Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.
Abstract
Die auf monoklonalen Antikörpern basierende Immuntherapie, die auf Tumorantigene abzielt, ist heute eine tragende Säule der Krebsbehandlung. Einer der klinisch relevanten Wirkmechanismen der Antikörper ist die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC), bei der der Antikörper an die Krebszellen bindet und die zelluläre Komponente des Immunsystems, z. B. natürliche Killerzellen (NK-Zellen), angreift, um die Tumorzellen abzutöten. Die Wirksamkeit dieser Therapien könnte verbessert werden, indem adjuvante Verbindungen identifiziert werden, die die Empfindlichkeit der Krebszellen oder die Potenz der Immunzellen erhöhen. Darüber hinaus können unentdeckte Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten bei Krebspatienten, die wegen früherer Erkrankungen oder krebsassoziierter Symptome behandelt wurden, den Erfolg der Antikörpertherapie bestimmen. Daher müssen solche unerwünschten Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten eliminiert werden. Mit diesen Zielen im Hinterkopf haben wir ein Krebs-ADCC-Modell erstellt und beschreiben hier ein einfaches Protokoll, um ADCC-modulierende Medikamente zu finden. Da 3D-Modelle wie Krebszell-Sphäroide 2D-Kulturen bei der Vorhersage von In-vivo-Reaktionen von Tumoren auf Krebstherapien überlegen sind, werden Sphäroid-Kokulturen von EGFP-exprimierenden HER2+ JIMT-1-Brustkrebszellen und dem NK92 verwendet. CD16-Zelllinien wurden aufgebaut und mit Trastuzumab, einem monoklonalen Antikörper, der klinisch gegen HER2-positiven Brustkrebs zugelassen ist, induziert. JIMT-1-Sphäroide konnten sich in zellabweisenden U-Boden-96-Well-Platten bilden. An Tag 3 wurden NK-Zellen und Trastuzumab hinzugefügt. Die Sphäroide wurden dann mit Annexin V-Alexa 647 gefärbt, um den apoptotischen Zelltod zu messen, der in der peripheren Zone der Sphäroide mit einem automatisierten Mikroskop quantifiziert wurde. Die Anwendbarkeit unseres Assays zur Identifizierung von ADCC-modulierenden Molekülen wird demonstriert, indem gezeigt wird, dass Sunitinib, ein von der FDA zugelassener Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor gegen metastasierenden Krebs, ADCC fast vollständig eliminiert. Die Generierung der Sphäroide und die Bildaufnahme- und Analysepipelines sind mit dem Hochdurchsatz-Screening auf ADCC-modulierende Verbindungen in Krebszell-Sphäroiden kompatibel.
Introduction
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) sind weit verbreitete dreidimensionale (3D) Modelle, die sich aufgrund der Neigung adhärenter Zellen zur Aggregation bilden und ein wichtiges Werkzeug darstellen, um mechanistische Einblicke in die Biologie von Krebszellen zu gewinnen. Sie können aus einer Vielzahl von Zelltypen durch zahlreiche Techniken erzeugt werden, wie z. B. flüssigkeits- und gerüstbasierte 3D-Kulturen1. Ihr Hauptvorteil gegenüber monolayern 2D-Modellen besteht darin, dass sie die Hauptmerkmale von In-vivo-Tumoren , nämlich strukturelle Organisation und Hypoxie, rekapitulieren, indem sie das biologische Verhalten von Tumorzellen nachahmen, insbesondere die Mechanismen, die zu therapeutischer Flucht und Arzneimittelresistenz führen2. Da MCTS die Vorhersagbarkeit von Toxizität und Arzneimittelempfindlichkeit verbessern können, werden sie häufig zur Untersuchung von Krebserkrankungen in 3D eingesetzt und könnten die Entwicklung wirksamer Medikamente für verschiedene Krebsarten verbessern3.
Um eine Krankheit zu untersuchen, besteht ein entscheidender Bedarf an relevanten und praktischen Modellen. Der Aufbau von Modellen für krebsimmunologische Studien ist eine Herausforderung, da das Immunsystem aus mehreren Zelltypen besteht. Jeder Zelltyp hat mehrere Subtypen und ein breites Spektrum an Aktivierungszuständen. Diese verschiedenen Immunzelltypen interagieren mit Krebszellen und anderen Tumorbestandteilen und beeinflussen letztlich den Ausgang der Krankheit. 2D-In-vitro-Zellkulturmethoden sind nicht in der Lage, diese komplexen zellulären Interaktionen zu rekapitulieren, da sie nicht übersetzbar sind und nicht in der Lage sind, die Wirkung eines Arzneimittels auf Systemebene (z. B. in Geweben) vorherzusagen4,5. Darüber hinaus haben Mausmodelle aufgrund der grundlegenden Unterschiede zwischen dem menschlichen und dem murinen Immunsystem auch starke Einschränkungen. 3D-Kultursysteme können daher die derzeitigen Lücken in den verfügbaren Modellen schließen, eine alternative Methode darstellen und unser Verständnis der Krebsimmunologie verbessern6. Insbesondere könnten Sphäroidmodelle zum Testen von Immuntherapien verwendet werden, hauptsächlich um die Wirksamkeit von Wirkstoff-Screenings und therapeutischen Antikörpern zur Verbesserung der Immunzellinfiltration und der antitumoralen Wirkung gegen die Sphäroidziele zu bewerten7. Darüber hinaus wurde das Potenzial von MCTS, das aus Zellen in verschiedenen metabolischen und proliferativen Zuständen besteht, zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Stromazellen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen, Fibroblasten) und Krebszellen sowie zur Entwicklung neuer Antikrebsstrategien hinreichend nachgewiesen8. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, prädiktive und genaue Plattformen zu untermauern, um den Prozess der Arzneimitteltests unter Berücksichtigung der Pathophysiologie der Tumormikroumgebung zu beschleunigen.
