Summary
Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.
Abstract
Os glomérulos são unidades fundamentais no rim; portanto, o estudo dos glomérulos é fundamental para a compreensão da função renal e da patologia. As imagens biológicas fornecem informações intuitivas; Assim, é de grande importância rotular e observar os glomérulos. No entanto, os métodos de observação de glomérulos atualmente em uso requerem operações complicadas, e os resultados podem perder detalhes do rótulo ou informações tridimensionais (3D). A tecnologia de limpeza de tecido de análise computacional (CUBIC) tem sido amplamente utilizada em pesquisas renais, permitindo uma detecção mais precisa e profundidade de detecção mais profunda. Descobrimos que os glomérulos de camundongos podem ser marcados rápida e efetivamente por injeção na veia caudal de FITC-Dextran de peso molecular médio seguida pelo método de limpeza cúbica. O rim de camundongo limpo poderia ser escaneado por um microscópio de folha de luz (ou um microscópio confocal quando fatiado) para obter pilhas de imagens tridimensionais de todos os glomérulos em todo o rim. Processados com software apropriado, os sinais dos glomérulos poderiam ser facilmente digitalizados e posteriormente analisados para medir o número, volume e frequência dos glomérulos.
Introduction
O número e o volume dos glomérulos são muito importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças renais1,2,3,4,5. O padrão-ouro da estimativa do número de glomérulos é a combinação dissector físico/fracionador. Entretanto, esse método requer reagentes e equipamentos especiais, tornando-o lento e dispendioso 6,7,8,9. A biópsia fornece uma riqueza de informações, mas obviamente esse método só é adequado para estimativas aproximadas10,11. Tecnologias de imagem médica, incluindo ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada (TC) e raios-X, também são amplamente utilizadas na detecção glomerular12,13,14,15, mas requerem instrumentos volumosos. Novos métodos, como o espectrômetro de massa de imagem por dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI)16 ou o método de cortes grossos e finos17, também têm sido usados na detecção glomerular, embora permaneçam tediosos e trabalhosos.
Com o auxílio das tecnologias de transparência, é possível observar profundidades mais profundas e obter informações mais ricas e completas de tecidos espessos ou mesmo de órgãos inteiros 18,19,20,21,22,23. Portanto, as tecnologias de transparência têm sido amplamente utilizadas na pesquisa renal24. A observação e detecção de glomérulos nos rins limpos também estão envolvidas. No entanto, esses artigos publicados ou se referiam apenas brevemente à detecção glomerular25 ou utilizavam métodos de marcação de difícil obtenção como animais transgênicos26, corantes autoproduzidos13 ou incubação de anticorpos em alta concentração27 para marcar os glomérulos. Além disso, apesar de estudos terem analisado glomérulos em rins liberados, as análises foram sempre limitadas13 ou baseadas em algoritmos de análise estabelecidos pelos próprios autores26.
Demonstramos anteriormente uma maneira mais conveniente de marcar os glomérulos em rins de camundongos28. Com o uso do Imaris, verificou-se que a contagem, a frequência e o volume dos glomérulos puderam ser obtidos rapidamente. Assim, apresentamos aqui um conjunto mais acessível, abrangente e simplificado de métodos para rotular e analisar os glomérulos de rins de camundongos.
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Protocol
Camundongos adultos C57BL/6 (6 semanas de idade, 25-30 g) foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas locais de bem-estar animal e ética experimental. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan.
1. Marcação de glomérulos e preparação de tecidos
- Rotulagem de glomérulos
- Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar a solução de sonda de trabalho.
NOTA: A solução de trabalho pode ser armazenada a 4 °C durante 1 mês. - Coloque o rato C57 num fixador da veia da cauda do rato. Molhe a gaze com água quente, envolva a gaze em torno da parte média da cauda do rato e aqueça a cauda por 1 min.
- Limpe a cauda do rato com etanol a 75% até que as veias da cauda esquerda e direita estejam visíveis.
- Retirar 100 μL da solução da sonda de trabalho com uma seringa de insulina de 1 ml e injetar lentamente a solução na veia da cauda do rato.
- Após a injeção, deixe a solução da sonda circular por 30 min. Permita que os ratos se movam livremente em suas gaiolas.
