Summary
Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.
Abstract
Die Glomeruli sind grundlegende Einheiten in der Niere; Daher ist die Untersuchung der Glomeruli von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Nierenfunktion und -pathologie. Die biologische Bildgebung liefert intuitive Informationen; Daher ist es von großer Bedeutung, die Glomeruli zu beschriften und zu beobachten. Die derzeit verwendeten Glomeruli-Beobachtungsmethoden erfordern jedoch komplizierte Operationen, und die Ergebnisse können Markierungsdetails oder dreidimensionale (3D) Informationen verlieren. Die klare, ungehinderte Brain-Imaging-Cocktails und die Computational Analysis (CUBIC)-Gewebereinigungstechnologie sind in der Nierenforschung weit verbreitet und ermöglichen eine genauere Detektion und eine tiefere Detektionstiefe. Wir fanden heraus, dass Maus-Glomeruli schnell und effektiv durch Schwanzveneninjektion von mittelmolekularem FITC-Dextran gefolgt von der CUBIC-Clearing-Methode markiert werden können. Die gereinigte Mausniere konnte mit einem Lichtblattmikroskop (oder einem konfokalen Mikroskop, wenn sie geschnitten wurde) gescannt werden, um dreidimensionale Bildstapel aller Glomeruli in der gesamten Niere zu erhalten. Mit entsprechender Software verarbeitet, konnten die Glomeruli-Signale leicht digitalisiert und weiter analysiert werden, um die Anzahl, das Volumen und die Frequenz der Glomeruli zu messen.
Introduction
Die Anzahl und das Volumen der Glomeruli sind sehr wichtig für die Diagnose und Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen 1,2,3,4,5. Der goldene Standard der Glomeruli-Zahlschätzung ist die Kombination aus physikalischem Dissektor und Fraktionierer. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Reagenzien und Geräte, was sie langsam und teuer macht 6,7,8,9. Die Biopsie liefert eine Fülle von Informationen, aber offensichtlich ist diese Methode nur für grobe Schätzungen geeignet10,11. Medizinische Bildgebungstechnologien, einschließlich Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Röntgen, sind ebenfalls bei der glomerulären Detektion weit verbreitet 12,13,14,15, aber solche Technologien erfordern sperrige Instrumente. Neue Methoden, wie z. B. das matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometer16 oder das Dick- und Dünnschliffverfahren17, wurden ebenfalls in der glomerulären Detektion eingesetzt, obwohl sie nach wie vor mühsam und mühsam sind.
Mit Hilfe von Transparenztechnologien ist es möglich, tiefere Tiefen zu beobachten und reichhaltigere und vollständigere Informationen aus dickem Gewebe oder sogar ganzen Organen zu erhalten 18,19,20,21,22,23. Daher sind Transparenztechnologien in der Nierenforschung weit verbreitet24. Auch die Beobachtung und der Nachweis von Glomeruli in den gereinigten Nieren gehören dazu. Diese veröffentlichten Artikel bezogen sich jedoch entweder nur kurz auf den glomerulären Nachweis25 oder verwendeten schwierig zu erreichende Markierungsmethoden wie transgene Tiere26, selbst hergestellte Farbstoffe13 oder hochkonzentrierte Antikörperinkubation27 zur Markierung der Glomeruli. Obwohl Studien Glomeruli in gereinigten Nieren analysiert hatten, waren die Analysen immer begrenzt13 oder stützten sich auf Analysealgorithmen, die von den Autoren selbst entwickelt wurden26.
Wir haben bereits einen bequemeren Weg zur Markierung der Glomeruli in den Nieren von Mäusen gezeigt28. Durch die Verwendung von Imaris stellten wir fest, dass die Anzahl, Häufigkeit und das Volumen der Glomeruli schnell ermittelt werden konnten. Daher stellen wir hier einen zugänglicheren, umfassenderen und vereinfachten Satz von Methoden zur Markierung und Analyse der Glomeruli von Mäusenieren vor.
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Protocol
In dieser Studie wurden adulte C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alt, 25-30 g) verwendet. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften des Tierschutzes und der experimentellen Ethik durchgeführt. Die Studie wurde von der Ethikkommission für biomedizinische Forschung des Westchinesischen Krankenhauses der Universität Sichuan genehmigt.
