanismen, en vigtig kræftcelledræbende mekanisme af antitumorantistoffer. Den cytotoksiske virkning af NK-celler måles i brystkræftcellesfæroider ved tilstedeværelse af Trastuzumab. Billedanalyse identificerer levende og døde dræber- og målceller i sfæroider.
Abstract
Monoklonal antistofbaseret immunterapi rettet mod tumorantigener er nu en grundpille i kræftbehandling. En af antistoffernes klinisk relevante virkningsmekanismer er antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), hvor antistoffet binder sig til kræftcellerne og engagerer immunsystemets cellulære komponent, fx naturlige dræberceller (NK), for at dræbe tumorcellerne. Effektiviteten af disse terapier kan forbedres ved at identificere adjuvansforbindelser, der øger kræftcellernes følsomhed eller immuncellernes styrke. Derudover kan uopdagede lægemiddelinteraktioner hos kræftpatienter, der er co-medicineret for tidligere tilstande eller kræftassocierede symptomer, bestemme succesen med antistofbehandlingen; Derfor skal sådanne uønskede lægemiddelinteraktioner elimineres. Med disse mål i tankerne skabte vi en kræft-ADCC-model og beskriver her en simpel protokol til at finde ADCC-modulerende lægemidler. Da 3D-modeller såsom kræftcellesfæroider er bedre end 2D-kulturer til at forudsige in vivo-reaktioner fra tumorer til kræftbehandlinger, sfæroid-cokulturer af EGFP-ekspressive HER2 + JIMT-1 brystkræftceller og NK92. CD16-cellelinjer blev oprettet og induceret med Trastuzumab, et monoklonalt antistof, der er klinisk godkendt mod HER2-positiv brystkræft. JIMT-1 sfæroider fik lov til at danne sig i celleafvisende U-bund 96-brøndplader. På dag 3 blev NK-celler og Trastuzumab tilsat. Sfæroiderne blev derefter farvet med Annexin V-Alexa 647 for at måle apoptotisk celledød, som blev kvantificeret i sfæroidernes perifere zone med et automatiseret mikroskop. Anvendeligheden af vores analyse til at identificere ADCC-modulerende molekyler demonstreres ved at vise, at Sunitinib, en receptortyrosinkinasehæmmer, der er godkendt af FDA mod metastatisk kræft, næsten helt afskaffer ADCC. Genereringen af sfæroider og billedoptagelses- og analyserørledninger er kompatible med screening med høj kapacitet for ADCC-modulerende forbindelser i kræftcellesfæroider.
Introduction
Multicellulære tumorsfæroider (MCTS) er almindeligt anvendte tredimensionelle (3D) modeller, der dannes på grund af vedhængende cellers tendens til at aggregere og repræsenterer et vigtigt redskab til at opnå mekanistisk indsigt i kræftcellebiologi. De kan genereres fra en bred vifte af celletyper ved hjælp af adskillige teknikker, såsom væskebaserede og stilladsbaserede 3D-kulturer1. Deres største fordel i forhold til monolag 2D-modeller er, at de rekapitulerer hovedtræk ved in vivo-tumorer , nemlig strukturel organisation og hypoxi, ved at efterligne tumorcellernes biologiske opførsel, især de mekanismer, der fører til terapeutisk flugt og lægemiddelresistens2. Da MCTS således kan forbedre forudsigeligheden af toksicitet og lægemiddelfølsomhed, anvendes de i vid udstrækning til at studere kræft i 3D og kan forbedre udviklingen af effektive lægemidler til forskellige typer kræft3.
For at studere enhver sygdom er der et kritisk behov for relevante og bekvemme modeller. Opsætning af modeller til kræftimmunologiske undersøgelser er udfordrende, fordi immunsystemet består af flere celletyper. Hver celletype har flere undertyper og et bredt spektrum af aktiveringstilstande. Disse forskellige immuncelletyper interagerer med kræftceller og andre tumorkomponenter, hvilket i sidste ende påvirker resultatet af sygdommen. 2D in vitro-cellekulturmetoder kan ikke rekapitulere disse komplekse cellulære interaktioner, da de mangler oversættelighed og ikke er i stand til at forudsige virkningen af et lægemiddel på systemniveau (f.eks. i væv)4,5. Desuden har musemodeller også alvorlige begrænsninger på grund af de grundlæggende forskelle mellem det menneskelige og murinske immunsystem. 3D-kultursystemer kan derfor udfylde de nuværende huller i tilgængelige modeller, give en alternativ metode og forbedre vores forståelse af kræftimmunologi6. Specifikt kan sfæroidmodeller anvendes til test af immunterapier, hovedsageligt for at vurdere effektiviteten af lægemiddelscreening og terapeutiske antistoffer til forbedring af immuncelleinfiltration og antitumorale virkninger mod sfæroidmålene7. Endvidere er potentialet i MCTS, der består af celler i forskellige metaboliske og proliferative tilstande, til at undersøge interaktionerne mellem stromaceller (f.eks. lymfocytter, makrofager, fibroblaster) og kræftceller og til udvikling af nye kræftbekæmpelsesstrategier blevet rigeligt påvist8. Derfor er der et vitalt behov for at bekræfte prædiktive og nøjagtige platforme for at øge lægemiddeltestprocessen under hensyntagen til patofysiologien i tumormikromiljøet.
