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Biology

सेल चक्र के जी 1 चरण में एकल-फंसे डीएनए foci की कल्पना करना

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65926
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,4,5
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, NYU Grossman School of Medicine, 2The Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health, 3Department of Cell Biology, NYU Grossman School of Medicine, 4Howard Hughes Medical Institute, NYU Grossman School of Medicine, 5Institute of Enzymology, Centre of Excellence of the Hungarian Academy of Sciences, HUN-REN Research Centre for Natural Sciences

Summary

निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन का उपयोग सेल चक्र के G1 चरण में एकल असहाय डीएनए foci का पता लगाने RPA2 immunofluorescent धुंधला द्वारा पीछा प्रस्तुत करता है.

Abstract

डीएनए में समर्पित सेलुलर मरम्मत मार्ग हैं जो घावों से मुकाबला करने में सक्षम हैं जो अंतर्जात और / या बहिर्जात स्रोतों दोनों से उत्पन्न हो सकते हैं। डीएनए की मरम्मत के लिए कई प्रोटीनों के बीच सहयोग की आवश्यकता होती है, जो डीएनए घाव की उपस्थिति को पहचानने और संकेत देने से लेकर शारीरिक रूप से मरम्मत करने तक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करने के लिए जिम्मेदार होते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, एकल-फंसे डीएनए (ssDNA) के ट्रैक अक्सर बनाए जाते हैं, जो अंततः डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा भरे जाते हैं। इन एसएसडीएनए पटरियों की प्रकृति (लंबाई और संख्या दोनों के संदर्भ में), इन अंतरालों को भरने के लिए भर्ती किए गए पोलीमरेज़ के साथ, मरम्मत मार्ग-विशिष्ट हैं। इन ssDNA पटरियों के दृश्य हमें डीएनए की मरम्मत तंत्र की जटिल गतिशीलता को समझने में मदद कर सकते हैं.

यह प्रोटोकॉल जीनोटॉक्सिक तनाव पर ssDNA foci गठन को मापने के लिए G1 सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है। उपयोग में आसान इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम आरपीए 2 के लिए धुंधला करके एसएसडीएनए की कल्पना करते हैं, जो हेटरोट्रिमेरिक प्रतिकृति प्रोटीन ए कॉम्प्लेक्स (आरपीए) का एक घटक है। RPA2 ssDNA मध्यवर्ती को बांधता है और स्थिर करता है जो डीएनए की मरम्मत और डीएनए क्षति चेकपॉइंट सक्रियण को नियंत्रित करने के लिए जीनोटॉक्सिक तनाव या प्रतिकृति पर उत्पन्न होता है। 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) धुंधला किसी भी एस चरण कोशिकाओं को बाहर करने के लिए डीएनए प्रतिकृति की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल पारंपरिक, गैर-विकृतीकरण 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू)-आधारित परख के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है और एस चरण के बाहर एसएसडीएनए फ़ॉसी का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल है।

Introduction

जीवन को बनाए रखने के लिए, कोशिकाएं अपनी जीनोमिक अखंडता को बनाए रखने के लिए डीएनए का लगातार सर्वेक्षण और मरम्मत करती हैं। डीएनए तनावों के अंतर्जात (जैसे, ऑक्सीकरण, क्षारीकरण, डीमिनेशन, प्रतिकृति त्रुटियों) और बहिर्जात (जैसे, यूवी, आयनकारी विकिरण) दोनों स्रोतों के कारण कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के डीएनए क्षति जमा कर सकती हैं। इन घावों की मरम्मत में विफलता के परिणामस्वरूप या तो एपोप्टोसिस, सेल चक्र गिरफ्तारी, या बुढ़ापा होता है और बीमारियों का कारण बन सकताहै। डीएनए घावों को निम्नलिखित मुख्य डीएनए मरम्मत मार्गों में से किसी एक द्वारा संबोधित किया जा सकता है: डीआर (डायरेक्ट रिवर्सल रिपेयर), जो मुख्य रूप से अल्काइलेटेड बेस2 की मरम्मत करता है; बीईआर (बेस एक्सिशन रिपेयर), जो गैर-भारी डीएनए बेस त्रुटियों और एकल-फंसे डीएनए ब्रेक (एसएसबी) को लक्षित करता है3; एनईआर (न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत) भारी, हेलिक्स-विकृत डीएनए घावों को सही करना4; एमएमआर (बेमेल मरम्मत) मुख्य रूप से डीएनए बेमेल, सम्मिलन/विलोपन लूप (आईडीएल), और कुछ आधार क्षति को लक्षित करना5; NHEJ (नॉन-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग) और HRR (होमोलॉगस रिकॉम्बिनेशन रिपेयर) जो दोनों डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए ब्रेक (DSBs)6 पर सक्रिय हैं; और टीएलएस (अनुवाद संश्लेषण), जो एक डीएनए घाव बाईपास तंत्र7 है। हालांकि इन मार्गों में अलग-अलग सब्सट्रेट विशिष्टताएं हैं, लेकिन कुशल मरम्मत के लिए अतिरेक सुनिश्चित करने के लिए उनके बीच कुछ ओवरलैप हैं। विभिन्न सेल चक्र चरणों में विभिन्न डीएनए मरम्मत मार्गों की कार्रवाई को समझना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये डीएनए मरम्मत कारक कैंसर, उम्र बढ़ने और तंत्रिका संबंधी विकारों के इलाज के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए आवश्यक लक्ष्यके रूप में काम कर सकते हैं।

अंतर्जात और बहिर्जात डीएनए-हानिकारक एजेंटों दोनों द्वारा उत्पन्न डीएनए घावों की मरम्मत के कारण पूरे सेल चक्र में एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) उत्पन्न होते हैं। जीनोटॉक्सिक तनाव पर, एसएसडीएनए एस और जी 2 चरणों में बहुतायत से उत्पन्न होता है जहां एचआरआर और एमएमआर की उच्चतम गतिविधि होती है और जब प्रतिकृति मशीनरी स्टालों या ढह जाती है जब डीएनए घावों का सामना करना पड़ता है 6,10,11. अन्य डीएनए मरम्मत रास्ते (जैसे, एनएचईजे / माइक्रोहोमोलॉजी-मध्यस्थता अंत में शामिल होने (एमएमईजे / एकल स्ट्रैंड एनीलिंग [एसएसए]) भी डीएसबी मरम्मत12 के दौरान एसएसडीएनए उत्पन्न करते हैं। ये ssDNA ट्रैक आमतौर पर डीएनए लकीर से उत्पन्न होते हैं, जो HR और MMR के दौरान EXO1, DNA2, और CtIP जैसे एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा किए जाते हैं, NER के दौरान XPF और XPG जैसे एंडोन्यूक्लाइजेस, या BER 4,13,14,15,16,17,18,19 के दौरान POLB और FEN1 की संयुक्त कार्रवाई के माध्यम से . प्रतिकृति मशीनरी के काम के कारण, ssDNA ट्रैक भी उत्पन्न होते हैं जब डीएनए हेलिकेज़ PCNA-बाध्य प्रतिकृति पोलीमरेज़20 के सामने डीएनए को खोलते हैं। इसके विपरीत, जी 1 चरण में, एचआरआर और डीएनए प्रतिकृति की कमी और एमएमआर की सीमित गतिविधि उत्पन्न एसएसडीएनए पटरियों की सीमा को कम करती है और इसलिए10,11,21 का पता लगाने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हैं।

