Summary
本研究提出了一套易于使用、完整且简单的方法来标记和分析来自 CUBIC 清除的小鼠肾脏的肾小球。使用异硫氰酸荧光素 （FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜 （LSFM） 或常见的共聚焦显微镜和软件（如 Imaris）可以轻松可靠地获得肾小球数量和体积等数据。
Abstract
肾小球是肾脏的基本单位;因此，研究肾小球对于了解肾功能和病理学至关重要。生物成像提供直观的信息;因此，标记和观察肾小球具有重要意义。然而，目前使用的肾小球观察方法需要复杂的操作，并且结果可能会丢失标签细节或三维（3D）信息。清晰、畅通无阻的脑成像鸡尾酒和计算分析（CUBIC）组织清除技术已广泛应用于肾脏研究，可实现更准确的检测和更深的检测深度。我们发现，通过尾静脉注射中等分子量的FITC-葡聚糖，然后采用CUBIC透明化方法，可以快速有效地标记小鼠肾小球。清除的小鼠肾脏可以通过光片显微镜（或切片时的共聚焦显微镜）扫描，以获得整个肾脏中所有肾小球的三维图像堆栈。使用适当的软件处理，肾小球信号可以很容易地数字化并进一步分析，以测量肾小球的数量、体积和频率。
Introduction
肾小球的数量和体积对于各种肾脏疾病的诊断和治疗非常重要1,2,3,4,5。肾小球数估计的黄金标准是物理解剖器/分馏器组合。然而，这种方法需要特殊的试剂和设备，使其速度慢且昂贵6,7,8,9。活检提供了丰富的信息，但显然，这种方法只适用于粗略估计10,11。医学成像技术，包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和X射线，也广泛用于肾小球检测12,13,14,15，但这些技术需要笨重的仪器。新方法，如基质辅助激光解吸/电离 （MALDI） 成像质谱仪16 或厚薄切片法17，也已用于肾小球检测，尽管它们仍然繁琐而费力。
在透明技术的帮助下，可以观察更深的深度，并从厚组织甚至整个器官中获得更丰富、更完整的信息18,19,20,21,22,23。因此，透明技术在肾脏研究中得到了广泛的应用24。还涉及清除肾脏中肾小球的观察和检测。然而，这些已发表的文章要么只是简单地提到肾小球检测25，要么使用难以实现的标记方法，如转基因动物26、自产染料13或高浓度抗体孵育27来标记肾小球。此外，尽管研究分析了清除肾脏中的肾小球，但分析总是有限的13或依赖于作者自己建立的分析算法26。
我们之前已经展示了一种更方便的方法来标记小鼠肾脏中的肾小球28。通过使用 Imaris，我们发现可以快速获得肾小球计数、频率和体积。因此，在这里，我们提出了一套更易于访问、更全面和更简化的方法来标记和分析小鼠肾脏的肾小球。
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Protocol
本研究使用成年C57BL / 6小鼠（6周龄，25-30g）。所有程序均按照当地动物福利和实验伦理法规进行。该研究已获得四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会的批准。
1. 肾小球标记和组织制备
- 肾小球标记
- 将FITC-葡聚糖（10mg）以1：1（1mg：1mL）的比例溶解在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以制备工作探针溶液。
注意：工作溶液可以在4°C下储存1个月。 - 将C57小鼠置于小鼠尾静脉固定器中。用热水润湿纱布，将纱布缠绕在老鼠尾巴的中间部分，然后将尾巴加热1分钟。
- 用75%乙醇擦拭鼠尾，直到左右尾静脉可见。
- 用 1 mL 胰岛素注射器抽取 100 μL 工作探针溶液，然后将溶液缓慢注入小鼠尾静脉。
- 注射后，让探针溶液循环30分钟。让老鼠在笼子里自由移动。
- 一旦达到足够的循环，通过腹膜内注射戊巴比妥钠（1%，60-80μg/ kg）深度麻醉小鼠。
- 将FITC-葡聚糖（10mg）以1：1（1mg：1mL）的比例溶解在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以制备工作探针溶液。
- 肾脏取样和固定
- 将麻醉的小鼠以仰卧位固定在解剖板上。用医用胶带固定他们的爪子。
- 皮肤制备后，用致死剂量的戊巴比妥钠（1%，10mg / kg）对小鼠实施安乐死。
- 做一个腹部中线切口，露出腹腔。
- 露出肾脏，用手术刀和剪刀在通风橱中取出。轻轻取出肾包膜。
