Summary
Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Abstract
Glomerüller böbrekteki temel birimlerdir; Bu nedenle, glomerülleri incelemek, böbrek fonksiyonunu ve patolojisini anlamak için çok önemlidir. Biyolojik görüntüleme sezgisel bilgi sağlar; Bu nedenle, glomerülleri etiketlemek ve gözlemlemek büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılmakta olan glomerül gözlem yöntemleri karmaşık işlemler gerektirir ve sonuçlar etiket ayrıntılarını veya üç boyutlu (3D) bilgileri kaybedebilir. Net, engelsiz beyin görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz (CUBIC) doku temizleme teknolojisi, böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha doğru tespit ve daha derin tespit derinliği sağlar. Fare glomerüllerinin, orta moleküler ağırlıklı FITC-Dekstran'ın kuyruk damarı enjeksiyonu ve ardından CUBIC temizleme yöntemi ile hızlı ve etkili bir şekilde etiketlenebileceğini bulduk. Temizlenen fare böbreği, tüm böbrekteki tüm glomerüllerin üç boyutlu görüntü yığınlarını elde etmek için bir ışık tabakası mikroskobu (veya dilimlendiğinde konfokal bir mikroskop) ile taranabilir. Uygun yazılımla işlenen glomerül sinyalleri, glomerüllerin sayısını, hacmini ve frekansını ölçmek için kolayca sayısallaştırılabilir ve daha fazla analiz edilebilir.
Introduction
Glomerüllerin sayısı ve hacmi çeşitli böbrek hastalıklarının tanı ve tedavisi için çok önemlidir 1,2,3,4,5. Glomerül sayısı tahmininin altın standardı, fiziksel disektör/fraksiyonatör kombinasyonudur. Bununla birlikte, bu yöntem özel reaktifler ve ekipman gerektirir, bu da onu yavaş ve pahalı hale getirir 6,7,8,9. Biyopsi zengin bir bilgi sağlar, ancak açıkçası, bu yöntem yalnızca kaba tahminler için uygundur10,11. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI), bilgisayarlı tomografi (BT) ve X-ışını dahil olmak üzere tıbbi görüntüleme teknolojileri de glomerüler algılamada yaygın olarak kullanılmaktadır 12,13,14,15, ancak bu tür teknolojiler hantal aletler gerektirir. Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometresi16 veya kalın ve ince kesit yöntemi17 gibi yeni yöntemler de glomerüler tespitte kullanılmıştır, ancak bunlar sıkıcı ve zahmetli olmaya devam etmektedir.
Şeffaflık teknolojilerinin yardımıyla, daha derin derinlikleri gözlemlemek ve kalın dokulardan ve hatta tüm organlardan daha zengin ve daha eksiksiz bilgi elde etmek mümkündür 18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, şeffaflık teknolojileri böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır24. Temizlenen böbreklerde glomerüllerin gözlemlenmesi ve tespiti de söz konusudur. Bununla birlikte, yayınlanan bu makaleler ya sadece kısaca glomerüler tespit25'e atıfta bulundu ya da glomerülleri etiketlemek için transgenik hayvanlar26, kendi kendine üretilen boyalar13 veya yüksek konsantrasyonlu antikor inkübasyonu27 gibi elde edilmesi zor etiketleme yöntemlerini kullandı. Ek olarak, çalışmalar temizlenmiş böbreklerdeki glomerülleri analiz etmiş olsa da, analizler her zaman sınırlıydı13 veya yazarların kendileri tarafından oluşturulan analiz algoritmalarınadayanıyordu 26.
Daha önce farelerin böbreklerinde glomerülleri etiketlemenin daha uygun bir yolunu göstermiştik28. Imaris'i kullanarak, glomerül sayısının, frekansının ve hacminin hızlı bir şekilde elde edilebileceğini bulduk. Bu nedenle, burada fare böbreklerinin glomerüllerini etiketlemek ve analiz etmek için daha erişilebilir, kapsamlı ve basitleştirilmiş bir dizi yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada yetişkin C57BL/6 fareler (6 haftalık, 25-30 g) kullanıldı. Tüm prosedürler, hayvan refahı ve deneysel etiğin yerel düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma, Sichuan Üniversitesi Biyomedikal Araştırma Etik Kurulu Batı Çin Hastanesi tarafından onaylandı.