1. Glomeruli-Markierung und Gewebevorbereitung
- Glomeruli-Etikettierung
- FITC-Dextran (10 mg) wird in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 (1 mg: 1 ml) gelöst, um die Arbeitssondenlösung herzustellen.
HINWEIS: Die Arbeitslösung kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden. - Legen Sie die C57-Maus in einen Mausschwanzvenen-Fixateur. Befeuchten Sie die Gaze mit heißem Wasser, wickeln Sie die Gaze um den mittleren Teil des Mäuseschwanzes und erwärmen Sie den Schwanz 1 Minute lang.
- Wischen Sie den Mäuseschwanz mit 75%igem Ethanol ab, bis die linke und rechte Schwanzvene sichtbar sind.
- Ziehen Sie 100 μl der Arbeitssondenlösung mit einer 1-ml-Insulinspritze und injizieren Sie die Lösung langsam in die Schwanzvene der Maus.
- Nach der Injektion die Sondenlösung 30 Minuten lang zirkulieren lassen. Lassen Sie die Mäuse sich in ihren Käfigen frei bewegen.
- Sobald eine ausreichende Durchblutung erreicht ist, werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (1%, 60-80 μg/kg) tief betäubt.
- FITC-Dextran (10 mg) wird in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 (1 mg: 1 ml) gelöst, um die Arbeitssondenlösung herzustellen.
- Nierenentnahme und -fixierung
- Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse in Rückenlage an der anatomischen Platte. Befestigen Sie ihre Pfoten mit medizinischem Klebeband.
- Nach der Hautvorbereitung werden die Mäuse mit einer tödlichen Dosis Natrium-Pentobarbital (1%, 10 mg/kg) eingeschläfert.
- Machen Sie einen Bauchschnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.
- Legen Sie die Nieren frei und entfernen Sie sie mit einem Skalpell und einer Schere aus dem Abzug. Entfernen Sie die Nierenhülle vorsichtig.
- Sammeln Sie die Nieren und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.
- Waschen Sie die Proben mit PBS dreimal jeweils 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur (RT).
- Bereiten Sie die Niere für die Mikroskopie vor.
- Schneiden Sie die Niere für die konfokale Mikroskopie: Schneiden Sie die Niere mit Hilfe der Gehirnmatrix (1 mm Stahl, 40-75 g) in 1 mm dicke Scheiben, um die Schichtdicke zu standardisieren. Die Scheiben in 4% PFA überführen und die Fixierung bei 4 °C über Nacht fortsetzen.
- Ganze Niere für die Lichtblattmikroskopie: Fixieren Sie die Nieren in 4% PFA bei 4 °C für 48 Stunden.
2. Verrechnung
- Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie das CUBIC-L-Reagenz vor, indem Sie 10 % (Gew./Gew.) N-Butyldiethanolamin, 10 Gew.-% (Gew./Gew.) Triton X-100 und 80 %ddH2O mischen.
- Bereiten Sie das CUBIC-R-Reagenz vor, indem Sie 45 % (wt/wt) Antipyrin, 30 % (wt/wt) Nicotinamid, 0,5 % (vol/vol) N-Butyldiethanolamin und 24,5 %ddH2Omischen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen pH-Wert von 9,6-9,8 und einen Brechungsindex (RI) von 1,522 hat.
HINWEIS: CUBIC-L wird für die Delipidierung und CUBIC-R für die Anpassung des Brechungsindex verwendet.
- Clearing-Verfahren
- Die Nierenproben werden in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und dann in CUBIC-L unter Schütteln bei 60 U/min bei 37 °C gereinigt. Tauschen Sie CUBIC-L alle 4 Stunden (für Nierenscheiben) oder alle 24 Stunden (für eine ganze Niere) aus, bis eine zufriedenstellende optische Transparenz erreicht ist.
HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 1 Tag für Nierenscheiben und 5 Tage für eine ganze Niere. - Waschen Sie die Proben dreimal in PBS mit leichtem Schütteln bei RT für jeweils 1 Stunde.
- CUBIC-R auf die Proben auftragen und die Proben 6 h lang bei 37 °C und 60 U/min schütteln.
- Beobachten Sie die geklärten Proben direkt oder lagern Sie sie 1 Woche lang in schwarzen Röhrchen, die mit CUBIC-R bei RT gefüllt sind.