Brustkrebs (BC) ist weltweit die häufigste Krebserkrankung, die bei Frauen diagnostiziert wird. Die klinische Klassifikation dieser heterogenen Erkrankung basiert auf dem Vorhandensein von Transmembranrezeptoren, z. B. Östrogen- (ER) und Progesteronrezeptoren (PR) (zusammenfassend als Hormonrezeptoren bezeichnet, HR) sowie auf der Überexpression oder Amplifikation des humanen Proteins/Onkogens des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2). Basierend auf der immunhistochemischen Expression dieser Rezeptoren werden vier Subtypen allgemein unterschieden: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positiv (HR-/HER2+) und triple-negativer Brustkrebs (HR-/HER2-). Die HER2+-Gruppe macht 10-15% der BC-Fälle aus und zeichnet sich durch eine hohe HER2-Expression ohne ER und PR aus, hat eine schlechtere Prognose im Vergleich zu luminalen Tumoren und erfordert spezifische Medikamente, die gegen das HER2/neu-Proteingerichtet sind 9.
Die Entwicklung des Basalzellkarzinoms ist ein mehrstufiger Prozess, und eine frühzeitige Diagnose ist für eine erfolgreiche Behandlung der Krankheit unerlässlich10. Trotz der kürzlich entstandenen personalisierten BC-Behandlungsoptionen (z. B. endokrine und Anti-HER2-Antikörpertherapien) stellt BC die Onkologen weiterhin vor Herausforderungen. Genau wie Operationen, Chemotherapien und Strahlentherapien können auch diese personalisierten Therapien schwerwiegende Nebenwirkungen haben, und die Patienten können Resistenzen gegen diese Wirkstoffe entwickeln, was es zu einer langfristigen Herausforderung macht, die beste Strategie zu bestimmen11,12. Daher ist ein besseres Verständnis des Zusammenspiels zwischen dem Tumor und seiner Mikroumgebung von entscheidender Bedeutung und wird voraussichtlich neue Richtungen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen liefern, die die Besonderheiten der verschiedenen BC-Subtypen berücksichtigen13. Eine neue Welle von Immuntherapien wie Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, adoptive T-Zell-Therapien, Impfstoffe und neuartige HER2-gerichtete monoklonale Antikörper (mAbs) wird in einer breiten Population von Patienten mit HER2-exprimierenden Tumoren untersucht14.
Trastuzumab beispielsweise stellt eine effiziente Behandlungsmethode für HER2+ BC dar. Als Teil seiner Wirkungsweise vermittelt Trastuzumab fragmentkristallisierbare Gammarezeptor (FcγR)-abhängige Aktivitäten. FcγRs zeichnen sich durch ihre Affinität zum Fc-Fragment und die Immunantwort aus, die sie auslösen. Die Aktivierung von FcγRIIIa (CD16A) auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) ist entscheidend für die Vermittlung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC), während die Aktivierung von FcγRIIa (CD32A) und FcγRIIIa auf Makrophagen die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) induziert15. Studien an Tiermodellen zeigten, dass Mäuse, denen die Rezeptoren FcγRI (CD64) und FcγRIII (CD16) fehlten, nicht in der Lage waren, schützende Immunantworten gegen tumorspezifische Antigene zu initiieren, was darauf hindeutet, dass ADCC wahrscheinlich ein wichtiger Wirkmechanismus für das mAb Trastuzumab16 ist.
Da NK-Zellen auf tumorzellgebundene Abs zurückgreifen, um Krebszellen durch ADCC abzutöten, ist die Expression von Fc-Rezeptoren entscheidend für eine effiziente Behandlung mit Trastuzumab17 (Abbildung 1). Darüber hinaus wird ihre Wirkung durch eine Stimulation aktivierender und hemmender Rezeptoren, z. B. Killerzell-Immunglobulin-ähnlicher (KIR)-Rezeptoren, effizient ausgeglichen18.
Abbildung 1. Mechanismus des ADCC im Kontext eines Antitumor-Ansprechens. Der Fcγ-Rezeptor einer natürlichen Killerzelle (NK-Zelle) erkennt die Fc-Region eines Antikörpers, der zuvor an ein Oberflächenantigen auf einer Krebszelle gebunden hatte. Diese immunologische Synapse führt zur Degranulation der NK-Zelle, die zytotoxische Mediatoren wie Granzyme und Perforin freisetzt. Diese Moleküle tragen zur Porenbildung in der Zellmembran bei und aktivieren apoptotische Signalwege, die zum programmierten Zelltod der Zielzelle führen (Bild erstellt mit Biorender.com). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Entwicklung von Immuntherapien für HER2+ BC stellt ein sich entwickelndes Feld dar. In diesem Fall sollte man Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Komponenten des Immunsystems berücksichtigen. Darüber hinaus wurden in früheren Veröffentlichungen Kombinationstherapien mit allen Arten von traditionellen, Immun- oder Zelltherapien ausgiebig getestet, um synergistische Kombinationen zu identifizieren19.