Brystkræft (BC) er den hyppigste kræftform, der diagnosticeres på verdensplan hos kvinder. Den kliniske klassificering af denne heterogene sygdom er baseret på tilstedeværelsen af transmembranreceptorer, fx østrogen (ER) og progesteron (PR) receptorer (samlet kaldet hormonreceptorer, HR) sammen med overekspression eller amplifikation af det humane epidermale vækstfaktorreceptor 2 (HER2) protein / onkogen. Baseret på den immunhistokemiske ekspression af disse receptorer genkendes fire undertyper almindeligvis: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positiv (HR-/HER2+) og triple-negativ brystkræft (HR-/HER2-). HER2+ gruppen udgør 10-15% af BC tilfældene og er kendetegnet ved høj HER2 ekspression med fravær af ER og PR, har en dårligere prognose sammenlignet med luminale tumorer, og kræver specifikke lægemidler rettet mod HER2/neu proteinet9.
BC-udvikling er en proces i flere trin, og en tidlig diagnose er afgørende for en vellykket behandling af sygdommen10. På trods af nyligt fremkomne personlige BC-behandlingsmuligheder (f.eks. Endokrine og anti-HER2-antistofterapier) fortsætter BC med at udfordre onkologer. Ligesom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling kan disse personlige terapier også have alvorlige bivirkninger, og patienter kan udvikle resistens over for disse midler, hvilket gør det til en langsigtet udfordring at bestemme den bedste strategi11,12. Derfor er forbedret forståelse af samspillet mellem tumoren og dens mikromiljø afgørende og forventes at give nye retninger for udviklingen af nye behandlinger, der tager hensyn til de særlige forhold i de forskellige BC-undertyper13. En ny bølge af immunterapier, såsom antistoflægemiddelkonjugater, adoptive T-celleterapier, vacciner og nye HER2-rettede monoklonale antistoffer (mAbs) undersøges i en bred population af patienter med HER2-ekspressive tumorer14.
Trastuzumab repræsenterer for eksempel en effektiv behandlingsmodalitet for HER2+ BC. Som en del af sin virkningsmekanisme medierer Trastuzumab fragmentkrystalliserbare gammareceptor (FcγR)-afhængige aktiviteter. FcγR'er kendetegnes ved deres affinitet for Fc-fragmentet og det immunrespons, de initierer. Aktivering af FcγRIIIa (CD16A) på naturlige dræberceller (NK) er afgørende for formidling af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), mens udløsning af FcγRIIa (CD32A) og FcγRIIIa på makrofager inducerer antistofafhængig cellulær fagocytose (ADCP)15. Undersøgelser af dyremodeller viste, at mus, der manglede FcγRI (CD64) og FcγRIII (CD16) receptorer, ikke var i stand til at indlede beskyttende immunresponser mod tumorspecifikke antigener, hvilket afslørede, at ADCC sandsynligvis er en vigtig virkningsmekanisme for mAb Trastuzumab16.
Da NK-celler tyr til tumorcellebundet Abs til kræftcelledrab af ADCC, er ekspression af Fc-receptorer afgørende for en effektiv behandling med Trastuzumab17 (figur 1). Desuden afbalanceres deres virkning effektivt af en stimulering af aktiverende og hæmmende receptorer, fx dræbercelleimmunoglobulinlignende (KIR) receptorer18.
Figur 1. Mekanisme af ADCC i forbindelse med en antitumorrespons. Fcγ-receptoren i en naturlig dræbercelle (NK) genkender Fc-regionen af et antistof, som tidligere havde bundet sig til et overfladeantigen på en kræftcelle. Denne immunologiske synaps fører til degranulering af NK-cellen, som frigiver cytotoksiske mediatorer såsom granzymer og perforin. Disse molekyler bidrager til poredannelse i cellemembranen og aktiverer apoptotiske veje, der forårsager programmeret celledød i målcellen (billede oprettet med Biorender.com). Klik her for at se en større version af denne figur.
Udvikling af immunterapi til HER2+ BC repræsenterer et felt i udvikling. I dette tilfælde bør man overveje interaktioner mellem forskellige komponenter i immunsystemet. Desuden har tidligere publikationer grundigt testet kombinationsterapier, der involverer alle typer traditionelle, immun- eller celleterapier for at identificere synergiserende kombinationer19.