- Uma vez alcançada circulação suficiente, anestesiar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (1%, 60-80 μg/kg).
- Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar a solução de sonda de trabalho.
- Amostragem e fixação do rim
- Fixar os camundongos anestesiados na placa anatômica em decúbito dorsal. Segure as patas com fita adesiva.
- Após o preparo da pele, eutanasiar os camundongos com uma dose letal de pentobarbital sódico (1%, 10 mg/kg).
- Faça uma incisão abdominal mediana para expor a cavidade abdominal.
- Revele os rins e remova-os com bisturi e tesoura no exaustor. Retire o envelope renal suavemente.
- Recolher os rins e fixá-los em paraformaldeído (PFA) a 4 % a 4 °C durante a noite.
- Lavar as amostras com PBS três vezes 1 h cada com agitação à temperatura ambiente (TR).
- Prepare o rim para microscopia.
- Corte o rim para microscopia confocal: Corte o rim em cortes de 1 mm de espessura usando a matriz cerebral (aço de 1 mm, 40-75 g) para padronizar a espessura do corte. Transfira as fatias para PFA a 4% e continue a fixação a 4 °C durante a noite.
- Rim total para microscopia de folha óptica: Fixar os rins em PFA a 4% a 4 °C durante 48 horas.
2. Compensação
- Preparação de reagentes
- Preparar o reagente CUBIC-L misturando 10% (m/m) de N-butildietanolamina, 10% (m/m) Triton X-100 e 80% ddH2O.
- Preparar o reagente CUBIC-R misturando 45% (m/m) de antipirina, 30% (m/m) de nicotinamida, 0,5% (vol/vol) de N-butildietanolamina e 24,5% ddH2O. Certifique-se de que a solução tenha um pH de 9,6-9,8 e um índice de refração (IR) de 1,522.
NOTA: CUBIC-L é usado para deslipidação, e CUBIC-R é usado para correspondência de índice de refração.
- Procedimento de compensação
- Recolher as amostras de rim num tubo de centrífuga de 50 ml e, em seguida, limpá-las em CUBIC-L com agitação a 60 rpm a 37 °C. Substitua o CUBIC-L a cada 4 h (para fatias de rim) ou a cada 24 h (para um rim inteiro) até obter transparência óptica satisfatória.
NOTA: Este processo leva 1 dia para fatias de rim e 5 dias para um rim inteiro. - Lavar as amostras três vezes em PBS com agitação suave em RT por 1 h cada.
- Aplicar CUBIC-R às amostras, agitando as amostras a 37 °C, 60 rpm durante 6 h.
- Observe diretamente as amostras liberadas ou armazene-as em tubos pretos preenchidos com CUBIC-R no TR por 1 semana.
- Recolher as amostras de rim num tubo de centrífuga de 50 ml e, em seguida, limpá-las em CUBIC-L com agitação a 60 rpm a 37 °C. Substitua o CUBIC-L a cada 4 h (para fatias de rim) ou a cada 24 h (para um rim inteiro) até obter transparência óptica satisfatória.
3. Aquisição de imagens
- Imagem confocal
NOTA: Imagem das amostras de rim fatiadas com microscopia confocal (Lentes: Uma objetiva Plan Apo λ 4×/0.2 N1 ou uma objetiva Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). Capture imagens grandes (por exemplo, 6052 μm x 6052 μm para a fatia de rim) com z-stacks.- Ligue o microscópio confocal na seguinte sequência: potência do laser, interruptor de controle confocal, computador, microscópio e hardware confocal. Depois de executar o autoteste, ligue o software confocal.
- Selecione a lente apropriada. Retire a amostra do reagente CUBIC-R, coloque-a na placa confocal e cubra-a para evitar que o reagente CUBIC-R seque.
- Mova a amostra para o meio do campo de visão e ajuste o plano focal até que esteja em foco.
- Aplicar reconstrução 3D (passo 3.1.4.1) e reconstrução de imagem grande (passos 3.1.4.2-3.1.4.3).
- Reconstrução 3D (confocal): Alterne o plano de zoom em uma direção até que nenhuma fluorescência seja visível; Esta posição é definida como a parte superior. Em seguida, alterne o plano de zoom na direção oposta até que nenhuma fluorescência seja visível; Esta posição é definida como a parte inferior. Clique no botão Executar no canto inferior direito da caixa de diálogo para iniciar a verificação.