Mehrere 3D-Modelle von HER2+ BC wurden bereits für die Wirkstoffforschung verwendet. Zum Beispiel verwendeten Balalaeva et al. SKBR-3-Sphäroide, die HER2 überexprimieren, um die Zytotoxizität des HER2-gerichteten Immuntoxins 4D5scFv-PE4020 zu bewerten. In einer weiteren Studie wurde ein 3D-Matrigel-basiertes HER2+ BC-Kultursystem etabliert, um das Zellwachstum als Reaktion auf Trastuzumab und endokrine Wirkstoffe zu messen21. Diese Studien unterstreichen die Bedeutung von Tumor-Sphäroidmodellen von HER2-überexprimierenden Krebszellen als wirksame Strategie zur klinischen Verbesserung des therapeutischen Ansprechens22.
Unsere Gruppe hat Sunitinib, einen multitargetierten Tyrosinkinase-Inhibitor, bereits in einem 2D-Kulturassay als Inhibitor des Trastuzumab-abhängigen ADCC in JIMT-1 HER2+ BC-Zellen identifiziert. Die Studie zeigte, dass Sunitinib Autophagie induziert und die Abtötungsfunktion von NK-Zellen beeinträchtigt, die HER2-Expression herunterreguliert und die Oberflächenanheftung von JIMT-1-Zellen verbessert17.
Hier haben wir ein neuartiges 3D-Sphäroid-ADCC-Modell (NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP-Krebszellen) für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen etabliert und um die oben genannten Ergebnisse zu validieren, wurde Sunitinib als Modellsubstanz verwendet. Zuerst erzeugten wir EGFP, die JIMT-1 Zellenexprimieren 17 und züchteten Sphäroide aus diesen Zellen. ADCC wurde durch NK-Zellen zusammen mit Trastuzumab induziert, und die Sphäroide wurden 24 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von Testsubstanzen in Kultur gehalten (Abbildung 2). Die Quantifizierung des ADCC basiert auf dem Nachweis des apoptotischen Krebszelltods (Annexin-V-Färbung) mit Hilfe eines High-Content-Analysesystems.
Abbildung 2. ADCC in einem 3D-Sphäroid-Co-Kultursystem. Unsere experimentellen Einstellungen basieren auf einem 3D-Sphäroidsystem, das die In-vivo-Mikroumgebung im Vergleich zu 2D-Modellen genauer modellieren kann. JIMT-1 EGFP-Brustkrebszellen wurden auf einem konkaven zellabweisenden Boden ausgesät, um einen runden Zellhaufen zu bilden, der als Sphäroid bezeichnet wird. ADCC wurde dann durch Hinzufügen von NK92 initiiert. CD16 natürliche Killerzellen (E:T-Verhältnis = 20:1) und ein monoklonaler Anti-HER2-Antikörper, Trastuzumab. Das experimentelle Modell hat sich als effizient und leicht anwendbar für die Identifizierung von ADCC-modifizierenden Testverbindungen erwiesen (Bild erstellt mit Biorender.com). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Wir haben gezeigt, dass die Datenerfassung auf diese Weise in Echtzeit erfolgen kann und statistisch robust für den Einsatz im High-Content-Screening in der Krebswirkstoffforschung ist. Wichtig ist, dass dieses Modell eine erweiterte Validierung einer größeren Anzahl von Verbindungen ermöglicht und auf mehrere Assays von Interesse angewendet werden kann.
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Protocol
1. Aufbau des JIMT-1-verstärkten Fluoreszenzproteins (EGFP)-Sphäroidmodells
- Um einen U-förmigen, zellabweisenden Boden zu bilden, beschichten Sie die 96-Well-Platte mit 0,5%iger Agarose-PBS-Lösung (30 μl/Well). Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für ca. 30-45 Minuten.
- Waschen Sie die JIMT-1-EGFP-Zellen zweimal mit 2 ml sterilem PBS (über die Generierung der JIMT1-EGFP-Zelllinie wurde in einer früheren Veröffentlichungberichtet 17). Für die Zellkultur werden T25-Gewebekulturflaschen und JIMT-1-Medien (DMEM/F-12-Medium, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum (FBS), 0,3 U/ml Insulin (100 IE/ml, Humulin R) und 1 % Penicillin-Streptomycin) verwendet.
- 2 ml Trypsin-EDTA in den Kolben geben und 10 min in einem CO2 - Inkubator inkubieren.
- Tippen Sie auf den Kolben, um zu überprüfen, ob sich JIMT-1-Zellen nach der Inkubationszeit abgelöst haben.
- Verwenden Sie 2 ml JIMT-1-Medium, um den Aufschluss zu stoppen und die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen aufzufangen.
- Zählen Sie die Zellen in einer Bürker-Kammer mit 0,4 % Trypanblau (80 μL des Farbstoffs + 20 μL der Zellsuspension) und stellen Sie die Zellzahl auf 20.000 Zellen/mL ein.
- 100 μl der Zellsuspension (2000 Zellen/Well) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte pipettieren (vorbeschichtet mit 0,5%iger Agarose-PBS-Lösung, wie in 1.1 angegeben).
- Lassen Sie die Zellen während einer 3-tägigen Inkubationszeit bei 37 °C in einem CO2 - Inkubator verklumpen.
- Überprüfen Sie regelmäßig die Größe und Form von Sphäroiden mit einem inversen Mikroskop.