Flere 3D-modeller af HER2+ BC har tidligere været brugt til lægemiddelforskning. For eksempel brugte Balalaeva et al. SKBR-3-sfæroider, der overudtrykte HER2, til at vurdere cytotoksiciteten af det HER2-målrettede immunotoksin 4D5scFv-PE4020. I en anden undersøgelse blev der etableret et 3D Matrigel-baseret HER2+ BC-kultursystem til måling af cellevækst som reaktion på Trastuzumab og endokrine midler21. Disse undersøgelser fremhæver vigtigheden af tumorsfæroidmodeller af HER2, der overudtrykker kræftceller for at repræsentere en effektiv strategi til klinisk forbedring af terapeutiske reaktioner22.
Vores gruppe identificerede tidligere Sunitinib, en multimålrettet tyrosinkinasehæmmer, som en hæmmer af Trastuzumab-afhængig ADCC i JIMT-1 HER2 + BC-celler i et 2D-kulturassay. Undersøgelsen afslørede, at Sunitinib inducerer autofagi og forringer NK-cellers dræbende funktion, nedregulerer HER2-ekspression og forbedrer overfladebinding af JIMT-1-celler17.
Her etablerede vi en ny 3D, sfærisk ADCC-model (NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP-kræftceller), der skulle bruges til screeningsapplikationer med høj kapacitet, og for at validere ovennævnte resultater blev Sunitinib anvendt som modelforbindelse. Først genererede vi EGFP, der udtrykte JIMT-1-celler17 og dyrkede sfæroider fra disse celler. ADCC blev induceret af NK-celler sammen med Trastuzumab, og sfæroider blev holdt i kultur i tilstedeværelse eller fravær af teststoffer i 24 timer (figur 2). Kvantificering af ADCC er baseret på påvisning af apoptotisk kræftcelledød (Annexin V-farvning) ved hjælp af et højindholdsanalysesystem.
Figur 2. ADCC i et 3D sfærisk co-kultur system. Vores eksperimentelle indstillinger er baseret på et 3D-sfærisk system, der mere præcist kan modellere in vivo-mikromiljøet sammenlignet med 2D-modeller. JIMT-1 EGFP brystkræftceller blev podet på en konkav celleafvisende bund for at danne en rundformet cellulær klynge, kaldet sfæroide. ADCC blev derefter indledt ved at tilføje NK92. CD16 naturlige dræberceller (E:T-forhold = 20:1) og et anti-HER2 monoklonalt antistof, Trastuzumab. Den eksperimentelle model har vist sig effektiv og let anvendelig til identifikation af ADCC-modificerende testforbindelser (billede oprettet med Biorender.com). Klik her for at se en større version af denne figur.
Vi demonstrerede, at indsamling af data på denne måde kan gøres i realtid og er statistisk robust til brug i screening med højt indhold i kræftlægemiddelopdagelse. Det er vigtigt, at denne model giver mulighed for en udvidet validering af et større sæt forbindelser, og den kan anvendes på flere analyser af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning af JIMT-1-forstærket fluorescerende protein (EGFP) sfærisk model
- For at danne en U-formet celleafvisende bund skal du belægge 96-brøndpladen med 0,5% agarose-PBS-opløsning (30 μL / brønd). Pladen inkuberes ved stuetemperatur i ca. 30-45 min.
- JIMT-1-EGFP-cellerne vaskes to gange med 2 ml steril PBS (generering af JIMT1-EGFP-cellelinje blev rapporteret i en tidligere publikation17). Brug T25-vævskulturkolber og JIMT-1-medier (DMEM / F-12-medium suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS), 0,3 E / ml insulin (100 IE / ml, Humulin R) og 1% penicillin-streptomycin) til cellekulturen.
- Tilsæt 2 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuber den i 10 minutter i en CO2 -inkubator.
- Bank på kolben for at kontrollere, om JIMT-1-celler løsnes efter inkubationstiden.
- Brug 2 ml JIMT-1 medium til at stoppe fordøjelsen og opsaml cellesuspensionen i et 15 ml rør.
- Tæl cellerne i et Bürker-kammer med 0,4% trypanblåt (80 μL farvestof + 20 μL af cellesuspensionen) og juster cellenummeret til 20.000 celler / ml.
- Der afpipetteres 100 μL af cellesuspensionen (2000 celler/hul) til hvert hul i 96-brøndpladen (forbelagt med 0,5 % agarose-PBS-opløsning som angivet i 1.1).
- Lad cellerne klumpe sig sammen i løbet af en 3-dages inkubationstid ved 37 °C i en CO2 -inkubator.
- Kontroller regelmæssigt størrelsen og formen af sfæroider med et omvendt mikroskop.