- Die Nierenproben werden in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und dann in CUBIC-L unter Schütteln bei 60 U/min bei 37 °C gereinigt. Tauschen Sie CUBIC-L alle 4 Stunden (für Nierenscheiben) oder alle 24 Stunden (für eine ganze Niere) aus, bis eine zufriedenstellende optische Transparenz erreicht ist.
3. Bildaufnahme
- Konfokale Bildgebung
HINWEIS: Fotografieren Sie die geschnittenen Nierenproben mit konfokaler Mikroskopie (Objektive: Ein Plan Apo λ 4×/0.2 N1 Objektiv oder ein Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 Objektiv). Erfassen Sie große Bilder (z. B. 6052 μm x 6052 μm für die Nierenschicht) mit Z-Stapeln.- Schalten Sie das konfokale Mikroskop in der folgenden Reihenfolge ein: Laserleistung, konfokaler Steuerschalter, Computer, Mikroskop und konfokale Hardware. Schalten Sie nach dem Ausführen des Selbsttests die konfokale Software ein.
- Wählen Sie das entsprechende Objektiv aus. Nehmen Sie die Probe aus dem CUBIC-R-Reagenz, legen Sie sie in die konfokale Schale und decken Sie sie ab, um ein Austrocknen des CUBIC-R-Reagenzes zu verhindern.
- Verschieben Sie die Probe in die Mitte des Sichtfelds und passen Sie die Fokusebene an, bis sie scharf ist.
- Wenden Sie die 3D-Rekonstruktion (Schritt 3.1.4.1) und die Rekonstruktion großer Bilder (Schritte 3.1.4.2-3.1.4.3) an.
- 3D-Rekonstruktion (konfokal): Schalten Sie die Zoomebene in eine Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist; Diese Position wird als Spitze definiert. Schalten Sie dann die Zoomebene in die entgegengesetzte Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist. Diese Position wird als Boden definiert. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen in der unteren rechten Ecke des Dialogfelds, um den Scanvorgang zu starten.
- Große Bildrekonstruktion (konfokal): Verschieben Sie das Sichtfeld in die Mitte der Probe und legen Sie die aktuelle Position als Mittelpunkt fest. Wählen Sie ein 2 x 2-Sichtfeld aus.
- Wählen Sie in der ND-Multifunktionsschnittstelle den Z-Stapel aus, um große Bilder zu rekonstruieren, und legen Sie verschiedene Optionen im Bedienfeld fest. Drücken Sie dann die Taste Ausführen , aber, um den Scanvorgang zu starten.
- Bildgebung der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM)
HINWEIS: Fotografieren Sie die gesamten Nieren mit einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (Objektiv: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Medium n = 1,529) Objektiv).- Probenanbringung (LSFM):
- Kleben Sie die durchsichtige Niere auf den Adapter zur Probenfixierung und warten Sie, bis die Niere fest befestigt ist.
- Weichen Sie die Niere in den Probenbehälter ein und schieben Sie den Probenbehälter in das Mikroskopsystem. Schließen Sie die Luke.
- Beobachten und scannen (LSFM):
- Verschieben Sie die Probe in der Lokalisierungsschnittstelle an eine geeignete Beobachtungsposition. Wechseln Sie zur Erfassungsschnittstelle , stellen Sie den optischen Pfad ein, wählen Sie 488-nm-Laser, LBF 405/488/561/640, optischen Splitting-Filterblock SBS LP 490, wählen Sie Kamera 2 und ändern Sie die Pseudofarbe in Grün.
- Geben Sie den Wert für den Z-Versatz links/rechts ein, der zuvor im Untermenü Kanal aufgezeichnet wurde. Wählen Sie den kleinsten Zoom (0,36) und passen Sie ihn für maximale Klarheit an.
- Finde die X\Y-Grenze und den Z-Bereich des gesamten Organs. Stellen Sie die Laserintensität und die Belichtungszeit ein (vorzugsweise weniger als 10 ms) und klicken Sie auf Ausführen , um zu starten.
- Wenn das Gewebe zu groß ist, fügen Sie zwei oder mehr Bilder mit Bildzusammenfügen zusammen. Öffnen Sie die aufgenommene Datei mit der Mikroskopie-Software (hier ZEISS ZEN 3.7). Wählen Sie Verarbeitung > Methode > Stitching > Methodenparameter > Auf vollständiges Bild-Stitching anwenden.