2. Beschichtung der HCS-Platte
HINWEIS: Um das Anhaften von JIMT-1-EGFP-Sphäroiden an der Glasoberfläche der Platte zu verhindern, ist die Beschichtung der High-Content-Screening-Platte (HCS) von entscheidender Bedeutung (andernfalls wäre eine High-Content-Analyse nicht möglich).
- Am Tag 3 nach der Induktion der Sphäroide wird die 96-Well-High-Content-Screening-Platte mit Pluronic-F127 (0,5 % in DMSO, 50 μl/Well) beschichtet und die Platte 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
- Saugen Sie die Beschichtungslösung an und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit DMEM/F-12-serumfreiem Medium (100 μl/Well).
3. Übertragung von Sphäroiden auf die HCS-Platte
- Übertragen Sie die Sphäroide mit einer 1-ml-Pipette in dreifacher Ausführung auf die 96-Well-HCS-Platte mit Glasboden.
4. Vorbehandlung von JIMT-1 EGFP-Sphäroiden mit Testverbindungen
- Die Testverbindung (z. B. Sunitinib, verdünnt in DMSO in einer Konzentration von 40 μM) wird durch Pipettieren von 10 μl/Well zugegeben und 10 μl frisches JIMT-1-Medium in die Kontrollvertiefungen (CTL) gegeben.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 h in einem CO2 - Inkubator bei 37 °C.
5. Induktion von ADCC durch Zugabe der Effektorzellen
ANMERKUNG: CD16.176V.NK92-Zellen (im Folgenden als NK-Zellen bezeichnet) wurden in α-MEM kultiviert, die mit 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-Pyruvat, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 100 IE/ml IL-2 ergänzt wurden.
- Die NK-Zellen im Kolben werden in ein 15-ml-Röhrchen gefüllt. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau (80 μl des Farbstoffs + 20 μl der Zellsuspension) und stellen Sie die Zelldichte auf ein Effektor-zu-Ziel-Verhältnis (E:T) von 20:1 (40.000 NK-Zellen/Well) ein.
- Die NK-Zellen werden mit 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL in 1 mL α-MEM NK-Medium) gefärbt und 1 h lang bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator gegeben.
- Die NK-Zellen werden zweimal bei 150 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um den Überschuss des Farbstoffs mit 1 ml α-MEM-Medium zu waschen.
- Resuspendieren Sie das NK-Zellpellet in 1 ml frischem JIMT-1-Medium.
- Die gefärbten NK-Zellen werden zusammen mit dem Anti-HER2-Antikörper (Ab) (Trastuzumab, gelöst in steril destilliertemH2O) zu den Ziel-JIMT-1-Sphäroiden hinzugefügt, indem 55 μl/Well CTB-gefärbte NK-Zellen und 55 μl/Well 10 μg/ml Ab in JIMT-1-Medium pipettiert werden (das Gesamtvolumen der für das ADCC hinzugefügten Behandlung beträgt 110 μl/Well und die endgültige Sunitinib-Konzentration beträgt 20 μM).
ANMERKUNG: Für die Auswahl der Ab-Konzentration und des E:T-Verhältnisses haben wir uns auf unsere vorherige Veröffentlichung17 gestützt. Vorläufige Experimente wurden mit verschiedenen E:T-Verhältnissen und Konzentrationen von Trastuzumab durchgeführt, um zu beurteilen, welches Trastuzumab am effektivsten bei der Induktion von ADCC in Sphäroiden war (Ergänzende Abbildung S1). - Geben Sie 110 μl/Well frisches JIMT-1-Medium in die Kontrollvertiefungen (CTL).
- Inkubieren Sie die Platte für 24 h in einem CO2 - Inkubator bei 37 °C.
ANMERKUNG: Da bekannt ist, dass NK92-Zellen unspezifische zytotoxische Funktionen ausüben, werden zur Kontrolle JIMT-1-Zellen verwendet, die sowohl mit NK-Zellen allein als auch mit einer Isotypkontrolle oder einem F(ab')2 Ab co-inkubiert wurden. Hier wurde F(ab')2-Trastuzumab (TR-F(ab')2) als negatives CTL verwendet. Das TR-F(ab')2-Fragment wurde, wie von Tóth et al.19 berichtet, hergestellt und im gleichen Volumen wie Trastuzumab zusammen mit NK-Zellen zugegeben, wie in 5.5 beschrieben. Die Konzentration wurde auf 6,6 μg/ml angepasst, was einer äquimolaren Konzentration mit Trastuzumab23 entspricht.
6. Annexin V-647 Färbung von Sphäroiden
- Um den apoptotischen Zelltod zu messen, färben Sie die Sphäroide mit dem Konjugat Annexin V-Alexa Fluor 647 für 1 h in JIMT-1-Medium (1:100) durch Pipettieren von 50 μl/Well.
7. Bildgebung
HINWEIS: Die Platte wird 24 Stunden nach der Zugabe der NK-Effektorzellen zu den Zielzellen abgebildet. Für die Bildgebung werden ein High-Content Analyzer und eine Bildanalysesoftware verwendet.
- Wählen Sie den Typ der Mikroplatte aus der Liste der Platten mit der Option Plattentyp aus. Verwenden Sie eine 96-Well-High-Content-Screening-Platte (HCS).
- Wählen Sie den Autofokus mit zwei Spitzen aus, da der Assay in Platten mit einem 10-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,3 durchgeführt wird, wobei die Optionen Autofokus bzw. Objektiv verwendet werden. Wählen Sie den konfokalen Modus mit der Option "Opt.-Modus " und wenden Sie Binning 2 mit der Option "Binning" an.