2. Belægning af HCS-pladen
BEMÆRK: For at forhindre fastgørelse af JIMT-1-EGFP-sfæroider til pladens glasoverflade er belægning af HCS-pladen (High-Content Screening) afgørende (ellers ville analyse med højt indhold ikke være mulig).
- På dag 3 efter induktion af sfæroider belægges 96-brønds screeningspladen med højt indhold med Pluronic-F127 (0,5% i DMSO, 50 μL / brønd) og inkuberes pladen i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Opsug overfladebehandlingsopløsningen, og vask hullerne to gange med DMEM/F-12-serumfrit medium (100 μL/hul).
3. Overførsel af sfæroider til HCS-pladen
- Brug en 1 ml pipette til at overføre sfæroiderne i tre eksemplarer til glasbunden 96-brønds HCS-plade.
4. Forbehandling af JIMT-1 EGFP-sfæroider med teststoffer
- Teststoffet (f.eks. Sunitinib fortyndet i DMSO i en koncentration på 40 μM) tilsættes ved pipettering af 10 μL/hul, og der tilsættes 10 μL frisk JIMT-1-substrat til kontrolhullerne (CTL).
- Pladen inkuberes i 1 time i en CO2 -inkubator ved 37 °C.
5. Induktion af ADCC ved tilsætning af effektorcellerne
BEMÆRK: CD16.176V.NK92-celler (i det følgende benævnt NK-celler) blev dyrket i α-MEM suppleret med 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvat, 1% glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 100 IE / ml IL-2.
- NK-cellerne i kolben samles i et 15 ml rør. Tæl cellerne med trypanblåt (80 μL farvestof + 20 μL cellesuspension) og juster celletætheden til 20: 1 effektor-til-mål (E: T) forhold (40.000 NK-celler / brønd).
- Plet NK-cellerne med 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL i 1 ml α-MEM NK-medium) og læg dem i en CO2 -inkubator ved 37 °C i 1 time.
- NK-cellerne centrifugeres ved 150 x g i 3 minutter ved stuetemperatur to gange for at vaske overskuddet af farvestoffet med 1 ml α-MEM-medium.
- Resuspender NK-cellepelleten i 1 ml frisk JIMT-1-medium.
- Tilsæt de farvede NK-celler sammen med anti-HER2-antistoffet (Ab) (Trastuzumab, opløst i sterilt destilleretH2O) til mål-JIMT-1-sfæroiderne ved pipettering af 55 μL/brønd CTB-farvede NK-celler og 55 μL/hul på 10 μg/ml Ab i JIMT-1-medium (samlet behandlingsvolumen tilsat til ADCC er 110 μL/brønd, og den endelige Sunitinib-koncentration er 20 μM).
BEMÆRK: Ved udvælgelsen af Ab-koncentration og E:T-forhold henholdt vi os til vores tidligere publikation17. Indledende forsøg blev udført med forskellige E:T-forhold og koncentrationer af Trastuzumab for at vurdere, hvilken der var den mest effektive til at inducere ADCC i sfæroider (supplerende figur S1). - Tilsæt 110 μL/hul frisk JIMT-1 medium til kontrolbrønde (CTL).
- Pladen inkuberes i 24 timer i en CO2 -inkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: Da NK92-celler vides at udøve ikke-specifikke cytotoksiske funktioner, skal du til kontrol bruge JIMT-1-celler co-inkuberet med både NK-celler alene og med en isotypekontrol eller en F (ab')2 Ab. Her blev F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')2) anvendt som negativ CTL. TR-F(ab')2 fragment blev fremstillet som rapporteret af Tóth et al.19 og tilsat i samme volumen som Trastuzumab sammen med NK-celler som beskrevet i 5.5. Koncentrationen blev justeret til 6,6 μg/ml svarende til en ækvimolær koncentration med Trastuzumab23.
6. Annexin V-647 farvning af sfæroider
- For at måle apoptotisk celledød skal du plette sfæroiderne med Annexin V-Alexa Fluor 647 konjugere i 1 time i JIMT-1-medium (1:100) ved at pipettere 50 μL / brønd.
7. Billedbehandling
BEMÆRK: Pladen afbildes 24 timer efter tilsætning af NK-effektorcellerne til målcellerne. Til billedbehandling anvendes en High-Content Analyzer og en billedanalysesoftware.
- Vælg typen af mikroplade fra listen over plader ved hjælp af indstillingen Pladetype . Brug 96-brønds HCS-plade (High-Content Screening).
- Vælg Two Peak autofokus, da analysen udføres i plader med 10x mål med 0,3 numerisk blænde (NA) ved hjælp af henholdsvis autofokus og objektiv indstillinger. Vælg konfokal tilstand med indstillingen Opt. Mode , og anvend Binning 2 ved hjælp af Binning-indstillingen .