सेलुलर ssDNA ट्रैक अत्यधिक संवेदनशील संरचनाएं हैं जिन्हें DSB के गठन से बचने के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए। यह आरपीए के साथ ssDNA पटरियों को कोटिंग करके प्राप्त किया जाता है। RPA एक प्रचुर मात्रा में हेटेरोट्रिमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो कई सबयूनिट्स (RPA1, RPA2, और RPA3, जिसे क्रमशः RPA70, RPA32 और RPA14 भी कहा जाता है) से बना है, जो पूरे सेल चक्र22 में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए जाते हैं। प्रत्येक RPA सबयूनिट में एक डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (DBD) होता है, जो 4-6 न्यूक्लियोटाइड के साथ बातचीत करने में सक्षम होता है, और संयुक्त सबयूनिट्स एक स्थिर ट्रिमराइजेशन कोर बनाते हैं। कुल मिलाकर, आरपीए उप-नैनोमोलर आत्मीयता 23,24के साथ लगभग 20-30 न्यूक्लियोटाइड को बांधता है।

पारंपरिक तरीकों immunofluorescence (आईएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) BrdU एंटीबॉडी25 का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए में शामिल लेबल द्वारा ssDNA foci कल्पना करने के लिए. यह दृष्टिकोण इस तथ्य पर निर्भर करता है कि BrdU एंटीबॉडी केवल उजागर ssDNA25 में BrdU का पता लगा सकते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण सीधा है, यह कुछ सीमाओं को भी प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को प्रयोग की शुरुआत से पहले BrdU को शामिल करने के लिए पूर्वनिर्धारित किया जाता है, जो समय लेने वाली है और डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। इसलिए, BrdU- आधारित ssDNA डिटेक्शन कोशिकाओं की प्रतिकृति तक सीमित है और इसका उपयोग मौन कोशिकाओं के लिए नहीं किया जा सकता है। यह कैंसर और neurodegeneration 5,26 जैसे कई रोगों में अपने महत्व के बावजूद गैर प्रतिकृति कोशिकाओं में डीएनए की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति के आवेदन को बाहर करता है. इसके अतिरिक्त, क्योंकि BrdU और EdU की संरचनाएं बहुत समान हैं, अधिकांश BrdU एंटीबॉडी EdU की ओर क्रॉसरिएक्टिविटी प्रदर्शित करते हैं, जिसे दोहरी लेबलिंग प्रयोगों27 के लिए लक्ष्य करते समय विचार किया जाना चाहिए। RPA धुंधला पहले ssDNA foci मुख्य रूप से एस चरण कोशिकाओं में दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालाँकि, कुछ कागजात ने एस चरण 28,29,30,31,32,33,34,35 के बाहर भी इसका सफलतापूर्वक उपयोग किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कुशलता से आरपीए के गुणों का उपयोग करता है, जिससे कोशिका चक्र के जी 1 चरण में डीएनए क्षति के बाद एसएसडीएनए फॉसी के दृश्य की अनुमति मिलती है (हालांकि इसका उपयोग सभी सेल चक्र चरणों में किया जा सकता है)।

Protocol

1. hTERT-अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (RPE1) का रखरखाव

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में RPE1 सेल लाइनों को बनाए रखने 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (हाय FBS) और 100 μg / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अब से संवर्धन माध्यम के रूप में संदर्भित) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में पूरक है. नियमित संवर्धन के लिए, एक 15 सेमी ऊतक संस्कृति इलाज पकवान में RPE1 कोशिकाओं को विकसित और विभाजित जब 80-90% संगम (~ 16-18 × 106 कोशिकाओं प्रति 15 सेमी पकवान) तक पहुँचने.
  2. विभाजन करते समय, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ कुल्ला।
  3. डिश की पूरी सतह को कवर करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि वे अलग न हो जाएं।
  4. Trypsinization के बाद, संवर्धन माध्यम के साथ कोशिकाओं resuspended और कमरे के तापमान (आरटी, 22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर उन्हें नीचे स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे संवर्धन माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं resuspend.
  5. बीज 1.6-1.8 × 106 कोशिकाओं को एक नए 15 सेमी डिश (सेल निलंबन के ~ 1 एमएल) में।
    नोट: सभी टिशू कल्चर कार्य बीएसएल-2 सुरक्षा स्तरों के तहत किए जाने चाहिए। ट्रिप्सिनाइजेशन के लिए इनक्यूबेशन समय सेल संगम पर निर्भर करता है। आमतौर पर, प्रक्रिया एक 90% संगम प्लेट के लिए पूरा करने के लिए 2-3 मिनट लगते हैं. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ नियमित रूप से माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए कोशिकाओं की जांच की जानी चाहिए ( सामग्री की तालिका में उदाहरण देखें)।

2. siRNA ब्याज के जीन नीचे दस्तक (GOI)

  1. बीज 1.0 × 106 RPE1 कोशिकाओं में एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति अभिकर्मक से पहले दिन पर संवर्धन माध्यम के 10 एमएल के साथ थाली का इलाज किया.
  2. अभिकर्मक के दिन, जटिल siRNA. 10 सेमी प्लेट के लिए, कम सीरम अभिकर्मक माध्यम के 500 माइक्रोन में 20 एनएम siRPA2 और लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 12 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें। धीरे ट्यूब flicking और 5 मिनट के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर सेते द्वारा सभी घटकों मिश्रण.
  3. कोशिकाओं dropwise करने के लिए जटिल siRNA मिश्रण जोड़ें और 48 घंटे के लिए siRNA के साथ कोशिकाओं सेते हैं.

3. G0 चरण में RPE1 कोशिकाओं का सिंक्रनाइज़ेशन

  1. चरण 2.3 से RPE1 कोशिकाओं को Trypsinize करें जैसा कि खंड 1 (~ 2 × 106 कोशिकाओं) में उल्लिखित है।
  2. सेल निलंबन को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें और इसे 5 मिन के लिए 150 × ग्राम, आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्रित्र करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के 12 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 150 × ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला और centrifugation के हटाने को दो बार दोहराएँ.
  4. 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट,  15 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक सीरम मुक्त डीएमईएम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और उन्हें 10 सेमी टिशू कल्चर डिश पर प्लेट करें।
    नोट: यदि कोशिकाएं टकराती हैं, तो उन्हें सीरम मुक्त डीएमईएम के सिर्फ 1 एमएल में फिर से निलंबित करें और 10 एमएल की अंतिम मात्रा तक निलंबन को पतला करने से पहले गुच्छों को नापसंद करने के लिए पी 1000 टिप का उपयोग करके उन्हें ऊपर और नीचे 5x पिपेट करें।
  5. सीरम भुखमरी के 24 घंटे के बाद, सीरम-भूखे कोशिकाओं में जटिल siRNA जोड़कर धारा 2 में वर्णित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके चुप्पी के दूसरे दौर का परिचय दें।
  6. G1 रिलीज के लिए आगे बढ़ने से पहले 72 घंटे के लिए सीरम मुक्त DMEM में RPE1 कोशिकाओं रखें.

