Summary
次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded DNAの焦点の検出を示す。
Abstract
DNAには、内因性および/または外因性の両方の原因から生じる可能性のある病変に対処できる専用の細胞修復経路があります。DNA修復には、DNA病変の存在を認識して知らせることから、物理的に修復することまで、幅広いタスクをカバーする多数のタンパク質間のコラボレーションが必要です。この過程で、一本鎖DNA(ssDNA)の痕跡が作られることが多く、最終的にはDNAポリメラーゼで満たされます。これらのssDNAトラックの性質(長さと数の両方)は、これらのギャップを埋めるためにリクルートされたポリメラーゼとともに、修復経路特異的です。これらのssDNA痕跡を可視化することで、DNA修復機構の複雑なダイナミクスを理解することができます。
このプロトコルは遺伝毒性の圧力にssDNAの焦点の形成を測定するためにG1によって合わせられるセルの準備に詳しい方法を提供する。使いやすい免疫蛍光法を用いて、ヘテロ三量体複製タンパク質A複合体(RPA)の構成要素であるRPA2を染色することにより、ssDNAを可視化します。RPA2は、遺伝毒性ストレスや複製によって生じるssDNA中間体に結合して安定化させ、DNA修復やDNA損傷チェックポイントの活性化を制御します。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)染色は、DNA複製を可視化してS期細胞を除外するために使用されます。このプロトコルは慣習的な、非変性5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)ベースの試金に代わりとなるアプローチを提供し、S段階外のssDNAの焦点の検出により適する。
Introduction
生命を維持するために、細胞は常にDNAを調査して修復し、ゲノムの完全性を維持しています。細胞は、DNAストレッサーの内因性(酸化、アルキル化、脱アミノ化、複製エラーなど)と外因性(UV、電離放射線など)の両方が原因で、さまざまなタイプのDNA損傷を蓄積する可能性があります。これらの病変の修復に失敗すると、アポトーシス、細胞周期停止、または老化のいずれかを引き起こし、疾患につながる可能性があります1。DNA病変は、以下の主要なDNA修復経路のいずれかによって対処できます:DR(直接反転修復)、主にアルキル基を修復します2;BER(塩基切除修復)は、かさばらないDNA塩基エラーや一本鎖DNA切断(SSB)を標的としています3。NER(ヌクレオチド切除修復)は、かさばるらせんを歪めるDNA病変を矯正します4;MMR(ミスマッチ修復)は、主にDNAミスマッチ、挿入/欠失ループ(IDL)、および特定の塩基損傷を標的としています5。NHEJ(非相同末端結合)とHRR(相同組換え修復)は、どちらも二本鎖DNA切断(DSB)で活性を示します6。TLS(トランス病変合成)は、DNA病変バイパス機構である7。これらの経路には異なる基質特異性がありますが、効率的な修復のための冗長性を確保するために、それらの間には特定の重複があります。これらのDNA修復因子は、がん、老化、神経疾患を治療するための治療アプローチに不可欠な標的となる可能性があるため、さまざまな細胞周期段階におけるさまざまなDNA修復経路の作用を理解することは非常に重要です8,9。
一本鎖DNA(ssDNA)は、内因性および外因性のDNA損傷因子の両方によって生成されたDNA病変の修復により、細胞周期全体を通じて生成されます。遺伝毒性ストレスを受けると、HRRとMMRの活性が最も高いS期とG2期、およびDNA病変に遭遇したときに複製機構が失速または崩壊する期にssDNAが豊富に生成されます6,10,11。他のDNA修復経路(NHEJ/ミクロホモロジーを介した末端結合(MMEJ)/一本鎖アニーリング[SSA]など)も、DSB修復中にssDNAを生成します12。これらのssDNAトラックは、通常、HRおよびMMR中のEXO1、DNA2、CtIPなどのエキソヌクレアーゼ、NER中のXPFおよびXPGなどのエンドヌクレアーゼ、またはBER 4,13,14,15,16,17,18,19中のPOLBおよびFEN1の複合作用によって行われるDNA切除によって生じます.複製機構の働きにより、DNAヘリカーゼがPCNA結合複製ポリメラーゼ20の前でDNAを巻き戻すときにもssDNAトラックが生成される。対照的に、G1段階では、HRRとDNA複製の欠如とMMRの活性の制限により、生成されるssDNAトラックの範囲が減少するため、検出がより困難になります10,11,21。
細胞のssDNAトラックは、DSBの形成を避けるために保護する必要がある非常に敏感な構造です。これは、ssDNAトラックをRPAでコーティングすることで実現されます。RPAは、細胞周期全体を通して遍在的に発現する複数のサブユニット(RPA1、RPA2、およびRPA3、それぞれRPA70、RPA32、およびRPA14とも呼ばれる)で構成される豊富なヘテロ三量体タンパク質複合体である22。各RPAサブユニットには、4〜6ヌクレオチドと相互作用できるDNA結合ドメイン(DBD)が含まれており、結合されたサブユニットは安定した三量体化コアを形成します。全体として、RPAは約20〜30ヌクレオチドに結合し、サブナノモル親和性23,24です。