- Reconstrução de imagem grande (confocal): mova o campo de visão para o meio da amostra e defina a posição atual como centro. Selecione um campo de visão 2 x 2.
- Na interface multifuncional ND, selecione a pilha Z para reconstruir imagens grandes e definir diferentes opções no painel. Em seguida, pressione o botão Executar para n para iniciar a varredura.
- Imagem por microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM)
OBS: Imagem de todos os rins com microscópio de fluorescência de folha de luz (Lente: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Médio n = 1,529) objetiva).- Fixação de amostra (LSFM):
- Cole o rim transparente ao adaptador de fixação da amostra e aguarde até que o rim esteja firmemente fixado.
- Mergulhe o rim no compartimento de amostra e empurre o compartimento de amostra para o sistema de microscópio. Feche a escotilha.
- Observar e digitalizar (LSFM):
- Na interface Localizar , mova a amostra para uma posição de observação adequada. Alterne para a interface de aquisição , defina o caminho óptico, selecione laser de 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloco de filtro de divisão óptica SBS LP 490, selecione Câmera 2 e altere a pseudocor para verde.
- Preencha o valor de Deslocamento Z Esquerdo/Direito, registrado anteriormente no submenu Canal . Selecione o menor zoom (0,36) e ajuste-o para máxima clareza.
- Encontre o limite X\Y e o intervalo Z de todo o órgão. Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição (de preferência inferior a 10 ms) e clique em Executar para iniciar.
- Se o tecido for muito grande, mescle duas ou mais imagens com costura de imagem. Abra o arquivo capturado usando o software de microscopia (aqui, ZEISS ZEN 3.7). Selecione Processando > Método > Costurando > Parâmetro de Método > Aplicar à costura de imagem completa.
- Fixação de amostra (LSFM):
4. Processamento e quantificação de dados
NOTA: Processe as pilhas de imagens com o software Imaris (análise de imagem), usando a função Surface para rotular os glomérulos e realizar a análise.
- Conde de glomérulos
- Importe imagens grandes (microscopia confocal) ou imagens costuradas (microscopia de folha) para o software de análise de imagens.
- Abra os arquivos no software de análise de imagem. Clique no botão Surface para criar um novo Surface. Siga o guia na parte inferior esquerda da tela.
- Clique no botão Avançar (botão de seta para a direita) sem marcar nada.
- Marque a caixa antes da opção Liso e insira um número adequado (por exemplo, 14.5) para controlar os detalhes do Surface. Selecione Subtração em segundo plano em Limiar e preencha a caixa com o diâmetro médio aproximado dos glomérulos. Clique no botão Avançar .
- Ajuste se necessário e clique no botão Avançar . Selecione o intervalo adequado e clique no botão Seguinte para criar um Surface.
- Clique em Filtrar e, em seguida, no botão Adicionar para adicionar Esfericidade para filtrar objetos não esféricos. Clique no botão Duplicar para copiar esta nova superfície.
- Clique no botão Estatísticas e, em seguida, clique no botão Geral ; o software apresentará o número de glomérulos como o Número Total de Superfície.
- Volume de glomérulos
- Crie uma superfície dos glomérulos como acima.
- Quando o Surface estiver concluído, clique no botão Seleção para selecionar os objetos de destino e apresentar o volume de cada objeto. Clique no botão Salvar e exporte estatísticas para uma planilha para análise adicional.
- Volume da fatia ou rim inteiro
- Importe imagens grandes (microscopia confocal) ou imagens costuradas (microscopia de folha) para o software de análise de imagens.
- Abra arquivos no software de análise de imagens. Clique no botão Surface para criar um novo Surface. Siga o guia na parte inferior esquerda da tela.
- Clique no botão Avançar (botão de seta para a direita) sem marcar.
- Marque a caixa antes da opção Liso e insira um número adequado (por exemplo, 50) para controlar os detalhes do Surface. Selecione Intensidade absoluta em Limite. Clique no botão Avançar .
- Ajuste o Surface até cobrir todo o tecido e clique no botão Seguinte . Clique no botão Seguinte para criar o Surface.