- Probenanbringung (LSFM):
4. Datenverarbeitung und Quantifizierung
HINWEIS: Verarbeiten Sie die Bildstapel mit der Software Imaris (Bildanalyse), indem Sie die Funktion Oberfläche verwenden, um die Glomeruli zu beschriften und eine Analyse durchzuführen.
- Graf der Glomeruli
- Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.
- Öffnen Sie die Dateien in der Bildanalysesoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Pfeil nach rechts), ohne etwas anzukreuzen.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glätten und geben Sie eine geeignete Zahl ein (z. B. 14,5), um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Hintergrundsubtraktion in Schwellenwert und füllen Sie das Feld mit dem ungefähren durchschnittlichen Durchmesser der Glomeruli. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .
- Passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Wählen Sie den richtigen Bereich aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um eine Oberfläche zu erstellen.
- Klicken Sie auf "Filter" und dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen ", um "Sphärizität " hinzuzufügen und nicht-sphärische Objekte herauszufiltern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Duplizieren , um diese neue Oberfläche zu kopieren.
- Klicken Sie auf die Taste "Statistik" und dann auf die Schaltfläche "Gesamt ". Die Software zeigt die Anzahl der Glomeruli als Gesamtanzahl der Oberfläche an.
- Volumen der Glomeruli
- Erstelle eine Oberfläche der Glomeruli wie oben.
- Wenn die Oberfläche fertig ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Zielobjekte auszuwählen und das Volumen jedes Objekts darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und exportieren Sie die Statistiken zur weiteren Analyse in eine Tabelle.
- Volumen der Scheibe oder der ganzen Niere
- Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.
- Öffnen Sie Dateien in der Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Schaltfläche mit dem Pfeil nach rechts), ohne ein Häkchen zu setzen.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glatt und geben Sie eine geeignete Zahl (z. B. 50) ein, um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Absolute Intensität unter Schwellenwert aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .
- Passen Sie die Oberfläche an, bis sie das gesamte Gewebe bedeckt, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die Oberfläche zu erstellen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Oberfläche des gesamten Gewebes auszuwählen und das Volumen des Gewebes darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um Statistiken in eine Tabelle zu exportieren.
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Representative Results
Diese Studie bietet eine einfache und effiziente Methode zur Markierung und Analyse der Glomeruli in Mäusenieren.
Glomeruli (Blutgefäße) können durch intravaskulär injiziertes FITC-Dextran gut markiert werden. Nach dem Reinigungsprozess wurde die Niere durchsichtig (Abbildung 1A), und die Glomeruli konnten mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie (Abbildung 1B) oder der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 1C) deutlich beobachtet werden. Die konfokale Mikroskopie hat eine begrenzte Scantiefe, daher sollten Nieren in etwa 1 mm dicke Scheiben geschnitten werden. Wenn ein Lichtblattmikroskop verwendet wird, kann die gesamte Niere direkt gescannt werden.
Mit den eindeutigen Signalen war es ein Leichtes, die Anzahl der Glomeruli zu zählen. Tatsächlich war die Markierung so effektiv, dass die Glomeruli mit bloßem Auge gezählt werden konnten. Auch das Volumen der Glomeruli konnte direkt gemessen werden. Natürlich hat Software wie Imaris diesen Prozess stark beschleunigt. Mit der Oberflächenfunktion konnten alle Glomeruli in einer Nierenscheibe (Abbildung 2), in einer ganzen Niere (Abbildung 3) oder in einem Streifen (Abbildung 4) ausgewählt und die Anzahl und das Volumen der Glomeruli direkt ermittelt werden (Abbildung 2C, Abbildung 3C, Abbildung 4C). Es konnte auch das Volumen der ausgewählten Region gemessen werden (Abbildung 2B, Abbildung 3B, Abbildung 4B), so dass das Volumenverhältnis und die Häufigkeit der Glomeruli in einer bestimmten Region oder in der gesamten Niere berechnet werden konnten (Abbildung 2D, Abbildung 3D, Abbildung 4D). Ein Bereich der Niere könnte ausgewählt werden, um Berechnungen in bestimmten Regionen durchzuführen. Wir präsentierten einen Streifen, der einer Biopsie ähnelte. Die Anzahl, das Volumen und die Häufigkeit der Glomeruli im Streifen konnten ebenfalls leicht ermittelt werden (Abbildung 4).
