JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

マウス糸球体の標識と分析のための効率的で迅速な方法

Published: February 09, 2024
doi:
10.3791/65973
, , , , , ,
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital,Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital,Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital,Sichuan University

Summary

この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。

Abstract

糸球体は腎臓の基本単位です。したがって、糸球体を研究することは、腎機能と病理学を理解する上で極めて重要です。生物学的イメージングは直感的な情報を提供します。したがって、糸球体にラベルを付けて観察することは非常に重要です。しかし、現在使用されている糸球体観察法は複雑な操作を必要とし、その結果、ラベルの詳細や3次元(3D)情報が失われる可能性があります。透明で遮るもののない脳イメージングカクテルとコンピューター解析(CUBIC)組織透明化技術は、腎臓研究で広く使用されており、より正確な検出とより深い検出深さを可能にしています。マウス糸球体は、中分子量のFITC-デキストランの尾静脈注入とそれに続くCUBIC透明化法により、迅速かつ効果的に標識できることを見出しました。透明化したマウスの腎臓をライトシート顕微鏡(スライスした場合は共焦点顕微鏡)でスキャンし、腎臓全体のすべての糸球体の3次元画像スタックを得ることができた。適切なソフトウェアで処理することで、糸球体信号を簡単にデジタル化し、さらに分析して糸球体の数、体積、頻度を測定することができます。

Introduction

糸球体の数と量は、さまざまな腎臓病の診断と治療にとって非常に重要です1,2,3,4,5。糸球体数推定のゴールデンスタンダードは、物理的なディセクタ/フラクショネーターの組み合わせです。ただし、この方法は特別な試薬と機器を必要とするため、時間がかかり、高価になります6,7,8,9。生検は豊富な情報を提供しますが、明らかに、この方法は大まかな推定にのみ適しています10,11。磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、X線などの医用画像技術も糸球体検出に広く使用されています12,13,14,15が、そのような技術にはかさばる機器が必要です。マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)イメージング質量分析計16や厚切片および薄切片法17などの新しい方法も糸球体検出に使用されていますが、それらは依然として退屈で手間がかかります。

透明化技術の助けを借りて、より深い深さを観察し、厚い組織または臓器全体からさえ、より豊富で完全な情報を得ることができます18,19,20,21,22,23。そのため、腎臓の研究において透明性技術が広く用いられてきた24。透明な腎臓における糸球体の観察と検出も関与しています。しかし、これらの発表された論文は、糸球体検出25に簡潔に言及したに過ぎず、糸球体を標識するためにトランスジェニック動物26、自己生産色素13、または高濃度抗体インキュベーション27などの達成困難な標識方法を使用していた。さらに、透明な腎臓の糸球体を分析した研究もあったが、その分析は常に限定的であったり13、著者自身が確立した分析アルゴリズムに依存していたりした26。

我々は以前、マウスの腎臓の糸球体を標識するより便利な方法を実証した28。Imarisを用いることで、糸球体数、頻度、体積を素早く得ることができることが分かりました。したがって、ここでは、マウスの腎臓の糸球体を標識および分析するための、よりアクセスしやすく、包括的で、簡略化された一連の方法を提示します。

Protocol

この研究では、成体C57BL / 6マウス(6週齢、25〜30 g)を使用しました。すべての手順は、動物福祉と実験倫理の地域の規制に準拠して行われました。この研究は、四川大学生物医学研究倫理委員会の華西病院によって承認されました。 1.糸球体標識と組織調製 糸球体ラベリングFITC-デキストラン(10 mg)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1:1(1 mg:1 mL)の比率…

Representative Results

この研究は、マウスの腎臓の糸球体を標識および分析するための簡単で効率的な方法を提供します。 糸球体(血管)は、血管内注射のFITC-デキストランによって十分に標識できます。透明化プロセス後、腎臓は透明になり(図1A)、糸球体はライトシート顕微鏡(図1B)または共焦点顕微鏡(図1C)を使用してはっき?…

Discussion

組織透明化技術は、3つまたは4つのグループ29、30、31に分類できます。有機溶媒ベースの組織透明化(DISCOやPEGASOSなど)、水性組織透明化(CUBICなど)、ハイドロゲル包埋組織透明化(CLARITYなど)はすべて、腎臓の透明化に適用されています25,26,28,32。<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、中国国家自然科学基金会(82204951)および四川省科学技術プログラム(2020JDRC0102)の助成を受けて行われました。

Materials

4% PFA Biosharp 7007171800 Fixation reaagen
502 Glue  Deli 7146 For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
Antipyrine Aladdin A110660 Clearing reagent
Brain Matrix RWD Life Science 1mm 40-75 Tissue slicing
Confocal microscopy Nikon A1plus Image acquisition
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD150S Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy  Zeiss Light sheet 7  Image acquisition
Mice Ensiweier Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-Butyldiethanolamine Aladdin B299095 Clearing reagent
Nicotinamide Aladdin N105042 Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz Sigma-Aldrich P3761
Tail vein fixator JINUOTAI JNT-FS35 Fix the mouse for vail injection
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Clearing reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
  14. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  21. Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
  26. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
  29. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).

Tags

Keywords: Glomeruli LabelingKidney AnalysisLight-sheet Microscopy3D ImagingGlomeruli QuantificationRenal ResearchFast And Efficient Method
check_url/65973?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bai, L., Wu, Y., Dai, W., Shi, Q., Wu, L., Zhang, J., Zheng, L. An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli. J. Vis. Exp. (204), e65973, doi:10.3791/65973 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image