4. कवरस्लिप कोटिंग और जी 1 चरण में कोशिकाओं को जारी करना

  1. 70% इथेनॉल के साथ चिमटी जीवाणुरहित और एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में एक एकल ग्लास coverslip (व्यास में 12 मिमी और # 1.5 मोटाई [0.17 मिमी]) जगह है.
  2. 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस के साथ विट्रोनेक्टिन कोटिंग मैट्रिक्स को पतला करें। कवरस्लिप युक्त प्रत्येक कुएं में विट्रोनेक्टिन समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कोटिंग समाधान निकालें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ coverslips धो लें.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए पीबीएस धोने के बाद 0.05% ट्रिप्सिन के 1 एमएल का उपयोग करके 10 सेमी ऊतक सुसंस्कृत उपचारित प्लेट से सीरम-भूखे आरपीई 1 कोशिकाओं को अलग करें।
    नोट: सीरम भुखमरी के बाद कोशिकाएं बहुत तेजी से अलग हो जाती हैं। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोते समय सावधानी बरतें और कम ट्रिप्सिनाइजेशन समय का उपयोग करें।
  5. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए, संवर्धन माध्यम के कुल 6 एमएल में आरपीई 1 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 150 × ग्राम का उपयोग करके कोशिकाओं को कताई करके निष्क्रिय ट्रिप्सिन निकालें।
  6. संवर्धन माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल नंबर को मापें।
  7. बीज 4 × 104 RPE1 कोशिकाओं को खेती माध्यम के कुल 500 माइक्रोन में लेपित कवरस्लिप पर।
    नोट: सुनिश्चित करें कि डाउनस्ट्रीम चरणों में आगे बढ़ने से पहले सेल व्यवहार्यता 90% से ऊपर है। सेल व्यवहार्यता जल्दी से सेल गिनती कदम के दौरान trypan नीले धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
  8. संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं चढ़ाना के 6 घंटे के बाद, G0 जारी कोशिकाओं जल्दी G1 चरण में हो जाएगा. कोशिकाओं एस चरण में प्रवेश शुरू करने से पहले इस 6-12 घंटे खिड़की में जी 1 में प्रयोगों प्रदर्शन.
  9. डीएनए क्षति शुरू करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10 माइक्रोन 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) के साथ कोशिकाओं को पल्स करें, संवर्धन माध्यम में पतला।
  10. EdU युक्त माध्यम निकालें और डीएनए क्षति प्रेरण के दौरान शेष EdU निगमन को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10 माइक्रोन थाइमिडीन के साथ कोशिकाओं का पीछा.
  11. थाइमिडीन के साथ माध्यम निकालें और 1 घंटे के लिए 250 माइक्रोन एच2ओ2 के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, संवर्धन माध्यम में पतला।

5. ssDNA का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना

  1. मध्यम और सीरम घटकों को हटाने के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    नोट: टुकड़ी और सुखाने से बचने के लिए कोशिकाओं को धोते समय कोमल रहें। एक ही समय में कई कुओं को संसाधित न करें।
  2. पूर्व निष्कर्षण: आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए सीएसके निष्कर्षण बफर (तालिका 1) के 1 एमएल में धोया कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: सीएसके पूर्व-निष्कर्षण घुलनशील आरपीए 2 सहित सभी गैर-क्रोमैटिन-बाउंड प्रोटीन को हटा देता है।
    चेतावनी: ट्राइटन X-100 हानिकारक है अगर निगल लिया और त्वचा में जलन और आंखों को नुकसान हो सकता है।
  3. कोशिकाओं से सीएसके बफर निकालें और आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 3.6% पैराफॉर्मलाडेहाइड समाधान (पीबीएस में) के 0.5 एमएल जोड़कर उन्हें सीधे ठीक करें।
    चेतावनी: यह तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है 3.6% पीएफए से पीएफए 32% ताजा भंडार. पैराफॉर्मलडिहाइड से आंखों की गंभीर क्षति, त्वचा में जलन और श्वसन जलन हो सकती है।
  4. पीएफए को हटाने के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स-100 युक्त पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  5. आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिन के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को आगे पारगम्य करें।
  6. प्रतिकृति कोशिकाओं (एस चरण) की कल्पना करने के लिए EdU क्लिक-आईटी प्रतिक्रिया
    1. पारगम्यता समाधान निकालें और अवरुद्ध बफर(तालिका 1)के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को 2x धोएं।
      सावधानी: गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) श्वसन जलन पैदा कर सकता है।
    2. अवरुद्ध बफर(तालिका 1)के 1 एमएल जोड़ें और धीरे आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए कवरस्लिप युक्त प्लेट रॉक.
    3. अवरुद्ध बफर निकालें और पिकोलिल एज़ाइड 647 (तालिका 1) युक्त क्लिक प्रतिक्रिया कॉकटेल के 500 माइक्रोन जोड़ें। कोमल कमाल का उपयोग आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए coverslips सेते हैं और अंधेरे में बहाव ऊष्मायन प्रदर्शन.
      नोट: BrdU एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, निर्माता द्वारा अनुशंसित क्लिक-रिएक्शन के लिए दोगुनी मात्रा (1 एमएल) और समय (60 मिनट) का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रतिक्रिया संतृप्त है और शामिल EdU लेबल किया गया है। यह BrdU एंटीबॉडी27 की पार प्रतिक्रियाशीलता को सीमित करता है.
  7. क्लिक प्रतिक्रिया मिश्रण निकालें और आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस)(चित्रा 1 और चित्रा 2)पर 10 मिनट के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x धो लें।
  8. अवरुद्ध बफर के 1 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर अवरुद्ध करने में रखें।
  9. कोमल रॉकिंग के साथ अवरुद्ध बफर के 250-500 माइक्रोन में आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-आरपीए 2 चूहा, 1: 1,000 कमजोर पड़ने) लागू करें।
  10. जल्दी से एंटीबॉडी समाधान के सबसे हटाने के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x धो लें.
  11. आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर अवरुद्ध बफर के साथ 3 x 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोना जारी रखें।
  12. कोमल रॉकिंग के साथ 2 घंटे के लिए आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर बफर को अवरुद्ध करने के 250-500 माइक्रोन में माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी चूहा एलेक्सा-488, 1: 1,000 कमजोर पड़ने) लागू करें।
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी के सबसे जल्दी से हटाने के लिए 2x अवरुद्ध बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें. आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 0.05% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ 3 x 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोना जारी रखें।
  14. नाभिक counterstain करने के लिए, आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स -100 और 1 μg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। आरटी (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  15. बढ़ते माध्यम/कवरस्लिप के 10 माइक्रोन का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवर ग्लास माउंट करें। किसी भी नमक क्रिस्टल से छुटकारा पाने के लिए बढ़ते से पहले कवरस्लिप को आसुत जल में डुबोएं। अगले दिन स्लाइड छवि और सप्ताह (चित्रा 3) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.