従来の方法では、免疫蛍光(IF)顕微鏡を用いて、BrdU抗体を用いてゲノムDNAに組み込まれた5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を標識することにより、ssDNAの病巣を可視化する25。このアプローチは、BrdU抗体が曝露されたssDNA中のBrdUしか検出できないという事実に依存しています25。このアプローチは単純ですが、いくつかの制限もあります。例えば、実験開始前に細胞を前処理してBrdUを取り込むと、時間がかかり、下流のエフェクターに干渉する可能性があります。したがって、BrdUベースのssDNA検出は複製細胞に限定され、静止細胞には使用できません。これは、癌や神経変性などのいくつかの疾患で重要であるにもかかわらず、非複製細胞のDNA修復を研究するためのこの方法の適用を除外します5,26。さらに、BrdUとEdUの構造は非常に類似しているため、ほとんどのBrdU抗体はEdUに対して交差反応性を示し、二重標識実験を目指す際にはこれを考慮する必要がある27。RPA染色は、主にS期細胞でssDNAの病巣を示すために以前に利用されてきました。しかし、いくつかの論文では、Sフェーズ28、29、30、31、32、33、34、35以外でもうまく使用しています。以下のプロトコールは、RPAの特性を効率的に利用し、細胞周期のG1期におけるDNA損傷後のssDNA病巣の可視化を可能にします(ただし、すべての細胞周期期で使用できます)。
Protocol
1. hTERT不死化網膜色素上皮細胞(RPE1)の維持
- RPE1細胞株は、10%熱不活化ウシ胎児血清(Hi-FBS)および100 μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(以下、培養培地と呼ぶ)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で、5%CO2 を含む加湿インキュベーターで37°Cで維持します。 ルーチン培養では、15cmの組織培養処理ディッシュでRPE1細胞を増殖させ、80-90%のコンフルエントに達したら分割します(15cmディッシュあたり10~16-18×6 細胞)。
- 分割するときは、培地を取り除き、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10 mLで細胞をすすぎます。
- 3 mLの0.05%トリプシン-EDTAを加えて、皿の表面全体を覆います。細胞が剥離するまで、トリプシンとともに37°Cに保ちます。
- トリプシン処理後、細胞を培地で再懸濁し、室温(室温、22〜25°C)で5分間、150 × g でスピンダウンします。上清を取り除き、細胞を10 mLの培養培地に静かに再懸濁します。
- 1.6-1.8 × 106個の細胞 を新しい15 cmディッシュ(~1 mLの細胞懸濁液)に播種します。
注:すべての組織培養作業は、BSL-2安全レベルで行う必要があります。トリプシン化のインキュベーション時間は、細胞のコンフルエント度によって異なります。通常、90%コンフルエントプレートの場合、このプロセスが完了するまでに2〜3分かかります。細胞は、市販のキットを用いて定期的にマイ コプラズマ 汚染のスクリーニングを行う必要があります( 材料表の例を参照)。
2. siRNAによる目的遺伝子(GOI)のノックダウン
- トランスフェクションの前日に、1.0×106 個のRPE1細胞を10 mLの培養培地で10 cmの組織培養処理プレートに播種します。
- トランスフェクション当日に、siRNAを複合体化します。10 cm プレートの場合は、最終濃度 20 nM siRPA2 と 12 μL の脂質ベースのトランスフェクション試薬を 500 μL の低血清トランスフェクション培地に含めます。チューブをフリックしてすべての成分を静かに混合し、室温(22〜25°C)で5分間インキュベートします。
- 複合体siRNA混合物を細胞に滴下し、細胞をsiRNAと48時間インキュベートします。
3. RPE1細胞のG0期への同期
- セクション1で概説されているように、ステップ2.3のRPE1細胞をトリプシン化します(~2×10、6 細胞)。
- 細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移し、150 × g、室温(22-25°C)で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を12 mLのPBSに再懸濁します。細胞を室温(22-25°C )で 150×gで5分間遠心分離します。上澄み液の除去と遠心分離を2回繰り返します。
- 100 μg/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、 15 mM HEPES を添加した 10 mL の無血清 DMEM に細胞を再懸濁し、10 cm の組織培養皿に播種します。
注:細胞が凝集する傾向がある場合は、わずか1 mLの無血清DMEMに再懸濁し、P1000チップを使用して5回ピペットで上下にピペットで固まりを取り除き、懸濁液の最終容量10 mLまで希釈します。 - 血清飢餓の24時間後、血清飢餓細胞に複合体siRNAを添加することにより、セクション2で説明したのと同じ手順で2回目のサイレンシングを導入します。
- RPE1細胞を無血清DMEMで72時間保持してから、G1放出に進みます。
4. カバーガラスコーティングとG1期への細胞の放出
- ピンセットを70%エタノールで滅菌し、ガラスカバーガラス1枚(直径12 mm、厚さ#1.5 [0.17 mm])を24ウェルプレートのウェルに入れます。
- ビトロネクチンコーティングマトリックスをPBSで希釈し、最終濃度10 μg/mLにします。カバーガラスを含む各ウェルに500 μLのビトロネクチン溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
- コーティング液を取り除き、カバーガラスを1 mLのPBSで洗浄します。