- 收集肾脏并将其固定在4°C的4%多聚甲醛（PFA）中过夜。
- 用PBS洗涤样品三次，每次1小时，在室温（RT）下振荡。
- 准备肾脏进行显微镜检查。
- 将肾脏切片进行共聚焦显微镜检查：使用脑基质（1 mm 钢，40-75 g）将肾脏切成 1 毫米厚的薄片，以标准化切片厚度。将切片转移到4%PFA中，并在4°C下继续固定过夜。
- 用于光片显微镜的全肾：将肾脏固定在4°C的4%PFA中48小时。
2. 清算
- 试剂制备
- 通过混合10%（wt/wt）N-丁基二乙醇胺，10%（wt/wt）Triton X-100和80%ddH2O来制备CUBIC-L试剂。
- 通过混合 45% （wt/wt） 安替比林、30% （wt/wt） 烟酰胺、0.5% （vol/vol） N-丁基二乙醇胺和 24.5% ddH2O 来制备 CUBIC-R 试剂。 确保溶液的 pH 值为 9.6-9.8，折射率 （RI） 为 1.522。
注意：CUBIC-L 用于脱脂，CUBIC-R 用于折射率匹配。
- 清算程序
- 在50mL离心管中收集肾脏样品，然后在CUBIC-L中以60rpm在37°C下振荡清除它们。 每 4 小时更换一次 CUBIC-L（用于肾切片）或每 24 小时更换一次（对于整个肾脏），直到达到令人满意的光学透明度。
注意：此过程对肾脏切片需要 1 天，整个肾脏需要 5 天。 - 在PBS中洗涤样品三次，在室温下轻轻摇动1小时。
- 将CUBIC-R施加到样品上，在37°C，60rpm下振荡样品6小时。
- 直接观察清除的样品或将它们储存在装有CUBIC-R的黑色试管中，在室温下储存1周。
- 在50mL离心管中收集肾脏样品，然后在CUBIC-L中以60rpm在37°C下振荡清除它们。 每 4 小时更换一次 CUBIC-L（用于肾切片）或每 24 小时更换一次（对于整个肾脏），直到达到令人满意的光学透明度。
3. 图像采集
- 共聚焦成像
注意：用共聚焦显微镜（镜头：Plan Apo λ 4×/0.2 N1物镜或Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1物镜）对切片的肾脏样本进行成像。使用 z 堆栈捕获大图像（例如，肾切片为 6052 μm x 6052 μm）。- 按以下顺序打开共聚焦显微镜：激光功率、共聚焦控制开关、计算机、显微镜和共聚焦硬件。运行自检后，打开共聚焦软件。
- 选择合适的镜头。从 CUBIC-R 试剂中取出样品，将其放入共聚焦培养皿中，并盖上盖子以防止 CUBIC-R 试剂变干。
- 将样品移动到视野中间并调整焦平面，直到其对焦。
- 应用3D重建（步骤3.1.4.1）和大图像重建（步骤3.1.4.2-3.1.4.3）。
- 3D重建（共聚焦）：在一个方向上切换变焦平面，直到看不到荧光;此位置被定义为顶部。然后，将变焦平面向相反方向切换，直到看不到荧光;这个位置被定义为底部。单击对话框右下角的 “运行 ”按钮开始扫描。
- 大图像重建（共聚焦）：将视场移动到样品中间，并将当前位置设置为中心。选择 2 x 2 视场。
- 在ND多功能界面中，选择 Z堆栈 重建大图，并在面板中设置不同的选项。然后按 Run butto n 开始扫描。
- 光片荧光显微镜（LSFM）成像
注意：用光片荧光显微镜（镜头：EC Plan-Neofluar 5x/0.16（中等n = 1.529）物镜）对整个肾脏进行成像。- 样品贴装 （LSFM）：
- 将透明肾脏粘在样品固定适配器上，等待肾脏牢固连接。
- 将肾脏浸泡在样品箱中，然后将样品箱推入显微镜系统。关闭舱口。
- 观察和扫描 （LSFM）：
- 在 定位 界面中，将样品移动到合适的观察位置。切换到 采集 界面，设置光路，选择 488nm激光器，LBF 405/488/561/640，光分光滤光片 块SBS LP 490，选择 相机2，将伪彩色更改为绿色。
- 填写之前记录在通道子菜单中的左/右 Z 偏移值。选择最小缩放 （0.36） 并对其进行微调以获得最大清晰度。
- 求出整个器官的 X\Y 边界和 Z 范围。调整激光强度和曝光时间（最好小于 10 毫秒），然后单击 “运行 ”开始。
- 如果组织太大，请使用图像拼接合并两个或多个图像。使用显微镜软件（此处为蔡司ZEN 3.7）打开捕获的文件。选择 “处理>方法”>“拼接”>“方法参数”>“应用 ”以完成图像拼接。
- 样品贴装 （LSFM）：
4. 数据处理和量化
注意：使用 Imaris（图像分析）软件处理图像堆栈，使用 Surface 功能标记肾小球并执行分析。