6. छवि अधिग्रहण और मात्रा का ठहराव

  1. छवियों को कैप्चर करने के लिए, परमाणु foci की कल्पना करने के लिए कम से कम 5-60x आवर्धन, उच्च संख्यात्मक एपर्चर और तेल उद्देश्यों के साथ DAPI, FITC, और Cy5 चैनलों की छवि के लिए नियमित फ़िल्टर सेट से लैस किसी भी उपलब्ध एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: इष्टतम DAPI उत्तेजना ~ 359 एनएम है; एलेक्सा 488 उत्तेजना ~ 488 एनएम है; जबकि एलेक्सा 647 उत्तेजना ~ 647 एनएम है।
  2. छवि विश्लेषण के लिए, फिजी/इमेजजे में छवि फ़ाइलें खोलें।
    1. DAPI धुंधला (चित्रा 4A-F और पूरक वीडियो S1) का उपयोग कर परमाणु मास्क बनाओ.
      1. DAPI छवि खोलें।
      2. प्रक्रिया का चयन करें | कंट्रास्ट बढ़ाएं और संतृप्त पिक्सेल को 0.35 पर सेट करें।
      3. प्रक्रिया पर क्लिक करें | बाइनरी | मास्क में कनवर्ट करें। बाइनरी चुनें | Fill Holes और Analyze पर क्लिक करें | कणों का विश्लेषण करें। आकार को 10-इन्फिनिटी पर सेट करें।
      4. ROI प्रबंधक में, सभी दिखाएँ पर क्लिक करें।
    2. नाभिक में RPA2 foci ढूँढना (चित्रा 4 जी, एच और पूरक वीडियो एस 1)
      1. RPA2 छवि खोलें।
      2. प्रक्रिया चुनें | मैक्सिमा का पता लगाएं। प्रमुखता को उस मान पर सेट करें जो RPA2 foci (500 और 750 के बीच) को हाइलाइट करता है, इसे पृष्ठभूमि से अलग करता है।
      3. अंत में, ROI प्रबंधक में माप बटन पर क्लिक करें।
      4. RawinDen कॉलम में मान को 255 (प्रत्येक foci में पिक्सेल तीव्रता का अधिकतम मूल्य) से विभाजित करके परमाणु ssDNA foci की कुल संख्या की गणना करें।
    3. पसंदीदा सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
      नोट: विश्लेषण से सभी EdU-पॉजिटिव कोशिकाओं और अनुचित रूप से खंडित DAPI मास्क को बाहर करें।

Representative Results

G1 में ssDNA का पता लगाने की सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने RPA2 का उपयोग किया, जो ssDNA foci डिटेक्शन35 की विशिष्टता और तीव्रता दोनों को बढ़ाता है। सटीक सेल सिंक्रनाइज़ेशन प्राप्त करने के लिए, हमने RPE1 कोशिकाओं का उपयोग किया जो कुशलतापूर्वक सीरम-भूखे और G0 चरण में सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है। फिर उन्हें सीरम अभाव के बाद सीरम के अतिरिक्त सेल चक्र में फिर से प्रवेश करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता की पुष्टि करने के लिए, हमने कोशिकाओं को एडयू और उनके डीएनए सामग्री को प्रोपिडियम-आयोडाइड के साथ लेबल किया। हमने आगे प्रवाह साइटोमेट्री (पूरक चित्रा एस 1 ए) के माध्यम से गुणात्मक और मात्रात्मक परिणाम एकत्र किए। डॉट-प्लॉट बताते हैं कि सीरम भुखमरी के 72 घंटे के बाद, ~ 98% कोशिकाएं जी 0 चरण में हैं। 6 घंटे के लिए सीरम युक्त मीडिया के अलावा के बाद, कोशिकाओं सेल चक्र ( चित्रा 1 ए में पी 27 के स्तर में वृद्धि से देखा के रूप में) पुन: प्रवेश, जी 1 में कोशिकाओं के ~ 97% होने, जबकि केवल <1% कोशिकाओं एस चरण में, <2% जी 2 चरण में कोशिकाओं(अनुपूरक चित्रा एस 1 ए). कोशिकाओं में सीरम के अलावा 20-28 घंटे के बाद, वे धीरे-धीरे एस चरण से गुजरते हैं, जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों (पूरक चित्रा एस 1 ए) द्वारा दिखाया गया है। यह सेल सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल ~ 97% शुद्ध जी 1 आबादी (सीरम भुखमरी के 72 घंटे के बाद 6 एच पोस्ट सीरम जोड़) देता है। सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता को और अधिक मान्य करने के लिए, हमने पश्चिमी सोख्ता(चित्रा 1 ए और पूरक चित्रा एस 1 बी) का उपयोग करके सीरम रिलीज के बाद सेल चक्र मार्करों की अभिव्यक्ति की तुलना की और समानांतर में, डीएनए प्रतिकृति की कल्पना करने के लिए एक ईडीयू निगमन परख का प्रदर्शन किया। EdU धुंधला भी तुल्यकान दक्षता और जी 1 चरण (चित्रा 1 बी, सी) में डीएनए प्रतिकृति की कमी पर प्रकाश डाला गया.

स्तनधारी कोशिकाओं में ssDNA का पता लगाने के पारंपरिक तरीके ssDNA में BrdU का पता लगाने पर निर्भर करते हैं। चित्रा 2 ए दर्शाता है कि एच2ओ2 और नियोकार्ज़िनोस्टैटिन (एनसीएस) उपचार पर, बीआरडीयू फ़ॉसी केवल एस चरण कोशिकाओं में पता लगाने योग्य थे, जबकि गैर-एस चरण कोशिकाओं में कोई एसएसडीएनए फ़ॉसी पता लगाने योग्य नहीं थे। BrdU एंटीबॉडी धुंधला भी एक ध्यान देने योग्य न्यूक्लियोलर पृष्ठभूमि धुंधला है कि सभी नाभिक में पता लगाया जा सकता है, सेल चक्र चरण या उपचार लागू से स्वतंत्र. यहां वर्णित ईडीयू क्लिक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम सह-स्थानीयकरण ईडीयू और बीआरडीयू फॉसी का पता नहीं लगा सके, जो चित्रा 2 ए के अनुपचारित नमूनों में स्पष्ट है। क्रॉस-रिएक्टिविटी से उत्पन्न होने वाले किसी भी BrdU सिग्नल को पूरी तरह से खारिज करने के लिए, हमने EdU लेबलिंग से परहेज किया और S-G2 मार्कर के रूप में साइक्लिन A2 का उपयोग किया। हालांकि, साइक्लिन ए 2 धुंधला सीएसके पूर्व-निष्कर्षण की अनुमति नहीं देता था, और इस शर्त के तहत, हमने जीनोटॉक्सिक तनाव (पूरक चित्रा एस 2 ए) के बाद भी किसी भी बीआरडीयू फॉसी को नहीं देखा। यह इस तथ्य पर प्रकाश डालता है कि सीएसके पूर्व-निष्कर्षण एंटी-बीआरडीयू-आधारित एसएसडीएनए धुंधला होने के लिए आवश्यक है। एक नियंत्रण के रूप में, हमने विकृतीकरण की स्थिति के तहत BrdU एंटीबॉडी धुंधला हो जाना परीक्षण किया। यह शामिल BrdU को बेनकाब करने के लिए डीएनए खोलता है, जिससे पता चलता है कि BrdU को समान रूप से शामिल किया गया था (पूरक चित्र S2B)।