- 37°Cで1分間PBSを洗浄した後、1 mLの0.05%トリプシンを使用して、血清欠乏のRPE1細胞を10 cmの組織培養処理プレートから分離します。
注:細胞は血清飢餓後、はるかに速く剥離します。PBSで細胞を洗浄する際には注意が必要であり、トリプシン化時間は短くしてください。 - トリプシンを不活性化するには、RPE1細胞を合計6 mLの培養培地に再懸濁します。室温(22-25°C)で150 × g を使用して5分間細胞をスピンダウンすることにより、不活化トリプシンを除去します。
- 細胞を1mLの培養培地に再懸濁し、細胞数を測定します。
- 4個×10個のRPE1 細胞をコーティングされたカバーガラス上に、合計500μLの培養培地で播種する。
注:下流工程に進む前に、細胞生存率が90%を超えていることを確認してください。細胞生存率は、細胞計数ステップ中にトリパンブルー染色を行うことで迅速に評価できます。 - 細胞を培地に6時間プレーティングした後、G0放出細胞は初期G1期になります。細胞がS期に入る前に、この6〜12時間のウィンドウでG1で実験を行います。
- DNA損傷を導入する前に、培養培地で希釈した10 μMの5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)を37°Cで30分間、細胞をパルスします。
- EdUを含む培地を除去し、10 μMチミジンで37°Cで10分間細胞を追いかけ、DNA損傷誘導中にEdUが取り込まれるのを防ぎます。
- 培地をチミジンで除去し、培養培地で希釈した250μMH2O2で1時間細胞を処理する。
5. ssDNAの免疫蛍光染色
- 1 mLのRT(22-25°C)PBSで細胞を1回洗浄し、培地と血清成分を除去します。
注意: 細胞を洗うときは、剥離や乾燥を避けるために優しく行ってください。同時に多くのウェルを処理しないでください。 - 抽出前:洗浄した細胞を1 mLのCSK抽出バッファー(表1)中で、室温(22〜25°C)で5分間インキュベートします。
注:CSKの予備抽出では、可溶性RPA2を含むすべての非クロマチン結合タンパク質が除去されます。
注意: Triton X-100は飲み込むと有害であり、皮膚の炎症や目の損傷を引き起こす可能性があります。 - CSKバッファーを細胞から除去し、0.05% Triton X-100を含む3.6%パラホルムアルデヒド溶液(PBS)0.5 mLを室温(22〜25°C)で10分間添加して直接固定します。
注意:32%PFAストックから3.6%PFAを新たに調製することが重要です。パラホルムアルデヒドは、深刻な眼の損傷、皮膚の炎症、および呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。 - 0.05% Triton X-100 を含む PBS 1 mL で細胞を 1 回洗浄し、PFA を除去します。
- さらに、0.5% Triton X-100を含むPBS1 mLを使用して、室温(22〜25°C)で15分間細胞を透過処理します。
- 複製細胞を可視化するEdUクリック-IT反応(S期)
- 透過処理溶液を除去し、1 mLのブロッキングバッファーを使用して細胞を2回洗浄します(表1)。
注意:ウシ血清アルブミン(BSA)は呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。 - 1 mLのブロッキングバッファー(表1)を加え、カバーガラス入りプレートを室温(22〜25°C)で10分間静かに揺動させます。
- ブロッキングバッファーを除去し、ピコリルアジド 647 を含むクリック反応カクテル 500 μL を添加します(表 1)。カバーガラスを室温(22-25°C)で30分間穏やかなロッキングでインキュベートし、暗所で下流のインキュベーションを行います。
注:BrdU抗体を使用する場合は、メーカーが推奨する2倍の量(1 mL)と時間(60分)を使用して、反応が飽和し、取り込まれたEdUが標識されるようにします。これにより、BrdU抗体の交差反応性が制限される27。
- 透過処理溶液を除去し、1 mLのブロッキングバッファーを使用して細胞を2回洗浄します(表1)。
- クリック反応混合物を除去し、0.05% Triton X-100を含むPBSで細胞を室温(22-25°C)で10分間2回洗浄します(図1 および 図2)。
- ブロッキングバッファー1 mLを加え、室温(22-25°C)で30分間インキュベートします。あるいは、細胞をブロッキングバッファーに入れて4°Cで一晩保管します。
- 一次抗体(抗RPA2ラット、1:1,000希釈)を室温(22-25°C)で2時間、250-500 μLのブロッキングバッファーに穏やかに揺動しながら適用します。
- 0.05% Triton X-100を含むPBSで細胞を2回洗浄し、ほとんどの抗体溶液を素早く除去します。
- 室温(22-25°C)のブロッキングバッファーで細胞を3 x 10分間洗浄し続けます。
- 二次抗体(抗ラットAlexa-488、1:1,000希釈)を250-500 μLのブロッキングバッファーに室温(22-25°C)で2時間穏やかに揺動させながらアプライします。
- ブロッキングバッファーで細胞を2回洗浄し、ほとんどの二次抗体を迅速に除去します。0.05% Triton X-100を含むPBSを用いて、室温(22-25°C)で細胞を3 x 10分間洗浄し続けます。
- 核を対比染色するには、0.05% Triton X-100 と 1 μg/mL の 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む PBS で細胞を 1 回、室温 (22-25 °C) で 10 分間洗浄します。細胞をPBSで1回、室温(22〜25°C)で5分間洗浄します。