- Clique no botão Seleção para selecionar a Superfície de todo o tecido e apresentar o volume do tecido. Clique no botão Salvar para exportar estatísticas para uma planilha.
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Representative Results
Este estudo fornece um método simples e eficiente para marcar e analisar os glomérulos em rins de camundongos.
Os glomérulos (vasos sanguíneos) podem ser bem marcados por FITC-Dextran injetado intravascularmente. Após o clareamento, o rim tornou-se transparente (Figura 1A), e os glomérulos puderam ser claramente observados por meio de microscopia óptica (Figura 1B) ou microscopia confocal (Figura 1C). A microscopia confocal tem uma profundidade de varredura limitada, de modo que os rins devem ser cortados em cortes de aproximadamente 1 mm de espessura. Se um microscópio de folha de luz for usado, todo o rim pode ser escaneado diretamente.
Com os sinais claros, era fácil contar o número de glomérulos. Na verdade, a rotulagem era tão eficaz que os glomérulos podiam ser contados a olho nu. O volume dos glomérulos também pôde ser medido diretamente. É claro que softwares como o Imaris aceleraram muito esse processo. Utilizando a função Surface, todos os glomérulos em um corte renal (Figura 2), em um rim inteiro (Figura 3) ou em uma tira (Figura 4) puderam ser selecionados, e o número e o volume dos glomérulos puderam ser obtidos diretamente (Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C). O volume da região selecionada também pôde ser medido (Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B), para que se pudesse calcular a razão de volume e frequência dos glomérulos em uma determinada região ou em todo o rim (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). Uma área do rim poderia ser selecionada para realizar cálculos em regiões específicas. Apresentamos uma tira semelhante a uma biópsia. O número, o volume e a frequência dos glomérulos na tira também puderam ser facilmente obtidos (Figura 4).
Como mostrado nas figuras, os resultados apresentados neste estudo são (N = número, F = frequência, V = volume, V(a) = volume médio, V(t) = volume total):
Nglomérulos em corte = 1128, Nglomérulos em rim inteiro = 14006, Fglomerular em corte = 65 por mm3, Fglomerular em rim inteiro = 105 por mm3, Vglomérulos totais em fatia/Vcorte = 2,24%, Vglomérulos totais em rim inteiro/Vrim = 5,54%, V(a)glomérulos em corte = 373654 μm3, V(a)glomérulos em rim inteiro = 521627 μm3, V(t)glomérulos em corte = 421481724 μm3, V(t)glomérulos em rim total = 7305386256 μm3 (Figura 2D, Figura 3D).
Nglomérulos em tira = 63, Fglomérulos em tira = 72 por mm3, Vglomérulos totais em tira/V emtira = 2,23%, V(a)glomérulos em tira = 307698 μm3, V(t)glomérulos em tira = 19384977 μm3 (Figura 4D).
Figura 1: Transparência do tecido renal e glomérulos marcados com FITC-dextrano. (A) Rim antes e após o tratamento de transparência. (B) A imagem de um rim inteiro escaneado com LSFM. (C) Imagem de um corte de rim escaneado com microscópio confocal (esquerda: 4x, direita: 10x). barra de escala = 300 μm (4x, confocal); barra de escala = 100 μm (10x, confocal).; barra de escala = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Os glomérulos foram marcados com FITC-Dextran. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A função Surface aplicada ao corte de rim escaneado confocal. (A) Superfície da fatia e todos os glomérulos são criados. Rosa = glomérulos, azul = superfície externa do corte renal, verde = rótulo original dos vasos (glomérulos e alguns grandes vasos). Barra de escala = 300 μm. (B) Quando a Superfície da fatia (esquerda) ou os glomérulos (direita) são selecionados (objetos selecionados ficariam amarelos), os dados poderiam ser obtidos diretamente (destaques de caixa pontilhada onde mostra os dados). (C) O número, o volume de cada glomérulo e o volume total de glomérulos podem ser obtidos diretamente, bem como o volume do corte. (D) Os dados exportados poderiam ser analisados mais detalhadamente para que o cálculo, como o volume médio dos glomérulos e a relação de volume dos glomérulos e da área selecionada, pudesse ser elaborado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A função Surface aplicada ao LSFM escaneou todo o rim. (A) Superfície de todo o rim e todos os glomérulos são criados. Rosa = glomérulos, azul = superfície de todo o rim, verde = rótulo original dos vasos (glomérulos e alguns grandes vasos). Barra de escala =1000 μm. (B) Quando a superfície do rim (esquerda) ou os glomérulos (direita) são selecionados (objetos selecionados ficariam amarelos), os dados poderiam ser obtidos diretamente (realce da caixa pontilhada onde mostra os dados). (C) O número, o volume de cada glomérulo e o número dos glomérulos poderiam ser obtidos diretamente, assim como o volume do rim. (D) Os dados exportados poderiam ser analisados mais detalhadamente para que o cálculo, como o volume médio dos glomérulos e a relação de volume dos glomérulos e do rim inteiro, pudesse ser elaborado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A função Surface aplicada à tira renal selecionada. (A) Superfície da tira e todos os glomérulos são criados. Rosa = glomérulos, azul = superfície externa da tira renal, verde = rótulo original dos vasos (glomérulos e alguns vasos grandes). Barra de escala =150 μm. (B) Quando a Superfície da tira (esquerda) ou os glomérulos (direita) são selecionados (objetos selecionados ficariam amarelos), os dados podem ser obtidos diretamente (destaques de caixa pontilhada onde exibe os dados). (C) O número, o volume de cada glomérulo e o volume total de glomérulos poderiam ser obtidos diretamente, assim como o volume da tira. (D) Os dados exportados poderiam ser analisados mais detalhadamente para que o cálculo, como o volume médio dos glomérulos e a relação de volume dos glomérulos e da área selecionada, pudesse ser elaborado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As tecnologias de desobstrução tecidual podem ser classificadas em 3 ou 4 grupos 29,30,31. A limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos (por exemplo, DISCO e PEGASOS), a limpeza de tecidos à base de água (por exemplo, CUBIC) e a limpeza de tecidos incorporados a hidrogel (por exemplo, CLARITY) foram aplicadas na limpeza renal 25,26,28,32. O CUBIC, como demonstramos, funciona melhor quando os glomérulos (vasos) são rotulados com FITC-Dextran. Além disso, o CUBIC tem um processo de operação relativamente mais conveniente e requer apenas lentes microscópicas comuns27, pois as amostras processadas não precisam ser embebidas em reagentes orgânicos33. No entanto, os diferentes métodos de compensação e os métodos de rotulagem dos recipientes têm as suas próprias vantagens e desvantagens; Os pesquisadores podem precisar experimentar diferentes abordagens para atender às suas necessidades específicas.
Estudos prévios observaram que os glomérulos podiam ser marcados em rins limpos quando os vasos sanguíneos nos rins eram marcados 13,25,26,28. Uma explicação completa para esse fenômeno ainda precisa ser mais bem investigada, mas pode-se deduzir que um bom método de marcação para o sistema vascular também rotula efetivamente os glomérulos. Com base nos resultados experimentais, recomendar-se-ia a injeção intravascular de FITC-Dextran com peso molecular médio (como 150 kDa). No entanto, como a marcação depende da circulação sanguínea, esse método pode falhar em rotular os glomérulos quando eles não têm circulação.
O LSFM permite a observação tecidual em larga escala, tornando-o mais adequado para a detecção de glomérulos renais inteiros. No entanto, microscópios de folha de luz podem não estar disponíveis em todos os laboratórios. Assim, estamos fornecendo um conjunto alternativo de protocolos usando microscópios confocais comuns. Embora o rim precise ser fatiado em várias seções, a obtenção de dados como a contagem e o volume de glomérulos em todo o rim é viável. Além disso, a microscopia confocal fornece um volume menor de dados, o que é mais amigável ao processamento de dados.
O Imaris fornece saída direta de dados. No entanto, deve-se tomar cuidado para combinar o sinal analógico com o original de perto. Além disso, o software pode levar muito tempo para processar arquivos grandes, o que pode ser frustrante. Desde que os glomérulos possam ser claramente rotulados e visualizados, há mais de uma solução única para análise de dados. Pesquisadores de diferentes laboratórios poderiam trabalhar com seus próprios softwares e linguagens de programação familiares.
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Disclosures
Todos os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82204951) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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