इसके विपरीत, आरपीए 2 धुंधला एनसीएस दिखाता है- और एच2ओ2-निर्भर फ़ॉसी गठन न केवल एस चरण में बल्कि अन्य सेल चक्र चरणों(चित्रा 2बी)में भी। एक नियंत्रण के रूप में, हमने एचयू के साथ कोशिकाओं का भी इलाज किया, जो केवल प्रतिकृति के दौर से गुजरने वाली कोशिकाओं में एसएसडीएनए संचय का कारण बनता है। जैसा कि अपेक्षित था, हमने केवल EdU-पॉजिटिव कोशिकाओं में RPA2 एंटीबॉडी के साथ HU उपचार पर एक संकेत वृद्धि का पता लगाया, इस दृष्टिकोण की विशिष्टता को उजागर किया। आरपीए 2 एंटीबॉडी भी बहिर्जात जीनोटॉक्सिक तनाव(चित्रा 2बी)की अनुपस्थिति में प्रतिकृति के दौरान स्वाभाविक रूप से होने वाली एसएसडीएनए गठन का पता लगा सकता है। RPA2 एंटीबॉडी की अत्यधिक संवेदनशील प्रकृति ने हमें G1 चरण में इसका उपयोग करने का प्रयास करने के लिए प्रेरित किया जहां पारंपरिक BrdU धुंधला जीनोटॉक्सिक तनाव (पूरक चित्र S2C) पर किसी भी संकेत का पता लगाने में विफल रहा। चित्रा 3 ए से पता चलता है कि एच2ओ2 उपचार पर एसएसडीएनए फॉसी का गठन एंटी-आरपीए 2 एंटीबॉडी का उपयोग करते समय पता लगाने योग्य था, यहां तक कि जी 1 में भी। एच2ओ2 उपचार (चित्रा 3 बी) पर इन नाभिकों में आरपीए 2 फॉसी की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। ये foci RPA2 के लिए विशिष्ट थे क्योंकि RPA2 की चुप्पी ने IF सिग्नल (चित्र 3A, B) को समाप्त कर दिया था। चित्रा 3 सी और पूरक चित्रा एस 1 सी इन कोशिकाओं में आरपीए 2 साइलेंसिंग की दक्षता दिखाते हैं। पारंपरिक तरीकों की तुलना में, SSDNA का RPA2-आधारित पता लगाना अत्यधिक संवेदनशील है, और इसलिए इसके अनुप्रयोग को G1 चरण कोशिकाओं तक बढ़ाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: सीरम भुखमरी के बाद आरपीई 1 कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता। (ए) इम्यूनोब्लॉट्स अतुल्यकालिक, जी 1, और एस चरण सिंक्रनाइज़ आरपीई 1 कोशिकाओं में इंगित प्रोटीन स्तर दिखाते हैं। (बी) प्रतिनिधि छवियों निर्धारण से पहले 30 मिनट के लिए 10 माइक्रोन EdU के संपर्क में थे कि अतुल्यकालिक, G1, और एस चरण सिंक्रनाइज़ RPE1 कोशिकाओं से पता चलता है और क्लिक आईटी प्रतिक्रिया द्वारा कल्पना की. परमाणु डीएनए का मुकाबला करने के लिए DAPI का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (सी) ग्राफ डीएपीआई द्वारा मूल्यांकन की गई कुल सेल आबादी पर ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है, और नाभिक की विश्लेषण संख्या निम्नलिखित थी: एएस एन = 219, जी 1 एन = 630, एस एन = 437। संक्षिप्ताक्षर: RPE1 = hTERT-अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाएं; AS = अतुल्यकालिक; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डीएनए क्षति पर बीआरडीयू एंटीबॉडी या आरपीए 2 एंटीबॉडी के साथ एसएसडीएनए का पता लगाना। (ए) प्रतिनिधि छवियां αBrdU (हरा) का उपयोग करके ssDNA foci का वर्णन करती हैं, S चरण कोशिकाओं को EdU (बैंगनी) द्वारा हाइलाइट किया जाता है, और DAPI का उपयोग परमाणु डीएनए (नीला) का मुकाबला करने के लिए किया जाता था। RPE1 कोशिकाओं को किसी भी अतिरिक्त उपचार से पहले 48 घंटे के लिए 10 माइक्रोन BrdU में रखा गया था। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 10 माइक्रोन ईडीयू के साथ स्पंदित किया गया था, इसके बाद 1 घंटे के लिए एच2ओ2 (250 माइक्रोन) या 4 घंटे के लिए नियोकार्ज़िनोस्टैटिन (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल) का उपचार किया गया था। सीएसके पूर्व-निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं को ठीक किया गया था। एक सफेद धराशायी रेखा प्रत्येक नाभिक की सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। दाईं ओर के पैनल संकेतित एस चरण या गैर-एस चरण नाभिक की बढ़ी हुई छवियां हैं। (बी) प्रतिनिधि छवियां αRPA2 एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग करके ssDNA foci का वर्णन करती हैं। एस चरण कोशिकाओं को ईडीयू (बैंगनी) द्वारा हाइलाइट किया जाता है, और डीएपीआई का उपयोग परमाणु डीएनए (नीला) का मुकाबला करने के लिए किया जाता था। RPE1 कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 10 माइक्रोन EdU के साथ स्पंदित किया गया था, इसके बाद 1 h H2O2 (250 μM), हाइड्रोक्सीयूरिया के 4 घंटे (2 मिमी), या NCS के 4 घंटे (0.5 μg/mL)। सीएसके पूर्व-निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं को ठीक किया गया था। एक सफेद धराशायी रेखा प्रत्येक नाभिक की सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। दाईं ओर के पैनल संकेतित एस चरण या गैर-एस चरण नाभिक की बढ़ी हुई छवियां हैं। संक्षिप्ताक्षर: ssDNA = एकल-फंसे डीएनए; BrdU = 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; RPE1 = hTERT-अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; एनसीएस = नियोकार्ज़िनोस्टैटिन; एचयू = हाइड्रोक्सीयूरिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आरपीए 2 एंटीबॉडी का उपयोग कर जी 1 चरण में ssDNA foci का पता लगाना। (ए) RPE1 कोशिकाओं RPA2 या एक गैर लक्ष्यीकरण siRNA नियंत्रण को लक्षित करने या तो siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, और बाद में जी 1 में सिंक्रनाइज़ और नाड़ी लेबल 10 माइक्रोन EdU के साथ 30 मिनट के लिए उन्हें एच2ओ2 (250 माइक्रोन) के साथ इलाज करने से पहले जहां संकेत दिया गया था. परमाणु डीएनए का मुकाबला करने के लिए DAPI का उपयोग किया गया था। सीएसके पूर्व-निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं को ठीक किया गया था। एक सफेद धराशायी रेखा प्रत्येक नाभिक की सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (बी) आरपीए 2 फॉसी/नाभिक की संख्या के लिए माप दो स्वतंत्र प्रयोगों से किए गए थे। विश्लेषण के दौरान केवल EdU-नकारात्मक कोशिकाओं पर विचार किया गया था। रेखाएँ भूखंडों पर माध्य मान का प्रतिनिधित्व करती हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए गैर-पैरामीट्रिक एनोवा परीक्षण (क्रुस्कल-वालिस) किया गया था। तारे P < 0.0001 इंगित करते हैं। नाभिक की विश्लेषण संख्या निम्नलिखित थी: siNT no H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536। (सी)siRNA दस्तक की दक्षता immunoblotting में दिखाया गया है. संक्षिप्ताक्षर: siNT = गैर-लक्ष्यीकरण siRNA नियंत्रण; BrdU = 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; RPE1 = hTERT-अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं; EdU = 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फिजी का उपयोग कर ssDNA foci की मात्रा का ठहराव. फिजी में विस्तृत कदम दिखा रहा है कि नाभिक में RPA2 foci संख्याओं का आकलन कैसे करें। (ए-ई) DAPI चैनल का उपयोग करके परमाणु मास्क का निर्माण। (एफ-एच) पृष्ठभूमि संकेत से व्यक्तिगत परमाणु ssDNA foci की पहचान करने के लिए थ्रेसहोल्डिंग। संक्षिप्ताक्षर: ssDNA = एकल-फंसे डीएनए; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