- 10 μLの封入剤/カバーガラスを使用して、カバーガラスを顕微鏡スライドに取り付けます。取り付ける前にカバーガラスを蒸留水に浸して、塩の結晶を取り除きます。翌日にスライドを画像化し、4°Cで数週間保存します(図3)。
6. 画像の取得と定量化
- 画像をキャプチャするには、ルーチンフィルターセットを備えた利用可能な落射蛍光顕微鏡を使用して、少なくとも60〜63倍の倍率、高開口数、およびオイル対物レンズを備えたDAPI、FITC、およびCy5チャネルをイメージングして、核焦点を視覚化します。
注:最適なDAPI励起は~359 nmです。Alexa 488の励起は~488 nmです。一方、Alexa 647の励起は~647nmです。 - 画像解析は、Fiji/ImageJ で画像ファイルを開きます。
- DAPI染色を用いて核マスクを作製する(図4A-Fおよび補足ビデオS1)。
- DAPI イメージを開きます。
- [プロセス] |コントラストを強め、彩度ピクセルを 0.35 に設定します。
- [ プロセス] |バイナリ |マスクに変換。 バイナリの選択 |穴を埋めて 、 分析 |パーティクルを解析します。 サイズ を 10-Infinity に設定します。
- ROIマネージャーで、すべて表示をクリックします。
- 核内のRPA2病巣の発見(図4G、H および 補足ビデオS1)
- RPA2 イメージを開きます。
- [プロセス] |マキシマを見つける。プロミネンスを RPA2 焦点を強調する値 (500 から 750 の間) に設定し、背景から分離します。
- 最後に、ROI マネージャーの [測定] ボタンをクリックします。
- RawinDen列の値を255(各焦点のピクセル強度の最大値)で割って、核のssDNA焦点の総数を計算します。
- 好みの統計ソフトウェアツールを使用して統計分析を実行します。
注:すべてのEdU陽性細胞および不適切にセグメント化されたDAPIマスクを分析から除外します。
- DAPI染色を用いて核マスクを作製する(図4A-Fおよび補足ビデオS1)。
Representative Results
G1におけるssDNA検出の限界を克服するために、我々は、ssDNA焦点検出の特異性と強度の両方を高めるRPA2を利用した35。正確な細胞同期を実現するために、効率的に血清を欠乏させ、G0期に同期させることができるRPE1細胞を使用しました。その後、血清欠乏後の血清の添加により、細胞周期に再び入るように誘導することができます。同期効率を確認するために、細胞をEdUで標識し、そのDNA含有量をヨウ化プロピジウムで標識しました。さらに、フローサイトメトリーにより定性的および定量的な結果を収集しました(補足図S1A)。ドットプロットは、72時間の血清飢餓後、細胞の~98%がG0期にあることを示しています。血清含有培地を6時間添加した後、細胞は細胞周期に再入りし( 図1Aのp27レベルの増加に見られるように)、G1には~97%の細胞があるのに対し、S期には<1%の細胞しかなく、G2期には<2%の細胞しかありません(補足図S1A)。細胞に血清を20〜28時間添加した後、フローサイトメトリープロット(補足図S1A)に示すように、細胞は徐々にS期を通過します。このセル同期のプロトコルは~97%の純粋なG1人口(血清の飢餓の72時間の後の6時間のポストの血清の付加)を与える。同期効率をさらに検証するために、ウェスタンブロッティング(図1A および 補足図S1B)を使用して血清放出後の細胞周期マーカーの発現を比較し、並行してEdU取り込みアッセイを実施してDNA複製を可視化しました。また、EdU染色では、同期効率とG1期でのDNA複製の欠如が強調されています(図1B、C)。
哺乳類細胞中のssDNAを検出する従来の方法は、ssDNA中のBrdUの検出に依存しています。図2Aは、H2O2およびネオカルチノスタチン(NCS)処理において、BrdU焦点はS期細胞においてのみ検出可能であったが、非S期細胞ではssDNA病巣は検出できなかったことを示している。また、BrdU抗体染色では、細胞周期の段階や適用された処理に関係なく、すべての核で検出できる顕著な核小体バックグラウンド染色が示されました。ここで説明した EdU クリックプロトコルでは、図 2A の未処理サンプルで明らかなように、EdU と BrdU の焦点の共局在を検出できませんでした。交差反応性から生じるBrdUシグナルを完全に排除するために、EdU標識を避け、サイクリンA2をS-G2マーカーとして使用しました。しかし、サイクリンA2染色ではCSKの予備抽出はできず、この条件下では、遺伝毒性ストレス後でもBrdU病巣は見られませんでした(補足図S2A)。このことは、抗BrdUベースのssDNA染色にはCSKの予備抽出が必要であるという事実を浮き彫りにしています。コントロールとして、変性条件下でのBrdU抗体染色試験を行いました。これにより、DNAが開き、取り込まれたBrdUが露出し、BrdUが均一に取り込まれたことが明らかになった(補足図S2B)。
対照的に、RPA2染色は、S期だけでなく、他の細胞周期期でもNCSおよびH2O2依存性病巣形成を示します(図2B)。また、対照として、複製中の細胞にのみssDNAが蓄積するHUで細胞を処理しました。予想通り、EdU陽性細胞のRPA2抗体によるHU処理でのみシグナル増加が検出され、このアプローチの特異性が浮き彫りになりました。RPA2抗体は、外因性の遺伝毒性ストレスがない場合でも、複製中に自然に発生するssDNA形成を検出することができます(図2B)。RPA2抗体の感度が高いことから、従来のBrdU染色では遺伝毒性ストレスによるシグナルを検出できなかったG1期にRPA2抗体を利用しようとしました(補足図S2C)。図3Aは、H2O2処理時のssDNA病巣の形成が、抗RPA2抗体を用いた場合、G1においても検出可能であったことを示している。H2O2処理時に、これらの核におけるRPA2病巣の数が有意に増加した(図3B)。これらの病巣はRPA2に特異的であり、RPA2のサイレンシングはIF信号を消失させました(図3A、B)。図3Cおよび補足図S1Cは、これらのセルにおけるRPA2サイレンシングの効率を示しています。RPA2によるssDNAの検出は、従来法と比較して感度が高いため、G1期細胞への応用が可能です。