- For billedsfæroider skal du vælge de relevante kanaler ved hjælp af indstillingen Kanalvalg . For at detektere EGFP-transducerede JIMT-1-celler skal du vælge EGFP (integrationstid 200 ms, lasereffekt 50%, stakhøjde 2,0 μm; ex: 488 nm em: 500-550 nm), og for at detektere apoptotiske celler skal du bruge Alexa 647 (integrationstid 100 ms, lasereffekt 50%, stakhøjde 10,0 μm; eks: 640 nm em: 650-760 nm). For at visualisere NK-cellerne i sfæroiderne skal du vælge følgende kanal: DAPI (integrationstid 100 ms, lasereffekt 50%, stakhøjde 2,0 μm; ex: 405 nm em: 435-480 nm).
- I indstillingen Layoutvalg skal du vælge Z-stakke, da celler i sfæroiderne har tendens til at være på forskellige brændplaner i mikroskopet. 10 fly (med afstand på 10 μm) er tilstrækkelige til at dække hele sfæroideområdet. Indstil værdierne for det første plan og det sidste plan til henholdsvis 0 μm og 90 μm.
BEMÆRK: Før målingen påbegyndes, kan der tages prøvebilleder med snapshot-funktionen for at kontrollere de korrekte indstillinger. - Angiv antallet af brønde og felter til billeddannelse ved hjælp af indstillingen Definer layout .
8. Analyse af højt indhold (HCA)
BEMÆRK: Analysér billederne med Harmony-softwaren, eller eksporter billeder til analyse ved hjælp af en foretrukken tredjepartssoftware. Til analyse af ADCC-effektiviteten måles fluorescensintensiteten af Annexin V 647. Målceller dræbt af ADCC vises i det perifere område af sfæroiderne. Derfor måles de Annexin V-positive celler i denne sfæroid "ring". For at validere denne metode blev der udført analyser med forskellige parametre for at vurdere, hvilken der var den mest pålidelige og gav de bedste resultater (supplerende figur S2). En ADCC-brønd vises i videoen for trin for trin at demonstrere billedanalyseprocessen.
- Identificer sfæroider ved EGFP-fluorescens af JIMT-1-celler ved hjælp af Find teksturregioner , og filtrer dem ud efter størrelse (> 25.000 μm2).
- Fjern kantobjekter ved at vælge befolkningsindstilling .
- Da Annexin V-positive (apoptotiske) celler vises i periferien af sfæroider, måles Annexin-intensiteten i denne apoptotiske 'ring', valgt af indstillingen Vælg region (ydre grænse -90%) for at bestemme apoptotisk celledød.
- Ekspresværdier for Annexin V-intensitet som middelintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGFP, der udtrykte JIMT-1-celler, blev genereret, og sfæroider blev dyrket fra disse celler. Sunitinib blev anvendt som teststof, da det tidligere har vist sig at påvirke forløbet af ADCC17. Sfæroider fik lov til at klumpe i 72 timer. På dag 3 blev der tilsat 10 μg/ml trastuzumab (eller ækvimolære 6,6 μg/ml TR-F(ab')219) og NK-celler (20:1) til sfæroiderne i nærvær eller fravær af 20 μM Sunitinib (1 times forbehandling) i en samlet periode på 24 timer. JIMT-1 alene og JIMT-1 co-inkuberet med NK-celler (20:1) blev anvendt som CTL'er. Sfæroider blev farvet med Annexin V 647 i 1 time for at påvise apoptotisk celledød og blev derefter afbildet med en High-Content Analyzer.
Som angivet ved Annexin V-farvning forårsagede tilsætning af NK-celler sammen med Trastuzumab til JIMT-1-cellerne celledød i tumorsfæroiderne. Annexinpositive (apoptotiske) celler opstod i den perifere zone af sfæroiderne som synlige i figur 3A. På den anden side resulterede tilsætningen af NK-celler alene ikke i tumorcelleapoptose. For at skelne mellem trastuzumabs evne til at rekruttere ADCC og dets direkte biologiske virkning blev TR-F(ab')2 uden funktionel FcR-bindingsevne anvendt som negativ kontrol med trastuzumab. Da TR-F(ab')2 viste sig at være ineffektiv i denne model (figur 3B), vil effekten sandsynligvis blive medieret via ADCC. Desuden reducerede forbehandling med Sunitinib Annexin V-farvning i sfæroiderne, hvilket bekræftede Sunitinib-induceret ADCC-resistens og afslørede forebyggelsen af apoptotisk celledød i JIMT-1-sfæroider co-inkuberet med NK-celler og Trastuzumab.