साइटोस्केलेटल (सीएसके) बफर
पाइप्स पीएच 7.0 10 मिमी
NaCl 100 मिमी
ईडीटीए पीएच 8 1 मिमी
एमजीसीएल2  3 मिमी
डी-सुक्रोज 300 मिमी
ट्राइटन एक्स-100 0.20%
फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल 1 टैबलेट प्रति 10 एमएल
प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल 1 टैबलेट प्रति 10 एमएल
डीडीएच2ओ में पतला एन/ए
धुलाई बफर
ट्राइटन एक्स-100 0.05%
पीबीएस में पतला एन/ए
पारगम्यता बफर
ट्राइटन एक्स-100 0.50%
पीबीएस में पतला एन/ए
निर्धारण समाधान
पैराफॉर्मलडिहाइड 3.60%
ट्राइटन एक्स-100 0.05%
पीबीएस में पतला एन/ए
ब्लॉकिंग बफर
गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 5%
ट्राइटन एक्स-100 0.10%
पीबीएस में पतला एन/ए
क्लिक-आईटी प्लस रिएक्शन कॉकटेल
1x क्लिक-आईटी प्रतिक्रिया बफर 435 एमएल
एलेक्सा फ्लोर पीसीए समाधान 5 एमएल
CuSO4-कॉपर प्रोटेक्टेंट प्रीमिक्स 10 एमएल
1x क्लिक-आईटी बफर एडिटिव 50 एमएल
कुल मात्रा 500 एमएल

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त बफ़र्स की संरचना।

अनुपूरक चित्र S1. (ए)आरपीई 1 कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए सीरम भुखमरी का उपयोग करके जी 0 चरण में सिंक्रनाइज़ किया गया था और बाद में सीरम को पुन: प्रस्तुत करके विभिन्न सेल चक्र चरणों में जारी किया गया था। डॉट प्लॉट G0/G1, S, या G2/M चरणों में कोशिकाओं को दिखाते हैं, जहां घंटे सीरम भुखमरी के बाद सीरम के पुन: जोड़ के बाद के समय का संकेत देते हैं। दाईं ओर का ग्राफ प्रत्येक स्थिति में G0/G1, S, और G2/M कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। FACS विश्लेषण निर्माता की सिफारिशों के अनुसार EdU और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल प्रसार किट का उपयोग करके किया गया था। (बी) चित्रा 1 के लिए अनक्रॉप्ड वेस्टर्न ब्लॉट स्कैन। संख्याएं केडीए में आणविक भार मार्कर दिखाती हैं। PARP1 को लोडिंग कंट्रोल के रूप में इस्तेमाल किया गया था और झिल्ली को काटकर CCNA2, p27 (PCNA के लिए आगे छीन लिया गया), और pH3 (S10) (H3 के लिए आगे छीन लिया गया) के खिलाफ विकसित किए गए जेल पर लोड किया गया था। CCNB1 और RPA2 तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन lysate की एक ही राशि का उपयोग कर, एक अलग जेल पर लोड किए गए थे. (ग) चित्रा 3 के लिए अनक्रॉप्ड वेस्टर्न ब्लॉट स्कैन। संख्याएं केडीए में आणविक भार मार्कर दिखाती हैं। संक्षिप्त: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S2: (ए) प्रतिनिधि छवियां BrdU एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग करके ssDNA foci का वर्णन करती हैं; एस चरण कोशिकाओं को साइक्लिन ए 2 (लाल) द्वारा हाइलाइट किया जाता है; और DAPI का उपयोग परमाणु डीएनए (नीला) का मुकाबला करने के लिए किया गया था। RPE1 कोशिकाओं को आगे के उपचार से पहले 48 घंटे के लिए 10 माइक्रोन BrdU में रखा गया था। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को निर्धारण से पहले 4 घंटे के लिए 1 घंटे या नियोकार्ज़िनोस्टैटिन (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए एच2ओ2 (250 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया था। एक सफेद धराशायी रेखा प्रत्येक नाभिक की सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (बी) के साथ और विकृतीकरण हालत के बिना RPE1 कोशिकाओं के BrdU धुंधला हो जाना. अतुल्यकालिक RPE1 कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 10 माइक्रोन BrdU के साथ पूर्व-इलाज किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (सी) BrdU foci/नाभिक की संख्या के लिए माप G1 सिंक्रनाइज़ RPE1 कोशिकाओं में दो स्वतंत्र प्रयोगों से किए गए थे। विश्लेषण के दौरान केवल EdU-नकारात्मक कोशिकाओं पर विचार किया गया था। रेखाएँ भूखंडों पर माध्य मान का प्रतिनिधित्व करती हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए गैर-पैरामीट्रिक एनोवा परीक्षण (क्रुस्कल-वालिस) किया गया था। 'ns' गैर-महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। नाभिक की विश्लेषण संख्या निम्नलिखित थी: एनटी एन = 52, एनसीएस एन = 105, एच2ओ2 एन = 82। संक्षिप्ताक्षर: siNT = गैर-लक्ष्यीकरण siRNA नियंत्रण; BrdU = 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; RPE1 = hTERT-अमर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं; एनसीएस = नियोकार्ज़िनोस्टैटिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S1: फिजी स्थित RPA2 foci विश्लेषण की स्क्रीन रिकॉर्डिंग। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एक स्वस्थ, माइकोप्लाज्मा मुक्त सेल संस्कृति को बनाए रखना ऊपर वर्णित सभी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। RPE1 कोशिकाओं में सामान्य संवर्धन मीडिया के तहत ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लास्टिकवेयर के लिए एक मजबूत लगाव होता है; हालांकि, सीरम मुक्त परिस्थितियों में रखे जाने पर उनकी बाध्यकारी विशेषताएं काफी कम हो जाती हैं। इसके अतिरिक्त, एक माइक्रोस्कोप के तहत ssDNA foci की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करने के लिए, कोशिकाओं को 0.17 मिमी मोटी कवर ग्लास पर चढ़ाया जाना चाहिए, जो RPE1 कोशिकाओं के उचित लगाव का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हाइड्रोफिलिक नहीं है। ठीक से चपटा और समान रूप से वितरित कोशिकाओं के बिना, व्यक्तिगत ssDNA foci की कल्पना करना बहुत चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, उचित कोटिंग सामग्री (जैसे, विट्रोनेक्टिन) का चयन करना और कोशिकाओं को जी 1 चरण में जारी करने के बाद फैलाने और संलग्न करने के लिए पर्याप्त समय (6-12 घंटे) छोड़ना महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल का एक चुनौतीपूर्ण हिस्सा सजातीय G1 सिंक्रनाइज़ RPE1 कोशिकाओं को प्राप्त करना है। इसके लिए दो महत्वपूर्ण चरणों की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, कुशल सीरम भुखमरी के लिए, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड करने की आवश्यकता होती है, पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है, और सीधे सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग करके नए टिशू कल्चर व्यंजनों पर वरीयता प्राप्त होती है। सीरम को हटाने के लिए टिशू कल्चर व्यंजन में सीधे कोशिकाओं को धोने कुशल G0 तुल्यवृत्त उपज नहीं होगा. दूसरा, जब जी 1 चरण में कोशिकाओं को रिहा करते हैं, तो कोशिकाओं को फिर से ट्रिप्सिनाइज्ड किया जाना चाहिए और ताजा टिशू कल्चर प्लेटों पर वरीयता प्राप्त करनी चाहिए। इसी तरह, बस माध्यम को बदलने और कोशिकाओं के लिए सीरम युक्त संवर्धन माध्यम जोड़ने एक तुल्यकालिक जी 1 प्रविष्टि में परिणाम नहीं होगा. इसके अतिरिक्त, उचित जी 1 प्रविष्टि के लिए, लेपित कवर चश्मे पर कोशिकाओं के बोने घनत्व कुछ संगम स्तर पर होना चाहिए. जबकि सही सेल सिंक्रनाइज़ेशन आम तौर पर अप्राप्य है, यहां वर्णित यह सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल ~ 97% शुद्ध जी 1 आबादी देता है। एक 12 मिमी व्यास coverslip पर RPE1 के लिए सिफारिश की बोने घनत्व ~ 4 × 104 इमेजिंग के लिए देखने का एक सजातीय क्षेत्र प्राप्त करने के लिए, लगभग 70% संगम के साथ. उच्च बीजारोपण घनत्व सीएसके निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं को अलग और "छील-बंद" का कारण बनता है और छवि अधिग्रहण के दौरान एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत में परिणाम होगा.