図1:血清飢餓後のRPE1細胞の同期効率。 (A)イムノブロットは、非同期、G1、およびS期同期RPE1細胞におけるタンパク質レベルを示します。(B)代表的な画像は、固定前に10 μM EdUに30分間曝露し、Click-IT反応によって可視化した非同期、G1、およびS期同期RPE1細胞を示しています。DAPIは、核DNAの対比染色に使用されました。スケールバー = 50 μm。 (C)グラフは、DAPIで評価した全細胞集団に対するEdU陽性細胞の割合を示しています。エラーバーは平均の標準誤差を表し、分析された核の数は、AS n = 219、G1 n = 630、S n = 437でした。略語:RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;AS = 非同期;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:DNA損傷時のBrdU抗体またはRPA2抗体によるssDNA検出。 (A)代表的な画像はαBrdUを用いたssDNA病巣(緑)、S期細胞はEdU(紫色)、DAPIを用いた核DNAの対比染色(青色)を示しています。RPE1細胞は、追加処理の前に10μMのBrdUで48時間保持しました。48時間後、細胞を10μMのEdUで30分間パルスした後、H2O2(250μM)を1時間またはネオカルチノスタチン(0.5μg/mL)で4時間処理した。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。右のパネルは、示されたS期または非S期の核の拡大画像です。(B)代表画像はαRPA2抗体を用いたssDNA病巣(緑)。S期細胞はEdU(紫色)で強調表示されており、DAPIは核DNAの対比染色(青色)に使用されました。RPE1細胞を10μMのEdUで30分間パルスした後、1時間H2O2(250μM)、4時間のヒドロキシ尿素(2mM)、または4時間のNCS(0.5μg/mL)のいずれかでパルス化しました。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 10 μm。右のパネルは、示されたS期または非S期の核の拡大画像です。略語:ssDNA = 一本鎖DNA;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;NCS = ネオカルチノスタチン;HU = ヒドロキシ尿素。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:RPA2抗体を用いたG1期のssDNA病巣の検出。 (A)RPE1細胞に、RPA2を標的とするsiRNAまたは非標的siRNAコントロールのいずれかをトランスフェクションし、続いてG1で同期し、10μMのEdUで30分間パルス標識した後、必要に応じてH2O2(250μM)で1時間処理しました。 DAPIは、核DNAの対比染色に使用されました。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。 (B)RPA2の病巣/核の数の測定は、2つの独立した実験から行われました。分析中に考慮されたのは、EdU陰性細胞のみです。線はプロットの平均値を表します。統計分析のためにノンパラメトリック分散分析検定(Kruskal-Wallis)を実行しました。星印は P < 0.0001 を示しています。分析した核数は、siNTなしH2O2n=513、siNTH2O2n=603、siRPA2なしH2O2n=266、siRPA2H2O2n=536であった。(C)siRNAノックダウンの効率は、イムノブロッティングで示されています。略語: siNT = non-targeting siRNA control;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:フィジーを用いたssDNA病巣の定量。核内のRPA2病巣数を評価する方法を示すフィジーでの詳細な手順。(A-E)DAPIチャネルを使用した核マスクの作成。(F-H)バックグラウンドシグナルから個々の核 ssDNA 病巣を特定するための閾値処理。略語:ssDNA = 一本鎖DNA;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 細胞骨格(CSK)バッファー | |
| パイプpH 7.0 | 10ミリメートル |
| NaCl(ナトリウム) | 100ミリメートル |
| EDTAのpH 8 | 1ミリメートル |
| MgClの2 | 3ミリメートル |
| D-スクロース | 300ミリメートル |
| トリトンX-100 | 0.20% |
| ホスファターゼ阻害剤カクテル | 10mLあたり1錠 |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | 10mLあたり1錠 |
| ddH2Oで希釈 | 該当なし |
| 洗浄バッファー | |
| トリトンX-100 | 0.05% |
| PBSで希釈 | 該当なし |
| 透過処理バッファー | |
| トリトンX-100 | 0.50% |
| PBSで希釈 | 該当なし |