Figur 3. Påvisning af ADCC-effektorforbindelser i en 3D-sfæroidmodel. Tumorsfæroider blev genereret med JIMT-1-EGFP-celler. Efter en inkubationstid på 3 dage blev sfæroider overført til en HCS-plade, der tidligere var belagt med Pluronic F-127 for at forhindre cellebinding. Den næste dag 10 μg/ml Trastuzumab (TR) (eller ækvimolær 6,6 μg/ml TR-F(ab')2 som negativ CTL) og NK92. CD16-celler (forfarvet med Cell Tracker Blue) blev tilsat til brøndene (E:T-forhold på 20:1) i fravær eller tilstedeværelse af 20 μM Sunitinib (SUN). JIMT-1 sfæroider alene og JIMT-1 sfæroider co-inkuberet med NK-celler (20: 1) blev brugt som CTL'er. (A) Efter en inkubationstid på 24 timer blev Annexin V 647 (rød farve) brugt til at plette sfæroider i 1 time for at visualisere apoptotiske celler. (B) Billeder af 3 sfæroider / tilstand blev taget og analyseret for fluorescensintensiteten af Annexin V 647 i det perifere område af sfæroiderne (ringområdet). Histogram viser 4 uafhængige eksperimenter (midler±SEM). Data blev analyseret med Kruskal-Wallis-test efterfulgt af Dunns post-hoc-test (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: ikke signifikant). Klik her for at se en større version af denne figur.
Disse data bekræfter, at Sunitinib hæmmer ADCC. ADCC-forstærkende forbindelser forventes at blive identificeret på en lignende måde. Sammenfattende kan vores HCS-analyse være egnet til identifikation af forbindelser, der påvirker ADCC.
Supplerende figur S1. Optimering af E:T-forholdet og trastuzumabkoncentrationen. JIMT-1-EGFP-celler blev brugt til at generere sfæroider. På dag 3 blev sfæroider overført til en HCS-plade, og NK-celler blev tilsat i forskellige E:T-forhold (20:1, 40:1 og 60:1) med 10, 20 og 50 μg/ml Trastuzumab (TR) for at se, hvilken behandling der var den mest effektive behandling, der kunne fremkalde celledød i sfæroiderne. Kontrol (JIMT-1-EGFP) blev behandlet med JIMT-1 cellekulturmedier. (A) Efter 24 timer blev cellerne farvet med Annexin V 647 (rød farve) i 1 time, og apoptotisk celledød blev målt med HCA. Histogrammer viser 3 uafhængige eksperimenter (midler±SEM). Søjlerne repræsenterer intensiteten af Annexin V 647 omkring JIMT-1 sfæroiderne. (B) Billeder af 3 sfæroider / tilstand blev analyseret for Annexin V 647 intensiteten af ringområdet. Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-hoc test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: ikke signifikant). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2. Evaluering af JIMT-1 celle apoptose i sfæroiderne. JIMT-1-EGFP-celler blev brugt til at generere sfæroider. På dag 3 blev sfæroider overført til en HCS-plade og forbehandlet med 20 μM Sunitinib (SUN) i 1 time, derefter blev NK-celler tilsat ved 20:1 E:T-forhold med 10 μg/ml Trastuzumab. Efter 24 timer blev cellerne farvet med Annexin V 647 i 1 time, og apoptotisk celledød blev målt med HCA. Billeder af 3 sfæroider / tilstand blev analyseret for Annexin V 647-intensiteten (kontrol: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20: 1 NK-celler + 10 μg / ml Trastuzumab, ADCC + SUN: 20 μM Sunitinib + 20: 1 NK-celler + 10 μg / ml Trastuzumab). Kolonnerne repræsenterer intensiteten af Annexin V 647 omkring JIMT-1 sfæroiderne (ring) (A), i hele kugleformet (B) og i hele brønden (C). Histogrammer viser 3 uafhængige eksperimenter (midler±SEM). Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-hoc test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: ikke signifikant). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af betydelige forbedringer i behandlingen af BC i løbet af de sidste årtier udvikler patienter stadig regelmæssigt medicinresistens eller oplever negative bivirkninger24. Den høje sygelighed og dødelighed, der er forbundet med BC, kræver en fortsat undersøgelse af de underliggende molekylære mekanismer, ligesom robuste screeningsplatforme til at identificere nye molekyler, der kan handles på til terapeutisk udvikling25. Disse strategier kræver cellekulturbaserede translationelle assays. 3D-tumorkultursystemer, såsom sfæroider og tumororganoider, er for nylig opstået som billige, nemme at implementere modeller, der repræsenterer nøgleaspekter af tumorpatofysiologi tættere end konventionelle enkeltlagskulturer. Et af disse træk er den rumligt koordinerede interaktion mellem forskellige tumorassocierede immunceller og kræftceller. Dette gør 3D-samkulturmodeller til overlegne værktøjer til lægemiddelscreening rettet mod modulatorer, der virker på immunceller til behandling af maligniteter26.