किसी भी पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और एक अनुकूल सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद पूरी तरह से धोना आवश्यक है। चूंकि कई धोने के चरणों को लागू किया जाना है, इसलिए प्रत्येक धोने के चरण के दौरान कुएं को सूखने से रोकना भी आवश्यक है। हम सभी धुलाई और इनक्यूबेशन चरणों में न्यूनतम 0.05% ट्राइटन X-100 लागू करके इस आर्टिफैक्ट को कम करते हैं। एक बार कुओं सूख जाने के बाद, कोशिकाओं ने एक परिवर्तित सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदर्शित किया; यह माइक्रोस्कोप के नीचे एक मोज़ेक जैसा पैटर्न की ओर जाता है और मूल्यांकन में हस्तक्षेप कर सकता है। डीकनवोल्यूशन के साथ संयुक्त जेड-स्टैक छवि अधिग्रहण विश्लेषण को बेहतर बनाने के लिए विभिन्न फोकल विमानों में foci को कैप्चर करने में सहायता कर सकता है।

पारंपरिक तरीके गैर-विकृतीकरण स्थितियों के तहत शामिल BrdU का पता लगाने पर निर्भर करते हैं। हालांकि, ये विधियां समान जीनोमिक निगमन सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 1-2 दिनों (या सेल लाइन में एक पूर्ण सेल चक्र के बराबर समय) के लिए BrdU के उच्च खुराक के साथ कोशिकाओं के ढोंग पर निर्भर करती हैं। अवांछनीय रूप से, व्यापक BrdU निगमन सेल चक्र हस्तक्षेप36 का कारण बन सकता है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, यह विधि ssDNA foci का पता लगाने के लिए अंतर्जात RPA2 का उपयोग करती है। इस दृष्टिकोण को प्रतिकृति-संचालित BrdU निगमन की आवश्यकता नहीं है, इसका उपयोग पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं में भी किया जा सकता है। चूंकि व्यापक BrdU निगमन की आवश्यकता नहीं है, इससे समय की बचत होती है और प्रयोगात्मक जटिलता कम हो जाती है। SSDNA की कल्पना करने के लिए RPA2 धुंधला का उपयोग करके, हम EdU 27,37,38 के खिलाफ BrdU एंटीबॉडी की संभावित क्रॉसरिएक्टिविटी से बचने के दौरान डीएनए प्रतिकृति को चिह्नित करने के लिए 2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) और क्लिक-केमिस्ट्री का उपयोग कर सकते हैं। क्लिक-रिएक्शन के दौरान शामिल EdU को ठीक से मास्क करने के लिए विशेष देखभाल की जानी चाहिए ताकि BrdU एंटीबॉडी EdU27,39 के साथ क्रॉस-रिएक्ट न करें।

अंत में, BrdU के बजाय RPA2 का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ S चरण के बाहर BrdU धुंधला होने की तुलना में बस एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। हमने पाया कि गैर-विकृतीकरण BrdU धुंधला हो जाना और ssDNA की कल्पना करने की इसकी क्षमता कोशिकाओं की प्रतिकृति में भी एस चरण तक ही सीमित है (चित्र 2)। BrdU एंटीबॉडी केवल ssDNA स्ट्रेच में पर्याप्त रूप से उजागर BrdU से बांधती है। SSDNA स्ट्रेच के लिए RPA2 सहित मरम्मत प्रोटीन का बंधन ssDNA में BrdU के पर्याप्त जोखिम को दबा या बाधित कर सकता है। हमने यह भी पाया कि BrdU एंटीबॉडी का उपयोग करके ssDNA विज़ुअलाइज़ेशन के लिए CSK पूर्व-निष्कर्षण आवश्यक है। यह संभव है क्योंकि ssDNA पटरियों उनमें से हल्के बाध्य प्रोटीन घटकों को हटाने के बिना एंटीबॉडी के लिए सुलभ नहीं हैं.

बहरहाल, इस प्रोटोकॉल से जुड़ी कुछ सीमाएं हैं। ssDNA का पता लगाने के लिए RPA2 का उपयोग करने की एक सीमा CSK पूर्व-निष्कर्षण चरण को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। अनबाउंड, अतिरिक्त RPA2 कोशिकाओं को ठीक करने से पहले डीएनए से दूर धोया जाना चाहिए. एक ओर, अंडरएक्सट्रैक्शन RPA2 प्रोटीन अंश के कारण एक उच्च पृष्ठभूमि की ओर जाता है जो ssDNA के लिए बाध्य नहीं है। दूसरी ओर, ओवरएक्सट्रैक्शन से सिग्नल लॉस हो जाएगा। BrdU का पता लगाने के लिए, यह एक चर नहीं है क्योंकि BrdU को डीएनए में स्थिर रूप से शामिल किया गया है और इसे पूर्व-निष्कर्षण द्वारा धोया नहीं जा सकता है। इसलिए, सीएसके पूर्व-निष्कर्षण का समय, बफर में ट्राइटन X-100 की मात्रा, मात्रा और तापमान जिस पर पूर्व-निष्कर्षण किया जाता है, उस पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। CSK पूर्व-निष्कर्षण S/G2 कोशिकाओं से G0/G1 कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए नाभिक आकार के उपयोग को भी सीमित करता है।