| 固定ソリューション | |
| パラホルムアルデヒド | 3.60% |
| トリトンX-100 | 0.05% |
| PBSで希釈 | 該当なし |
| ブロッキングバッファ | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 5% |
| トリトンX-100 | 0.10% |
| PBSで希釈 | 該当なし |
| Click-iT Plusリアクションカクテル | |
| 1x Click-iT 反応バッファー | 435 mLの |
| Alexa Fluor PCAソリューション | 5 mLの |
| CuSO4銅保護剤プレミックス | 10 mLの |
| 1x Click-iT バッファー添加剤 | 50 mLの |
| 総ボリューム | 500 mLの |
表1:このプロトコルで使用されるバッファーの構成。
補足図S1。 (A)RPE1細胞は、血清飢餓状態を72時間使用してG0期に同期させ、その後、血清を再導入することにより、異なる細胞周期期に放出した。ドットプロットは、G0/G1、S、またはG2/M期の細胞を示し、時間は血清飢餓後の血清の再添加後の時間を示します。右のグラフは、各条件におけるG0/G1、S、G2/Mセルの割合を示しています。FACS分析は、メーカーの推奨に従って、EdUおよびヨウ化プロピジウムを使用した市販の細胞増殖キットを使用して実施しました。(B) 図1のトリミングされていないウェスタンブロットスキャン。数値は分子量マーカーをkDaで示しています。PARP1をローディングコントロールとして使用し、メンブレンを切断することにより、CCNA2、p27(PCNA用にさらに剥離)、およびpH3(S10)(H3用にさらに剥離)に対しても開発されたゲルにロードしました。CCNB1 と RPA2 を別々のゲルにロードし、同量のタンパク質ライセートを使用して比較可能性を確保しました。(C) 図3のトリミングされていないウェスタンブロットスキャン。数値は分子量マーカーをkDaで示しています。略語:EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:(A)代表的な画像は、BrdU抗体を用いたssDNAの病巣を示す(緑)。S期細胞はサイクリンA2(赤)で強調表示されます。DAPIは核DNA(青)の対比染色に使用されました。RPE1細胞を10μMのBrdUに48時間浸かってから、さらに処理しました。48時間後、細胞をH2O2(250μM)で1時間処理するか、ネオカルチノスタチン(0.5μg/mL)で4時間処理してから固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。 (B)変性条件ありおよびなしのRPE1細胞のBrdU染色。非同期RPE1細胞を10μMのBrdUで48時間前処理しました。スケールバー = 10 μm。 (C)BrdUの病巣/核の数の測定は、G1同期RPE1細胞における2つの独立した実験から実施されました。分析中に考慮されたのは、EdU陰性細胞のみです。線はプロットの平均値を表します。統計分析のためにノンパラメトリック分散分析検定(Kruskal-Wallis)を実行しました。「ns」は有意でない差を示します。分析された核の数は、NT n=52、NCS n = 105、H2O2 n = 82であった。略語: siNT = non-targeting siRNA control;BrdU = 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;NCS = ネオカルチノスタチン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1:フィジーベースのRPA2焦点分析の画面録画。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
マイコプラズマを含まない健康な細胞培養を維持することは、上記のすべての実験にとって重要です。RPE1細胞は、通常の培養培地下で組織培養処理されたプラスチック器具に強く接着します。ただし、無血清状態で保管すると、それらの結合特性は著しく低下します。さらに、顕微鏡下でssDNA病巣の高解像度画像を撮影するには、RPE1細胞の適切な接着をサポートするのに十分な親水性がない厚さ0.17mmのカバーガラスに細胞をプレーティングする必要があります。細胞が適切に扁平化され、均一に分布していないと、個々のssDNA病巣を可視化することは非常に困難です。したがって、適切なコーティング材料(ビトロネクチンなど)を選択し、細胞をG1期に放出した後、細胞が拡散して付着するまでに十分な時間(6〜12時間)を残すことが重要です。
プロトコルの挑戦的な部分は同質なG1によって合わせられるRPE1セルを得ることである。これには、2 つの重要な手順が必要です。まず、血清飢餓を効率的に行うには、細胞をトリプシン処理し、PBSで十分に洗浄し、無血清培地を使用して新しい組織培養皿に直接播種する必要があります。細胞を組織培養皿で直接洗浄して血清を除去しても、効率的なG0同期は得られません。第二に、細胞をG1期に放出する際には、細胞を再びトリプシン処理し、新鮮な組織培養プレートに播種する必要があります。同様に、培地を交換して血清含有培地を細胞に添加するだけでは、同期G1エントリーは得られません。さらに、適切なG1エントリーのためには、コーティングされたカバーガラス上の細胞の播種密度が特定のコンフルエンシーレベルである必要があります。完全な細胞同期は一般的に達成不可能ですが、ここで説明するこの同期プロトコルは、~97%の純粋なG1集団を提供します。直径 12 mm のカバーガラス上の RPE1 の推奨播種密度は、約 70% のコンフルエントで、イメージングに均一な視野を得るために、~4 × 104 です。播種密度が高いと、CSK抽出後に細胞が剥離して「剥離」し、画像取得時のバックグラウンドシグナルが高くなります。