- Wählen Sie für die Bildgebung von Sphäroiden die entsprechenden Kanäle mit der Option Kanalauswahl aus. Um die EGFP-transduzierten JIMT-1-Zellen zu detektieren, wählen Sie EGFP (Integrationszeit 200 ms, Laserleistung 50 %, Stapelhöhe 2,0 μm; z. B.: 488 nm em: 500-550 nm) und zum Nachweis apoptotischer Zellen verwenden Sie Alexa 647 (Integrationszeit 100 ms, Laserleistung 50 %, Stapelhöhe 10,0 μm; z. B.: 640 nm em: 650-760 nm). Um die NK-Zellen innerhalb der Sphäroide sichtbar zu machen, wählen Sie den folgenden Kanal: DAPI (Integrationszeit 100 ms, Laserleistung 50%, Stapelhöhe 2,0 μm; Bsp.: 405 nm em: 435-480 nm).
- Wählen Sie in der Option Layoutauswahl die Option Z-Stapel aus, da sich die Zellen in den Sphäroiden in der Regel auf unterschiedlichen Fokusebenen des Mikroskops befinden. 10 Ebenen (mit einem Abstand von 10 μm) reichen aus, um den gesamten Sphäroidbereich abzudecken. Stellen Sie die Werte der ersten und letzten Ebene auf 0 μm bzw. 90 μm ein.
HINWEIS: Vor Beginn der Messung können mit der Schnappschussfunktion Beispielbilder aufgenommen werden, um die korrekten Einstellungen zu überprüfen. - Legen Sie die Anzahl der Wells und Felder für die Bildgebung mit der Option Layout definieren fest.
8. High-Content-Analyse (HCA)
HINWEIS: Analysieren Sie die Bilder mit der Harmony-Software oder exportieren Sie die Bilder zur Analyse mit einer bevorzugten Software eines Drittanbieters. Für die Analyse der ADCC-Effizienz wird die Fluoreszenzintensität von Annexin V 647 gemessen. Zielzellen, die durch ADCC abgetötet werden, erscheinen im peripheren Bereich der Sphäroide. Daher werden die Annexin-V-positiven Zellen in diesem Sphäroid-"Ring" gemessen. Um diese Methode zu validieren, wurden Analysen mit verschiedenen Parametern durchgeführt, um zu beurteilen, welcher der zuverlässigste ist und die besten Ergebnisse liefert (Ergänzende Abbildung S2). Im Video wird ein ADCC-Well gezeigt, um den Bildanalyseprozess Schritt für Schritt zu demonstrieren.
- Identifizieren Sie die Sphäroide anhand der EGFP-Fluoreszenz von JIMT-1-Zellen mit der Option " Texturbereiche suchen " und filtern Sie sie nach Größe (> 25.000 μm2).
- Entfernen Sie Rahmenobjekte mit der Option "Population auswählen ".
- Da Annexin-V-positive (apoptotische) Zellen an der Peripherie von Sphäroiden auftreten, ist die Annexinintensität in diesem apoptotischen "Ring" zu messen, der durch die Option Region auswählen (äußerer Rand -90%) ausgewählt wird, um den apoptotischen Zelltod zu bestimmen.
- Die Intensitätswerte des Anhangs V werden als mittlere Intensität angegeben.
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Representative Results
EGFP-exprimierende JIMT-1-Zellen wurden erzeugt und aus diesen Zellen wurden Sphäroide gezüchtet. Sunitinib wurde als Testsubstanz verwendet, da zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf von ADCC17 beeinflusst. Die Sphäroide wurden 72 h lang verklumpen gelassen. An Tag 3 wurden 10 μg/ml Trastuzumab (oder äquimolare 6,6 μg/ml TR-F(ab')219) und NK-Zellen (20:1) in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 μM Sunitinib (1 h Vorbehandlung) für eine Gesamtzeit von 24 Stunden zu den Sphäroiden hinzugefügt. Als CTLs wurden JIMT-1 allein und JIMT-1, das mit NK-Zellen (20:1) co-inkubiert wurde, verwendet. Die Sphäroide wurden mit Annexin V 647 für 1 h gefärbt, um den apoptotischen Zelltod zu detektieren und wurden dann mit einem High-Content Analyzer abgebildet.
Wie die Annexin-V-Färbung zeigte, verursachte die Zugabe von NK-Zellen zusammen mit Trastuzumab zu den JIMT-1-Zellen den Zelltod in den Tumorsphäroiden. Annexin-positive (apoptotische) Zellen entstanden in der peripheren Zone der Sphäroide, wie in Abbildung 3A zu sehen ist. Andererseits führte die alleinige Zugabe von NK-Zellen nicht zu einer Apoptose der Tumorzellen. Um zwischen der Fähigkeit von Trastuzumab, ADCC zu rekrutieren, und seiner direkten biologischen Wirkung zu unterscheiden, wurde TR-F(ab')2 ohne funktionelle FcR-Bindungsfähigkeit als Negativkontrolle von Trastuzumab verwendet. Da sich TR-F(ab')2 in diesem Modell als unwirksam erwiesen hat (Abbildung 3B), ist es wahrscheinlich, dass der Effekt über ADCC vermittelt wird. Darüber hinaus reduzierte die Vorbehandlung mit Sunitinib die Annexin-V-Färbung in den Sphäroiden, was die Sunitinib-induzierte ADCC-Resistenz bestätigte und die Verhinderung des apoptotischen Zelltods in JIMT-1-Sphäroide, die mit NK-Zellen und Trastuzumab koinkubiert wurden, aufzeigte.