I dette arbejde har vi introduceret en ny sfærisk model for NK-cellemedieret Trastuzumab-afhængig ADCC mod JIMT-1 brystkarcinomceller og beskrevet en automatiseret billeddannelses- og analysearbejdsgang til evaluering af NK-cellemedieret kræftcelledrab. Proceduren blev implementeret for en billed- og billedanalysesoftware med højt indhold, der muliggør overvågning af NK-cellernes sygdomsrelevante evne til at inducere kræftcelleapoptose. Den multimålrettede tyrosinkinasehæmmer Sunitinib som en forbindelse, der inducerer resistens over for Trastuzumab-afhængig ADCC i JIMT-1-celler i 2D-cellekulturassays, blev tidligere identificeret. Sunitinib forringer NK-cellernes dræbende funktion og inducerer autofagi, nedregulering af HER2-ekspression og forbedrer vedhæftningen af JIMT-1-celler17. For at validere vores sfæroidanalysepipeline til identifikation af forbindelser testede vi Sunitinib som modelforbindelse og viser, at det kan hæmme NK-cellernes evne til at dræbe kræftcellesfæroiderne, der gengiver den effekt, det demonstrerede i monolag.
Vores metode er enkel og omfatter vækst af sfæroider i agarosebelagte 96-brønds vævskulturplader, en engangsoverførsel af de dannede sfæroider til en glasbundet mikroplade, der er egnet til HCS- og HCA-applikationer, tilsætning af testforbindelser og de separat farvede NK-celler, der aktiveres til at dræbe ved administration af Trastuzumab, en enkelttrins celledødsfarvning og mikroskopianalysen. Der anvendes ingen alvorlige manipulationer på brøndene efter begyndelsen af samdyrkning af de to celletyper og lægemiddelbehandlingen for at undgå at kompromittere sfæroidernes integritet. Analysen tager kun 4 dage at udføre. Belægning af bunden af 96-brønds vævskulturplader med 1% lavsmeltende agarose som en del af proceduren er et billigt alternativ til at bruge ultralave fastgørelsesplader for at forhindre JIMT-1-celler i at klæbe til pladens overflade og for at fremme den spontane organisering af tumorcellerne i sfæroider. Da billedoptagelse ikke er mulig på tværs af agarosepuden og den U-formede plastoverflade, skulle sfæroiderne overføres til billedpladen. Afgørende var passiveringen af HCS-pladens glasoverflade med det bioinaktive overfladeaktive stof, Pluronic-F127 før sfærisk overførsel. Uden dette trin spredes sfæroider ud på bunden af brøndene, hvilket gør billeddannelse og analyse vanskelig.
En human tumorcellelinje, der stabilt udtrykker EGFP, blev anvendt til dannelse af sfæroider17. Den genetisk kodede markør tilbyder vedvarende fluorescens i hele protokollen i stedet for cellepletter. Uovervåget teksturanalyse af EGFP-signalet giver grundlaget for at genkende sfæroidernes kompakte kerne, som omfatter hele sfæroiden uden induktion af celledød. Når NK-celler blev tilføjet, og ADCC blev induceret, udgjorde den markante opløsning af konturerne undertiden en udfordring for billedanalysealgoritmen at afgrænse omridset af sfæroiden. Fordi Annexin V-positive celler hovedsageligt blev fundet i periferien af sfæroiderne, blev dette problem omgået ved at evaluere celledød i et perifert ringformet område genereret af det indbyggede billedsegmenteringsmodul i softwaren ved at udvide den veldefinerede sfæroidkerne. Ekspansionsfaktoren, der definerer den ydre grænse for dette område, blev valgt til at omfatte penumbra af døende, makulerede og spredte celler i alle tilfælde efter visuelt at have kurateret hundredvis af sfæroidbilleder. Bestemmelse af den samlede fluorescens af det apoptotiske ringområde i de maksimale projektioner af Z-stack-billeder gav lavere eksperimentelle fejl og en mere udtalt ADCC-effekt end måling af enten hele sfæroidområdet eller hele brøndområdet (supplerende figur S2). Fluorescerende etiketter blev valgt til markering af BC-cellerne (EGFP) og detektering af celledød (Alexa 647) for at udelukke et behov for kanalseparation. En slutpunktsaflæsning blev valgt baseret på fluorescerende mærkning for eksponeret phosphatidylserin, en apoptotisk markør, i modsætning til overvågning af faldet i EGFP-fluorescens for at bestemme levedygtigheden af sfæroider over tid, hvilket kunne være en anden mulighed. Annexinfarvning muliggjorde en mere nøjagtig og følsom identifikation af celledød. I princippet er det muligt at forbedre den nuværende endimensionelle farvningsmetode ved at supplere den med yderligere, mere præcise celledødsmarkører, der kan identificere celledødsmodaliteten (f.eks. fluorescerende caspasesubstrater) og den omkomne celletype.