- 肾小球计数
- 将大图像（共聚焦显微镜）或拼接图像（光片显微镜）导入图像分析软件。
- 在图像分析软件中打开文件。单击“ Surface ”按钮以创建新的 Surface。按照屏幕左下角的指南进行操作。
- 单击 “下一步 ”按钮（向右箭头按钮）而不勾选任何内容。
- 勾选“平滑”选项前的框并输入适当的数字（例如，14.5）以控制曲面的细节。在阈值中选择背景减法，并在框中填充肾小球的近似平均直径。单击“下一步”按钮。
- 如果需要，请进行调整，然后单击 “下一步 ”按钮。选择适当的范围，然后单击 “下一步 ”按钮以创建 Surface。
- 单击 “过滤器”，然后单击 “添加 ”按钮以添加 Sphericity 以过滤掉非球形对象。单击 “复制 ”（Duplicate） 按钮以复制此新曲面。
- 单击“ 统计 ”按钮，然后单击 “整体 ”按钮;该软件将肾小球的数量显示为 表面总数。
- 肾小球体积
- 如上所述创建肾小球表面。
- 完成 Surface 后，单击“ 选择 ”按钮以选择目标对象并显示每个对象的体积。单击 “保存 ”按钮，然后将统计数据导出到电子表格以进行进一步分析。
- 切片或整个肾脏的体积
- 将大图像（共聚焦显微镜）或拼接图像（光片显微镜）导入图像分析软件。
- 在图像分析软件中打开文件。单击“ Surface ”按钮以创建新的 Surface。按照屏幕左下角的指南进行操作。
- 单击 “下一步 ”按钮（向右箭头按钮）而不勾选。
- 勾选“平滑”选项前的框，然后输入适当的数字（例如，50）以控制曲面的细节。在阈值中选择绝对强度。单击“下一步”按钮。
- 调整 Surface，直到它覆盖整个组织，然后单击“ 下一步 ”按钮。单击 “下一步 ”按钮以创建 Surface。
- 单击 “选择 ”按钮以选择整个组织的表面并显示组织的体积。单击 “保存 ”按钮将统计信息导出到电子表格。
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Representative Results
本研究为小鼠肾脏肾小球的标记和分析提供了一种简单有效的方法。
肾小球（血管）可以通过血管内注射 FITC-葡聚糖很好地标记。清除过程后，肾脏变得透明（图1A），并且可以通过使用光片显微镜（图1B）或共聚焦显微镜（图1C）清楚地观察到肾小球。共聚焦显微镜的扫描深度有限，因此应将肾脏切成约 1 毫米厚的切片。如果使用光片显微镜，可以直接扫描整个肾脏。
有了明确的信号，很容易计算出肾小球的数量。事实上，标签非常有效，可以用肉眼计数肾小球。肾小球的体积也可以直接测量。当然，像Imaris这样的软件大大加快了这一过程。使用 表面 功能，可以选择肾切片（图2）、整个肾脏（图3）或条带（图4）中的所有肾小球，并且可以直接获得肾小球的数量和体积（图2C， 图3C， 图4C）。也可以测量所选区域的体积（图2B， 图3B， 图4B），因此可以计算出某个区域或整个肾脏的肾小球体积比和频率（图2D， 图3D， 图4D）。可以选择肾脏的一个区域来执行特定区域的计算。我们展示了一种类似于活检的条带。条带中肾小球的数量、体积和频率也可以很容易地获得（图4）。
如图所示，本研究中给出的结果是（N =数字，F =频率，V =体积，V（a）=平均体积，V（t）=总体积）：
切片肾小球 N = 1128，全肾肾 N 肾小球 = 14006，切片肾小球 F = 65/mm3，全肾 F 肾小球 = 105/mm3，V 总肾小球切片/V切片 = 2.24%，全肾 V 总肾小球/V肾 = 5.54%，切片 V（a） 肾小球 = 373654 μm3，全肾 V（a） 肾小球 = 521627 μm3， 切片中的 V（t） 肾小球 = 421481724 μm3，整个肾脏的 V（t） 肾小球 = 7305386256 μm3（图 2D、图 3D）。
条带中的肾小球 N = 63，条带中的 F肾小球 = 72/mm 3，带状/V带中的 V总肾小球 = 2.23%，条带中的 V（a） 肾小球 = 307698 μm3，带状中的 V（t） 肾小球 = 19384977 μm3（图 4D）。