Wie aus den Abbildungen hervorgeht, sind die in dieser Studie vorgestellten Ergebnisse (N = Anzahl, F = Frequenz, V = Volumen, V(a) = durchschnittliches Volumen, V(t) = Gesamtvolumen):
NGlomeruli in der Scheibe = 1128, NGlomeruli in der ganzen Niere = 14006, Fglomerulär in der Scheibe = 65 pro mm3, Fglomerulär in der ganzen Niere = 105 pro mm3, VGesamtglomeruli in der Scheibe/V-Scheibe = 2,24 %, VGesamtglomeruli in der ganzen Niere/V-Niere = 5,54 %, V(a)Glomeruli in der Scheibe = 373654 μm3, V(a)Glomeruli in der ganzen Niere = 521627 μm3, V(t)glomeruli in der Scheibe = 421481724 μm3, V(t)glomeruli in der ganzen Niere = 7305386256 μm3 (Abbildung 2D, Abbildung 3D).
NGlomeruli im Streifen = 63, FGlomeruli im Streifen = 72 pro mm3, VGesamtglomeruli im Streifen/V-Streifen = 2,23 %, V(a)Glomeruli im Streifen = 307698 μm3, V(t)Glomeruli im Streifen = 19384977 μm3 (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Transparenz des Nierengewebes und FITC-Dextran-markierte Glomeruli. (A) Niere vor und nach der Transparenzbehandlung. (B) Das Bild einer ganzen Niere, die mit LSFM gescannt wurde. (C) Das Bild eines Nierenschnitts, der mit dem konfokalen Mikroskop gescannt wurde (links: 4x, rechts: 10x). Maßstabsbalken = 300 μm (4x, konfokal); Maßstabsbalken = 100 μm (10x, konfokal).; Maßstabsleiste = 700 μm (5x, Zoom 0,36, LSFM). Die Glomeruli wurden mit FITC-Dextran markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Funktion Oberfläche, die auf die konfokale gescannte Nierenschicht angewendet wird. (A) Oberfläche der Schicht und alle Glomeruli werden erstellt. Rosa = Glomeruli, blau = außen Oberfläche der Nierenscheibe, grün = Originaletikett der Gefäße (Glomeruli und einige große Gefäße). Maßstabsbalken = 300 μm. (B) Wenn die Oberfläche der Scheibe (links) oder die Glomeruli (rechts) ausgewählt sind (ausgewählte Objekte werden gelb), können die Daten direkt abgerufen werden (gepunktetes Kästchen hebt hervor, wo es die Daten anzeigt). (C) Die Anzahl, das Volumen jedes einzelnen Glomerulus und das Volumen der gesamten Glomeruli konnten direkt ermittelt werden, ebenso wie das Volumen der Scheibe. (D) Exportierte Daten könnten weiter analysiert werden, so dass die Berechnung, wie z. B. das durchschnittliche Volumen der Glomeruli und das Volumenverhältnis der Glomeruli und der ausgewählten Fläche, ausgearbeitet werden könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Funktion Oberfläche, die auf die gescannte LSFM-Niere angewendet wird. (A) Oberfläche der gesamten Niere und alle Glomeruli werden erstellt. Rosa = Glomeruli, blau = außen Oberfläche der gesamten Niere, grün = Originaletikett der Gefäße (Glomeruli und einige große Gefäße). Maßstabsbalken = 1000 μm. (B) Wenn die Oberfläche der Niere (links) oder die Glomeruli (rechts) ausgewählt werden (ausgewählte Objekte würden gelb werden), können Daten direkt erhalten werden (gepunktetes Kästchen hebt hervor, wo es die Daten anzeigt). (C) Die Anzahl, das Volumen jedes einzelnen Glomerulus und die Anzahl der Glomeruli konnten direkt ermittelt werden, ebenso wie das Volumen der Niere. (D) Exportierte Daten könnten weiter analysiert werden, so dass die Berechnung, wie z. B. das durchschnittliche Volumen der Glomeruli und das Volumenverhältnis der Glomeruli und der gesamten Niere, ausgearbeitet werden könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Funktion Oberfläche, die auf den ausgewählten Nierenstreifen angewendet wird. (A) Oberfläche des Streifens und alle Glomeruli werden erstellt. Rosa = Glomeruli, blau = außen Oberfläche des Nierenstreifens, grün = Originaletikett der Gefäße (Glomeruli und einige große Gefäße). Maßstabsbalken = 150 μm. (B) Wenn die Oberfläche des Streifens (links) oder die Glomeruli (rechts) ausgewählt sind (ausgewählte Objekte werden gelb), können die Daten direkt abgerufen werden (gepunktetes Kästchen hebt hervor, wo die Daten angezeigt werden). (C) Die Anzahl, das Volumen jedes einzelnen Glomerulus und das Volumen der gesamten Glomeruli konnten direkt ermittelt werden, ebenso wie das Volumen des Streifens. (D) Exportierte Daten könnten weiter analysiert werden, so dass die Berechnung, wie z. B. das durchschnittliche Volumen der Glomeruli und das Volumenverhältnis der Glomeruli und der ausgewählten Fläche, ausgearbeitet werden könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Tissue-Clearing-Technologien können in 3 oder 4 Gruppen eingeteiltwerden 29,30,31. Organisches Gewebe-Clearing auf Lösungsmittelbasis (z. B. DISCO und PEGASOS), Gewebe-Clearing auf wässriger Basis (z. B. CUBIC) und Hydrogel-einbettendes Gewebe-Clearing (z. B. CLARITY) wurden alle bei der Nierenreinigung angewendet 25,26,28,32. CUBIC funktioniert, wie wir gezeigt haben, am besten, wenn die Glomeruli (Gefäße) mit FITC-Dextran markiert sind. Darüber hinaus hat CUBIC ein relativ bequemeres Bedienungsverfahren und erfordert nicht mehr als gewöhnliche mikroskopische Linsen27, da die verarbeiteten Proben nicht in organischen Reagenzien33 getränkt werden müssen. Unterschiedliche Clearing-Methoden und Vessel-Label-Methoden haben jedoch ihre eigenen Vor- und Nachteile. Forscher müssen möglicherweise mit verschiedenen Ansätzen experimentieren, um ihren spezifischen Bedürfnissen gerecht zu werden.
Frühere Studien stellten fest, dass die Glomeruli in gereinigten Nieren markiert werden konnten, wenn Blutgefäße in den Nieren markiert waren 13,25,26,28. Eine gründliche Erklärung für dieses Phänomen muss noch weiter untersucht werden, aber es lässt sich ableiten, dass eine gute Markierungsmethode für das Gefäßsystem auch die Glomeruli effektiv markiert. Basierend auf den experimentellen Ergebnissen empfehlen wir die intravaskuläre Injektion von FITC-Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht (z.B. 150 kDa). Da die Markierung jedoch von der Durchblutung abhängt, kann es sein, dass diese Methode die Glomeruli nicht kennzeichnet, wenn sie nicht durchblutet sind.
LSFM ermöglicht eine großflächige Gewebebeobachtung und eignet sich daher besser für den Nachweis ganzer Nierenglomeruli. Lichtblattmikroskope sind jedoch möglicherweise nicht in jedem Labor verfügbar. Daher bieten wir eine alternative Reihe von Protokollen mit gewöhnlichen konfokalen Mikroskopen an. Obwohl die Niere in mehrere Abschnitte geschnitten werden muss, ist es möglich, Daten wie die Anzahl und das Volumen der Glomeruli in der gesamten Niere zu erhalten. Außerdem liefert die konfokale Mikroskopie ein kleineres Datenvolumen, was für die Datenverarbeitung freundlicher ist.
Imaris bietet eine direkte Datenausgabe. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass das analoge Signal genau mit dem Original übereinstimmt. Darüber hinaus kann die Verarbeitung großer Dateien durch die Software lange dauern, was frustrierend sein kann. Solange die Glomeruli eindeutig beschriftet und visualisiert werden können, gibt es mehr als eine einzigartige Lösung für die Datenanalyse. Forscher aus verschiedenen Laboren konnten mit ihrer eigenen vertrauten Software und Programmiersprache arbeiten.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82204951) und des Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
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