Abbildung 3. Detektion von ADCC-Effektorverbindungen in einem 3D-Sphäroidmodell. Tumorsphäroide wurden mit JIMT-1-EGFP-Zellen erzeugt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Sphäroide auf eine HCS-Platte übertragen, die zuvor mit Pluronic F-127 beschichtet war, um die Zellanhaftung zu verhindern. Am nächsten Tag 10 μg/ml Trastuzumab (TR) (oder äquimolare 6,6 μg/ml TR-F(ab')2 als negative CTL) und NK92. CD16-Zellen (vorgefärbt mit Cell Tracker Blue) wurden in die Wells gegeben (E:T-Verhältnis von 20:1), in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 μM Sunitinib (SUN). Als CTLs wurden JIMT-1-Sphäroide allein und JIMT-1-Sphäroide, die mit NK-Zellen (20:1) co-inkubiert wurden, verwendet. (A) Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde Annexin V 647 (rote Farbe) verwendet, um die Sphäroide für 1 h zu färben, um apoptotische Zellen sichtbar zu machen. (B) Es wurden Bilder von 3 Sphäroiden aufgenommen und auf die Fluoreszenzintensität von Annexin V 647 im peripheren Bereich der Sphäroide (Ringregion) analysiert. Das Histogramm zeigt 4 unabhängige Experimente (Mittelwert±SEM). Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test analysiert, gefolgt von dem Post-hoc-Test von Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Diese Daten bestätigen, dass Sunitinib ADCC hemmt. Es wird erwartet, dass ADCC-verstärkende Verbindungen auf ähnliche Weise identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser HCS-Assay für die Identifizierung von Verbindungen geeignet sein kann, die ADCC beeinflussen.
Ergänzende Abbildung S1. Optimierung des E:T-Verhältnisses und der Trastuzumab-Konzentration. JIMT-1-EGFP-Zellen wurden zur Erzeugung von Sphäroiden verwendet. An Tag 3 wurden Sphäroide auf eine HCS-Platte übertragen und NK-Zellen in verschiedenen E:T-Verhältnissen (20:1, 40:1 und 60:1) mit 10, 20 und 50 μg/ml Trastuzumab (TR) hinzugefügt, um zu sehen, welche die wirksamste Behandlung war, die den Zelltod in den Sphäroiden induzieren konnte. Die Kontrollgruppe (JIMT-1-EGFP) wurde mit JIMT-1-Zellkulturmedien behandelt. (A) Nach 24 h wurden die Zellen 1 h lang mit Annexin V 647 (rote Farbe) gefärbt und der apoptotische Zelltod mit HCA gemessen. Die Histogramme zeigen 3 unabhängige Experimente (Mittelwert±SEM). Die Säulen repräsentieren die Intensität von Annexin V 647 um die JIMT-1-Sphäroide. (B) Bilder von 3 Sphäroiden wurden auf die Annexin V 647 Intensität der Ringregion analysiert. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2. Evaluierung der Apoptose von JIMT-1-Zellen in den Sphäroiden. JIMT-1-EGFP-Zellen wurden zur Erzeugung von Sphäroiden verwendet. An Tag 3 wurden die Sphäroide auf eine HCS-Platte übertragen und 1 h lang mit 20 μM Sunitinib (SUN) vorbehandelt, dann wurden NK-Zellen im E:T-Verhältnis von 20:1 mit 10 μg/ml Trastuzumab zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen für 1 h mit Annexin V 647 gefärbt und der apoptotische Zelltod mit HCA gemessen. Bilder von 3 Sphäroiden wurden auf die Intensität von Annexin V 647 analysiert (Kontrolle: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK-Zellen+10 μg/ml Trastuzumab, ADCC+SUN: 20 μM Sunitinib+20:1 NK-Zellen+10 μg/ml Trastuzumab). Die Säulen repräsentieren die Intensität von Annexin V 647 um die JIMT-1-Sphäroide ( Ring) (A), im gesamten Sphäroid (B) und im gesamten Well (C). Die Histogramme zeigen 3 unabhängige Experimente (Mittelwert±SEM). Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Trotz erheblicher Verbesserungen bei der Behandlung von BC in den letzten Jahrzehnten entwickeln Patienten immer noch regelmäßig Medikamentenresistenzen oder leiden unter negativen Nebenwirkungen24. Die hohe Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit BC erfordern eine kontinuierliche Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, ebenso wie robuste Screening-Plattformen, um neue Moleküle zu identifizieren, die für die therapeutische Entwicklung geeignet sind25. Diese Strategien erfordern zellkulturbasierte translationale Assays. 3D-Tumorkultursysteme wie Sphäroide und Tumororganoide haben sich in jüngster Zeit als kostengünstige, einfach zu implementierende Modelle herausgestellt, die Schlüsselaspekte der Tumorpathophysiologie besser abbilden als herkömmliche Monolayer-Kulturen. Eines dieser Merkmale ist die räumlich koordinierte Interaktion zwischen verschiedenen tumorassoziierten Immunzellen und Krebszellen. Dies macht 3D-Kokulturmodelle zu überlegenen Werkzeugen für das Wirkstoff-Screening, die auf Modulatoren ausgerichtet sind, die auf Immunzellen zur Behandlung von Malignomen wirken26.