图 1：肾组织透明度和 FITC-葡聚糖标记的肾小球。 （A）透明治疗前后的肾脏。（B） 用 LSFM 扫描的整个肾脏的图像。（C）用共聚焦显微镜扫描的肾脏切片图像（左：4x，右：10x）。比例尺 = 300 μm（4x，共聚焦）;比例尺 = 100 μm（10 倍，共聚焦）。比例尺 = 700 μm（5 倍，变焦 0.36，LSFM）。肾小球用FITC-葡聚糖标记。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：应用于共聚焦扫描肾切片的功能 Surface。 （A） 创建切片表面和所有肾小球。粉红色 = 肾小球，蓝色 = 肾切片表面，绿色 = 血管（肾小球和一些大血管）的原始标签。比例尺 = 300 μm。 （B） 当选择切片表面（左）或肾小球（右）时（选定的对象将变为黄色），可以直接获得数据（虚线框突出显示数据的位置）。（C）可直接获得每个肾小球的数量、体积和总肾小球的体积以及切片的体积。（D） 可以进一步分析导出的数据，以便计算出肾小球的平均体积和肾小球与选定面积的体积比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：应用于 LSFM 扫描整个肾脏的 Surface 功能。 （A）创建整个肾脏和所有肾小球的表面。粉红色 = 肾小球，蓝色 = 整个肾脏的表面，绿色 = 血管（肾小球和一些大血管）的原始标签。比例尺 =1000 μm。 （B） 当选择肾脏表面（左）或肾小球（右）时（选定的对象会变黄），可以直接获得数据（虚线框突出显示数据的位置）。（C）可直接获得每个肾小球的数量、体积和肾小球的数量，以及肾脏的体积。（D） 可以进一步分析导出的数据，以便计算出肾小球的平均体积以及肾小球和整个肾脏的体积比。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：应用于所选肾条的 Surface 函数。 （A） 创建条带表面和所有肾小球。粉红色 = 肾小球，蓝色 = 肾条表面，绿色 = 血管（肾小球和一些大血管）的原始标签。比例尺 =150 μm。 （B） 当选择条带表面（左）或肾小球（右）时（选定的对象将变为黄色），可以直接获得数据（虚线框突出显示显示数据的位置）。（C）可直接获得每个肾小球的数量、体积和总肾小球的体积，以及条带的体积。（D） 可以进一步分析导出的数据，以便计算出肾小球的平均体积和肾小球与选定面积的体积比。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
组织清除技术可分为3组或4组29,30,31。有机溶剂型组织透明化（例如DISCO和PEGASOS）、水性组织透明化（例如CUBIC）和水凝胶包埋组织透明化（例如CLARITY）均已应用于肾脏透明化25,26,28,32。正如我们已经证明的那样，当肾小球（血管）用 FITC-葡聚糖标记时，CUBIC 效果最好。此外，CUBIC具有相对更方便的操作过程，并且不需要比普通显微镜27多，因为处理后的样品不需要浸泡在有机试剂33中。但是，不同的清关方法和容器标签方法各有优缺点;研究人员可能需要尝试不同的方法来满足他们的特定需求。
先前的研究发现，当肾脏中的血管被标记为13,25,26,28时，肾小球可以在清除的肾脏中被标记。对这种现象的彻底解释仍有待进一步研究，但可以推断出，一种良好的血管系统标记方法也可以有效地标记肾小球。根据实验结果，我们推荐血管内注射中等分子量（如150 kDa）的FITC-葡聚糖。然而，由于标记依赖于血液循环，当肾小球缺乏循环时，这种方法可能无法标记肾小球。
LSFM允许大规模组织观察，使其更适合全肾小球检测。然而，并非每个实验室都提供光片显微镜。因此，我们提供了一套使用普通共聚焦显微镜的替代方案。虽然肾脏需要切成多个部分，但获取整个肾脏中肾小球计数和体积等数据是可行的。此外，共聚焦显微镜提供的数据量更小，更有利于数据处理。
Imaris提供直接数据输出。但是，应注意将模拟信号与原始信号紧密匹配。此外，该软件可能需要很长时间来处理大文件，这可能会令人沮丧。只要肾小球可以清晰标记和可视化，数据分析的独特解决方案就不止一种。来自不同实验室的研究人员可以使用自己熟悉的软件和编程语言。
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Disclosures
所有作者均声明无利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（82204951）和四川省科学技术计划（2020JDRC0102）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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