バックグラウンドシグナルを低減し、良好なS/N比を達成するには、一次抗体および二次抗体のインキュベーション後に徹底的な洗浄を行うことが不可欠です。多数の洗浄ステップが適用されるため、各洗浄ステップ中にウェルが乾燥するのを防ぐことも不可欠です。すべての洗浄およびインキュベーションステップで最低0.05%のTriton X-100を塗布することで、このアーチファクトを最小限に抑えます。ウェルが乾燥すると、細胞のS/N比が変化しました。これにより、顕微鏡下でモザイク状のパターンが発生し、評価に支障をきたす可能性があります。Zスタック画像取得とデコンボリューションを組み合わせることで、異なる焦点面の焦点を捉え、分析を改善することができます。
従来の方法では、非変性条件下で取り込まれたBrdUの検出に依存しています。しかしながら、これらの方法は、均一なゲノム取り込みを確実にするために、少なくとも1〜2日間(または使用した細胞株における全細胞周期に相当する時間)の高用量のBrdUで細胞を前処理することに依存する。望ましくないことに、広範囲のBrdU取り込みは細胞周期干渉を引き起こす可能性がある36。これらの制限に対処するために、この方法では内因性RPA2を利用してssDNAの病巣を検出します。このアプローチは、複製駆動型のBrdUを取り込む必要はなく、有糸分裂後細胞にも使用できます。広範囲のBrdU取り込みが不要なため、時間が節約され、実験の複雑さが軽減されます。RPA2染色を用いてssDNAを可視化することで、2′-デオキシ-5-エチニルウリジン(EdU)とクリックケミストリーを用いてDNA複製をマークすると同時に、EdUに対するBrdU抗体の交差反応性を回避することができます27,37,38。BrdU抗体がEdUと交差反応しないように、クリック反応中に取り込まれたEdUを適切にマスクするように特別な注意を払う必要があります27,39。
最後に、BrdU の代わりに RPA2 を使用する重要な利点は、S 相外で染色する BrdU と比較して、S/N 比が優れていることです。その結果、非変性BrdU染色とそのssDNAを可視化する能力は、複製細胞においてもS期に限定されることがわかりました(図2)。BrdU抗体は、ssDNA伸長において十分に露出したBrdUにのみ結合します。RPA2を含む修復タンパク質のssDNA伸長への結合は、ssDNA中のBrdUの十分な曝露を抑制または妨げる可能性があります。また、BrdU抗体を用いたssDNAの可視化にはCSKの予備抽出が必要であることもわかりました。これが可能なのは、ssDNAトラックから軽く結合したタンパク質成分を除去しなければ、抗体がssDNAトラックにアクセスできないためです。
それにもかかわらず、このプロトコルにはいくつかの制限があります。ssDNA 検出に RPA2 を使用する場合の制限は、CSK の抽出前ステップを最適化する必要があることです。結合していない過剰なRPA2は、細胞を固定する前にDNAから洗い流す必要があります。一方では、抽出不足は、ssDNAに結合していないRPA2タンパク質画分のために高いバックグラウンドにつながります。一方、過剰抽出は信号損失につながります。BrdU検出の場合、BrdUはDNAに安定して取り込まれ、予備抽出では洗い流すことができないため、これは変数ではありません。したがって、CSK予備抽出の時間、バッファー中のTriton X-100の量、容量、および予備抽出を行う温度を慎重に検討する必要があります。また、CSKの事前抽出では、G0/G1細胞とS/G2細胞を区別するための核サイズの使用が制限されます。
さらに、RPA2から発せられるシグナルの一部が、他のクロマチン結合タンパク質相互作用因子に結合していることに由来する可能性を排除することはできません。また、RPA2抗体の種特異性も考慮する必要があります。このプロトコルで使用される抗体は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、およびサルのRPA2を認識できます。このアプローチのもう1つの限界は、すべての細胞株がG0同期のために血清不足になるわけではないことです。ほとんどのがん細胞株は、細胞周期チェックポイントをバイパスし、血清欠乏培地でも増殖します。血清飢餓は有益ですが、DNA損傷を引き起こさないため、適切な細胞周期期の濃縮が達成されていることを確認するために、細胞同期効率を注意深く監視する必要があります。血清欠乏に反応しない細胞については、他の細胞同期法を検討する必要があります(例えば、有糸分裂シェイクオフ、G2停止に対するCDK1阻害、または遠心水簸などの非侵襲的技術)。別の可能な方法は、非同期細胞の細胞周期プロファイリングのためにEdUおよび核DNA含量を測定するためにハイコンテントイメージングを使用することである31。ダウンストリーム分析との干渉を防ぐために、別の同期方法を利用することの意味を考慮する必要があります。例えば、文献でよく用いられる二重チミジンブロックやアフィジコリンの使用は、複製ストレスとDNA損傷をもたらす40。
DNA修復機構の解明は、がんや細胞生物学の分野でも議論の焦点となっています。ここに示されるプロトコルは細胞の準備のための貴重なアプローチを提供し、DNA損傷の代理店への露出にssDNAの視覚化そして量的な分析を可能にする。特に、このプロトコルは、ssDNA結合タンパク質であるRPA2の利用を強調しており、すべての細胞周期段階で不要な交差反応性を回避しながら、少量のssDNA病巣を視覚化する高い特異性を示しています。RPA2の使用は、特に細胞周期のG1期の細胞を分析することを目指す研究者にとって、多くの利点をもたらします。このプロトコルでは、いくつかの制限を考慮し、RPA2またはBrdU染色を使用してssDNAを検出する際のシグナル干渉、望ましくないバックグラウンドノイズ、および交差反応性に関連する懸念に対処します。
Disclosures
著者は、宣言する競合する利害関係を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、Michele Pagano氏の支援と有益な洞察、原稿を批判的に読んでくれたAshley Chui氏とSharon Kaisari氏、そして継続的な支援をしてくれたJeffrey Estrada氏とVilma Diaz氏に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金GM136250の多様性に関する補足措置によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
| Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
| Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
| BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
| CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
| Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
| cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
| Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
| Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
| DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
| D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
| Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
| EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analogue |
| Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
| Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
| Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
| FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
| hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
| Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
| Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
| Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
| Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
| MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
| NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
| onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
| p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
| PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
| PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
| pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
| PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
| Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
| Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
| Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
| Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
| Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
| Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
| Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |
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