In dieser Arbeit haben wir ein neuartiges Sphäroidmodell für NK-Zell-vermitteltes Trastuzumab-abhängiges ADCC gegen JIMT-1-Mammakarzinomzellen vorgestellt und einen automatisierten Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung der NK-Zell-vermittelten Krebszellabtötung beschrieben. Das Verfahren wurde für einen High-Content-Imager und eine Bildanalysesoftware implementiert, mit der die krankheitsrelevante Fähigkeit der NK-Zellen, die Apoptose von Krebszellen zu induzieren, überwacht werden kann. Der multitargetierte Tyrosinkinase-Inhibitor Sunitinib wurde bereits in 2D-Zellkultur-Assays als Wirkstoff identifiziert, der eine Resistenz gegen Trastuzumab-abhängiges ADCC in JIMT-1-Zellen induziert. Sunitinib beeinträchtigt die Abtötungsfunktion von NK-Zellen und induziert Autophagie, Herunterregulierung der HER2-Expression und verbessert die Adhärenz von JIMT-1-Zellen17. Um unsere Sphäroid-Analyse-Pipeline für die Identifizierung von Substanzen zu validieren, haben wir Sunitinib als Modellsubstanz getestet und zeigen, dass es die Fähigkeit von NK-Zellen, die Krebszell-Sphäroide abzutöten, signifikant beeinträchtigen kann, indem es den Effekt reproduziert, den es in Monolayern gezeigt hat.
Unsere Methode ist einfach und umfasst die Züchtung von Sphäroiden in Agarose-beschichteten 96-Well-Gewebekulturplatten, einen einmaligen Transfer der gebildeten Sphäroide in eine Glasboden-Mikroplatte, die für HCS- und HCA-Anwendungen geeignet ist, die Zugabe von Testsubstanzen und der separat gefärbten NK-Zellen, die durch die Verabreichung von Trastuzumab zum Abtöten aktiviert werden, eine einstufige Zelltodfärbung und die mikroskopische Analyse. Nach Beginn der Kokultivierung der beiden Zelltypen und der medikamentösen Behandlung werden keine schwerwiegenden Manipulationen an den Vertiefungen vorgenommen, um eine Beeinträchtigung der Integrität der Sphäroide zu vermeiden. Die Durchführung des Assays dauert nur 4 Tage. Die Beschichtung des Bodens von 96-Well-Gewebekulturplatten mit 1 % niedrigschmelzender Agarose als Teil des Verfahrens ist eine kostengünstige Alternative zur Verwendung von Platten mit extrem niedriger Befestigung, um zu verhindern, dass JIMT-1-Zellen an der Oberfläche der Platte haften, und um die spontane Organisation der Tumorzellen zu Sphäroiden zu fördern. Da eine Bildaufnahme über das Agarosekissen und die U-förmige Kunststoffoberfläche nicht möglich ist, mussten die Sphäroide in die Speicherfolie übertragen werden. Entscheidend war die Passivierung der Glasoberfläche der HCS-Platte mit dem bioinerten Tensid Pluronic-F127 vor dem Sphäroidtransfer. Ohne diesen Schritt breiten sich Sphäroide auf dem Boden der Vertiefungen aus, was die Bildgebung und Analyse erschwert.
Eine humane Tumorzelllinie, die EGFP stabil exprimiert, wurde zur Bildung von Sphäroiden verwendet17. Der genetisch kodierte Marker bietet während des gesamten Protokolls eine anhaltende Fluoreszenz anstelle von Zellfärbungen. Die unüberwachte Texturanalyse des EGFP-Signals liefert die Grundlage für die Erkennung des kompakten Kerns der Sphäroide, der das gesamte Sphäroid ohne Zelltodinduktion umfasst. Bei der Zugabe von NK-Zellen und der Induktion von ADCC stellte der deutliche Zerfall der Konturen manchmal eine Herausforderung für den Bildanalysealgorithmus dar, um die Umrisse des Sphäroids zu zeichnen. Da Annexin-V-positive Zellen hauptsächlich an der Peripherie der Sphäroide gefunden wurden, wurde dieses Problem umgangen, indem der Zelltod in einer peripheren ringförmigen Region ausgewertet wurde, die durch das eingebaute Bildsegmentierungsmodul der Software erzeugt wurde, indem der gut definierte Sphäroidkern erweitert wurde. Der Expansionsfaktor, der die äußere Grenze dieses Bereichs definiert, wurde so gewählt, dass er in allen Fällen den Halbschatten sterbender, geschredderter und zerstreuter Zellen umfasst, nachdem Hunderte von Sphäroidbildern visuell kuratiert wurden. Die Bestimmung der Gesamtfluoreszenz der apoptotischen Ringfläche in den maximalen Projektionen von Z-Stapelbildern ergab geringere experimentelle Fehler und einen ausgeprägteren ADCC-Effekt als die Messung des gesamten Sphäroidbereichs oder des gesamten Well-Bereichs (Ergänzende Abbildung S2). Fluoreszenzmarkierungen wurden für die Markierung der BC-Zellen (EGFP) und den Zelltod (Alexa 647) gewählt, um die Notwendigkeit einer Kanaltrennung auszuschließen. Es wurde eine Endpunktauslesung auf der Grundlage der Fluoreszenzmarkierung für exponiertes Phosphatidylserin, einen apoptotischen Marker, gewählt, im Gegensatz zur Überwachung der Abnahme der EGFP-Fluoreszenz, um die Lebensfähigkeit von Sphäroiden im Laufe der Zeit zu bestimmen, was eine weitere Option sein könnte. Die Annexin-Färbung ermöglichte eine genauere und sensitivere Identifizierung des Zelltods. Prinzipiell ist es möglich, den derzeitigen eindimensionalen Färbeansatz zu verbessern, indem man ihn mit zusätzlichen, präziseren Zelltodmarkern ergänzt, die die Zelltodmodalität (z.B. fluoreszierende Caspasesubstrate) und den abgestorbenen Zelltyp identifizieren können.