इसके अतिरिक्त, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सकते हैं कि RPA2 से आने वाले कुछ सिग्नल अन्य क्रोमैटिन-बाइंडिंग प्रोटीन इंटरएक्टर्स से बंधे होने से उत्पन्न होते हैं। RPA2 एंटीबॉडी की प्रजातियों की विशिष्टता पर भी विचार करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एंटीबॉडी मानव, माउस, चूहा, हम्सटर और बंदर RPA2 को पहचान सकती है। इस दृष्टिकोण की एक और सीमा यह है कि सभी सेल लाइनों को G0 सिंक्रनाइज़ेशन के लिए सीरम-भूखा नहीं किया जा सकता है। अधिकांश कैंसर सेल लाइनें सेल चक्र चौकियों को बायपास कर सकती हैं और सीरम से वंचित मीडिया में भी फैल सकती हैं। हालांकि सीरम भुखमरी फायदेमंद है, क्योंकि यह डीएनए क्षति का कारण नहीं बनता है, किसी को यह सुनिश्चित करने के लिए अपने सेल सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता की सावधानीपूर्वक निगरानी करनी चाहिए कि उचित सेल चक्र चरण संवर्धन प्राप्त किया गया है। कोशिकाओं है कि सीरम अभाव का जवाब नहीं है के लिए, अन्य सेल तुल्यक्रन तरीकों पर विचार किया जाना चाहिए (जैसे, माइटोटिक शेक बंद, G2 गिरफ्तारी के लिए CDK1 निषेध, या केन्द्रापसारक elutriation के रूप में गैर इनवेसिव तकनीकों). एक अन्य संभव विधि अतुल्यकालिक कोशिकाओं31 के सेल चक्र रूपरेखा के लिए EdU और परमाणु डीएनए सामग्री को मापने के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग कर रहा है. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए वैकल्पिक सिंक्रनाइज़ेशन विधियों का उपयोग करने के निहितार्थ पर विचार करना चाहिए। उदाहरण के लिए, डबल थाइमिडीन ब्लॉक या एफिडिकोलिन का उपयोग, अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिकृति तनाव और डीएनए क्षति40 होगी।

डीएनए की मरम्मत तंत्र की जांच कैंसर और कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में चर्चा का केंद्र बिंदु बनी हुई है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है, डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाले एजेंटों के संपर्क में ssDNA के दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल ssDNA बाध्यकारी प्रोटीन, RPA2 के उपयोग पर प्रकाश डालता है, जो सभी सेल चक्र चरणों में अवांछित क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के दौरान ssDNA foci की छोटी मात्रा की कल्पना करने के लिए अपनी उच्च विशिष्टता का प्रदर्शन करता है। RPA2 का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है, विशेष रूप से शोधकर्ताओं के लिए सेल चक्र के G1 चरण में कोशिकाओं का विश्लेषण करने का लक्ष्य रखता है। यह प्रोटोकॉल कई सीमाओं पर विचार करता है और ssDNA का पता लगाने के लिए RPA2 या BrdU धुंधला का उपयोग करते समय सिग्नल हस्तक्षेप, अवांछित पृष्ठभूमि शोर और क्रॉस-रिएक्टिविटी से संबंधित चिंताओं को संबोधित करता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक मिशेल पगानो को उनके समर्थन और सहायक अंतर्दृष्टि के लिए, एशले चुई और शेरोन कैसारी को पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए, और जेफरी एस्ट्राडा और विल्मा डियाज़ को उनके निरंतर समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान GM136250 के लिए एक विविधता पूरक द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T6074 primary antibody (1:5,000)
Axio Observer Inverted Microscope Zeiss na microscope
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% Invitrogen  NW04127BOX Western Blot
Bovine Serum Albumin  Jackson ImmunoResearch  001-000-162 blocking
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) Sigma-Aldrich B5002-100MG nucleotide analogue
BrdU antibody BU1/75 Abcam ab6326 primary antibody (1:500)
CellAdhere Dilution Buffer Stemcell Technologies 07183 coating reagent
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits  Invitrogen  C10632 flow cytomery 
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye Thermo Fisher Scientific C10640 click-reaction kit
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 5892791001 reagent
Countess 3 Automated cell counter  Thermo Scientific AMQAX2000 cell counter
Coverslip  neuVitro GG12PRE tissue culture
Cyclin A2 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-271682 primary antibody (1:1,000) for IF and WB
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245 primary antibody (1:5,000)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML vehicle control
DMEM, high glucose, with HEPES Gibco 12430051 cell culture medium for RPE cells
DPBS, no calcium, no magnesium  Gibco 14190144 the PBS used throughout the protocol
D-Sucrose Thermo Fisher Scientific bp220-1 reagent
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope  Nikon na microscope
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) Thermo Fisher Scientific C10637 nucleotide analogue
Falcon 24-well plate Corning  351147 tissue culture
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm Corning  353003 tissue culture
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 16140071 media supplement
Fiji (ImageJ) NIH version 1.54f software and algorithms
FxCycle PI/RNase Staining Solution Invitrogen  F10797 PI staining
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher Scientific A21422 secondary antibody (1:1,000)
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermo Fisher Scientific A48262 secondary antibody (1:1,000)
Histone H3 antibody Abcam ab1791 primary antibody (1:10,000)
hTERT RPE1 ATCC CRL-3216 cell line
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758-100ML reagent
Hydrogen peroxide 30% soultion Sigma-Aldrich H1009-100ML reagent
Hydroxyurea,98% powder Sigma-Aldrich H8627-5G reagent
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15-575-020 reagent
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen  13778150 transfection reagent
Magnesium chloride solution 1 M Sigma-Aldrich M1028-100ML reagent
MycoFluor Thermo Fisher M7006 Mycoplasma Detection Kit
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus  Sigma-Aldrich N9162-100UG reagent
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) Invitrogen  NP0002 Western Blot
onTARGETplus Human RPA2 siRNA Dharmacon L-017058-01-0005 siRNA
p27 antibody BD Biosciences  610241 primary antibody (1:1,000)
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) Electron Microscopy Sciences 50-980-494 fixative
PARP1 antibody Cell Signaling Technology  9542S primary antibody (1:1,000)
PCNA antibody Cell Signaling Technology  13110S primary antibody (1:2,000)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 media supplement
pH3 antibody Cell Signaling Technology 3377S primary antibody (1:2,000)
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets Sigma-Aldrich 4906837001 reagent
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 Bioworld 41620034-1 reagent
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610395 Western Blot
Prism GraphPad version 10 statistical analysis and graph
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Scientific P36961 mounting media
Reduced serum media (Opti-MEM) Gibco 31985070 used for transfection
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) EMD Millipore NA19L primary antibody (1:1,000) for WB
Rpa32/rpa2 antibody (rat) Cell Signaling Technology  2208S primary antibody (1:1,000) for IF
Sodium Chloride solution (5 M) Sigma-Aldrich S5150 reagent
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 media supplement
Sodium tetraborate decahydrate Sigma-Aldrich B3535-500G reagent
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain  Thermo Scientific 62248 nucleic acid stain
Thymidine,powder Sigma-Aldrich T1985-1G reagent
Triton X-100 aqueous solution (10%) Sigma-Aldrich 11332481001 detergent
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 1540054 cell dissociation agent
Vitronectin XF Stemcell Technologies 07180 coating reagent
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad na flow cytomery 

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References

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सेल चक्र के जी 1 चरण में एकल-फंसे डीएनए foci की कल्पना करना
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Zhang, Q., Kerzhnerman, M. A., García-Vázquez, N., Rona, G. Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle. J. Vis. Exp. (202), e65926, doi:10.3791/65926 (2023).

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