Denne metode kan ændres med minimale ændringer for at studere andre effektorimmuncelletyper (makrofager, T-celler og kimære antigenreceptor [CAR]-ekspressive immunceller) og aktivatormolekyler (f.eks. cytokiner, interleukiner). Med henblik på enkelhed, robusthed og kort behandlingstid har vi ikke udtømt de muligheder, HCA kan tilbyde for denne analyse. Billeddannelses- og analyseprotokollerne kan tilføjes yderligere fluorescerende etiketter. Dette assay kan tilpasses til at studere mere komplekse sfæroider ved at tilføje forskellige typer celler og bruge multipleksede fluorescerende sonder til at skelne mellem disse celletyper og specifikke fluorescerende markører for at forbinde dem med igangværende cellulære begivenheder 4,5. Protokollen kan tilpasses til ethvert HC-billeddanner, og billederne kan analyseres med enhver billedanalysesoftware, der indeholder et teksturanalysemodul.
Nøgleaspektet af vigtigheden af denne protokol er brugen af sfæroider. Derfor skal en række parametre tages i betragtning. Det er kendt, at celler i 3D-kultur viser et svækket respons på forbindelser sammenlignet med celler dyrket i monolag21,22. Anvendelsen af 2D-cellekulturer tillader ikke en at forudsige det effektive koncentrationsområde for et testet middel i hele organismen. Da vi opsatte vores 3D-model, testede vi højere koncentrationer af forbindelser og E:T-forhold end dem, der blev rapporteret i 2D. For eksempel blev protokollen optimeret ved at øge E:T-forholdet fra 2:1, der blev brugt i vores 2D ADCC-assay17, til 20:1 for kræftsfæroiderne. Rationalet bag dette kunne være, at stofferne ikke var i stand til effektivt at trænge ind i kernen af sfæroider og hovedsageligt påvirkede cellerne i de ydre lag. På den anden side forbedrede øget koncentration af trastuzumab ikke ADCC-responset yderligere (supplerende figur S1). Dette valg kan variere mellem cellelinjer og mål. Det ville således være interessant at teste denne protokol på andre cellelinjer, f.eks. en ikke-HER2 BC-cellelinje, idet der tages højde for, at HER2-ekspressionsniveau er en vigtig determinant for ADCC-respons20.
Sammenfattende repræsenterer vores nye metode en hurtig og robust platform til at analysere effekten af forbindelser i en 3D-immunkræftmodel med potentiale til at blive brugt til screening af lægemidler med høj kapacitet. Dette fremhæver relevansen af at bruge HER2+ BC sfæroider og NK92. CD16-celler til yderligere forbedring af forståelsen af Trastuzumabs molekylære mekanismer, hvilket giver mulighed for at forudse effektiviteten af Trastuzumab-afhængig ADCC i det terapeutiske potentiale in vivo27. Søgen efter nye antitumorimmunmodulatorer kan drage stor fordel af dette assay. Metoden kan udvides til personlig kemosensitivitetstest af patientafledte tumorcellekulturer. Vi har vist, at de traditionelle 2D-cokulturer, der anvendes i immuncelledrab og ADCC-test, kan omdannes til 3D-sfæroidassays, hvilket potentielt øger deres translationelle relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærede ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
LV modtog støtte fra National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 og K147482. Dette projekt har modtaget støtte fra HUN-REN Hungarian Research Network. CD16.176V.NK-92 celler blev opnået fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, på vegne af Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet af patenter over hele verden og blev licenseret af Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Forfatterne er taknemmelige over for György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjælp med brugen af NK-92-cellelinjen og TR-F(ab')2 og for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
References
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293 (2017).
- Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects. Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. 3D culture systems for exploring cancer immunology. Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103 (2016).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Front Immunol. 11, 603640 (2020).
- Li, Y., et al. Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more. Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).
- Sun, Y. S., et al. Risk factors and preventions of breast cancer. Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).
- Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan. BMC Cancer. 22 (1), 849 (2022).
- Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. Breast cancer treatments: Updates and new challenges. J Pers Med. 11 (8), 808 (2021).
- Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond. NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).
- Musolino, A., et al. Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy. J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).
- Petricevic, B., et al. Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients. J Transl Med. 11, 307 (2013).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Barok, M., et al. Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor. Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).
- Toth, G., et al. The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).
- Ehlers, F. aI., et al. ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response. Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).
- Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. 3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response. BMC Cancer. 16, 345 (2016).
- Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro. Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).
- Selis, F., et al. Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen. Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).
- Johnston, R. L., et al. High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations. Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).
- Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning. J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).
- Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer. SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