Diese Methode kann mit minimalen Änderungen modifiziert werden, um andere Effektor-Immunzelltypen (Makrophagen, T-Zellen und chimäre Antigenrezeptor [CAR]-exprimierende Immunzellen) und Aktivatormoleküle (z. B. Zytokine, Interleukine) zu untersuchen. Mit dem Ziel der Einfachheit, Robustheit und kurzen Verarbeitungszeit haben wir die Möglichkeiten, die HCA für diesen Assay bieten kann, nicht ausgeschöpft. Die Bildgebungs- und Analyseprotokolle können mit weiteren Fluoreszenzmarkierungen versehen werden. Dieser Assay ist anpassungsfähig, um komplexere Sphäroide zu untersuchen, indem verschiedene Zelltypen hinzugefügt und Multiplex-Fluoreszenzsonden verwendet werden, um diese Zelltypen und spezifische Fluoreszenzmarker zu unterscheiden, um sie mit laufenden zellulären Ereignissen zu verknüpfen 4,5. Das Protokoll kann an jeden HC-Imager angepasst werden und die Bilder können mit jeder Bildanalysesoftware analysiert werden, die ein Texturanalysemodul enthält.
Ein wichtiger Aspekt für die Bedeutung dieses Protokolls ist die Verwendung von Sphäroiden. Daher müssen eine Reihe von Parametern berücksichtigt werden. Es ist bekannt, dass Zellen in 3D-Kultur im Vergleich zu Zellen, die in Monoschichten gezüchtet wurden, eine abgeschwächte Reaktion auf Verbindungen zeigen21,22. Die Verwendung von 2D-Zellkulturen erlaubt es nicht, den effektiven Konzentrationsbereich eines getesteten Wirkstoffs im gesamten Organismus vorherzusagen. Bei der Erstellung unseres 3D-Modells haben wir höhere Verbindungskonzentrationen und E:T-Verhältnisse getestet als in 2D. Zum Beispiel wurde das Protokoll optimiert, indem das E:T-Verhältnis von 2:1, das in unserem 2D-ADCC-Assay17 verwendet wurde, auf 20:1 für die Krebssphäroide erhöht wurde. Der Grund dafür könnte sein, dass die Medikamente nicht in der Lage waren, den Kern der Sphäroide effektiv zu durchdringen, sondern hauptsächlich die Zellen der äußeren Schichten betrafen. Andererseits führte eine Erhöhung der Trastuzumab-Konzentration nicht zu einer weiteren Verstärkung des ADCC-Ansprechens (Ergänzende Abbildung S1). Diese Auswahl kann je nach Zelllinie und Ziel unterschiedlich sein. Daher wäre es interessant, dieses Protokoll an anderen Zelllinien zu testen, z. B. an einer Nicht-HER2-BC-Zelllinie, wobei zu berücksichtigen ist, dass das HER2-Expressionsniveau eine wichtige Determinante für die ADCC-Antwortist 20.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere neue Methode eine schnelle und robuste Plattform darstellt, um die Wirkung von Wirkstoffen in einem 3D-Immunkrebsmodell zu analysieren, mit dem Potenzial, für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening verwendet zu werden. Dies unterstreicht die Relevanz der Verwendung von HER2+ BC-Sphäroiden und NK92. CD16-Zellen bei der weiteren Verbesserung des Verständnisses der molekularen Mechanismen von Trastuzumab und bieten somit die Möglichkeit, die Wirksamkeit von Trastuzumab-abhängigen ADCC in vivo zu antizipieren 27. Die Suche nach neuen Anti-Tumor-Immunmodulatoren kann von diesem Assay stark profitieren. Die Methode kann auf personalisierte Chemosensitivitätstests von patienteneigenen Tumorzellkulturen ausgeweitet werden. Wir haben gezeigt, dass die traditionellen 2D-Co-Kulturen, die in den Immunzellabtötungs- und ADCC-Tests verwendet werden, in 3D-Sphäroid-Assays umgewandelt werden können, was ihre translationale Relevanz erhöhen könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklärten, dass keine Interessenkonflikte vorlägen.
Acknowledgments
LV erhielt Mittel aus den Zuschüssen des Nationalen Amtes für Forschung, Entwicklung und Innovation GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 und K147482. Dieses Projekt wurde vom Ungarischen Forschungsnetzwerk HUN-REN gefördert. CD16.176V.NK-92-Zellen wurden von Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, im Auftrag von Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sind weltweit durch Patente geschützt und wurden von Nantkwest, lnc lizenziert. (www.nantkwest.com). Die Autoren danken György Vereb und Árpád Szöőr für ihre Hilfe bei der Verwendung der NK-92-Zelllinie und des TR-F(ab')2 sowie für die technische Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
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