1. Glomerül etiketleme ve doku hazırlama
- Glomerül etiketleme
- Çalışma probu çözeltisini hazırlamak için FITC-dekstran'ı (10 mg) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 1 (1 mg: 1 mL) oranında çözün.
NOT: Çalışma solüsyonu 4 °C'de 1 ay saklanabilir. - C57 fareyi bir fare kuyruğu damar sabitleyicisine yerleştirin. Gazlı bezi sıcak suyla ıslatın, gazlı bezi fare kuyruğunun orta kısmına sarın ve kuyruğu 1 dakika ısıtın.
- Sol ve sağ kuyruk damarları görünene kadar fare kuyruğunu %75 etanol ile silin.
- 1 mL'lik bir insülin şırıngası ile 100 μL çalışma probu çözeltisi çekin ve çözeltiyi yavaşça fare kuyruğu damarına enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, prob çözeltisinin 30 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Farelerin kafeslerinde serbestçe hareket etmelerine izin verin.
- Yeterli dolaşım sağlandıktan sonra, fareleri intraperitoneal sodyum pentobarbital (% 1, 60-80 μg / kg) enjeksiyonu ile derinlemesine uyuşturun.
- Çalışma probu çözeltisini hazırlamak için FITC-dekstran'ı (10 mg) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 1 (1 mg: 1 mL) oranında çözün.
- Böbrek örneklemesi ve fiksasyonu
- Anestezi uygulanmış fareleri sırtüstü pozisyonda anatomik plakaya sabitleyin. Pençelerini tıbbi bantla sabitleyin.
- Cilt hazırlığından sonra, fareleri öldürücü dozda sodyum pentobarbital (% 1, 10 mg / kg) ile ötenazi yapın.
- Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için orta hat karın kesisi yapın.
- Böbrekleri ortaya çıkarın ve çeker ocakta bir neşter ve makasla çıkarın. Böbrek zarfını nazikçe çıkarın.
- Böbrekleri toplayın ve gece boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
- Numuneleri PBS ile her biri 1 saat oda sıcaklığında (RT) çalkalanarak üç kez yıkayın.
- Böbreği mikroskopi için hazırlayın.
- Konfokal mikroskopi için böbreği dilimleyin: Dilim kalınlığını standartlaştırmak için beyin matrisini (1 mm çelik, 40-75 g) kullanarak böbreği 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri %4 PFA'ya aktarın ve sabitlemeye gece boyunca 4 °C'de devam edin.
- Işık tabakası mikroskobu için tüm böbrek: Böbrekleri 48 saat boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da sabitleyin.
2. Takas
- Reaktif hazırlama
- %10 (ağırlıkça/ağırlıkça) N-butildietanolamin, %10 (ağırlıkça/ağırlıkça) Triton X-100 ve %80ddH2O'yukarıştırarak CUBIC-L reaktifi hazırlayın.
- %45 (ağırlıkça/ağırlıkça) antipirin, %30 (ağırlıkça/ağırlıkça) nikotinamid, %0.5 (hacim/hacim) N-butildietanolamin ve %24.5 ddH2O'yu karıştırarak CUBIC-R reaktifihazırlayın. Çözeltinin pH'ının 9.6-9.8 ve kırılma indisinin (RI) 1.522 olduğundan emin olun.
NOT: CUBIC-L, delipidasyon için kullanılır ve CUBIC-R, kırılma indisi eşleştirmesi için kullanılır.
- Takas prosedürü
- Böbrek örneklerini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve ardından 37 ° C'de 60 rpm'de çalkalayarak CUBIC-L'de temizleyin. Tatmin edici optik şeffaflık elde edene kadar CUBIC-L'yi her 4 saatte bir (böbrek dilimleri için) veya her 24 saatte bir (tüm böbrek için) değiştirin.
NOT: Bu işlem böbrek dilimleri için 1 gün, bütün bir böbrek için 5 gün sürer. - Numuneleri PBS'de her biri 1 saat boyunca RT'de hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın.
- CUBIC-R'yi numunelere uygulayın, numuneleri 37 °C'de, 60 rpm'de 6 saat çalkalayın.
- Temizlenmiş numuneleri doğrudan gözlemleyin veya 1 hafta boyunca RT'de CUBIC-R ile doldurulmuş siyah tüplerde saklayın.
- Böbrek örneklerini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve ardından 37 ° C'de 60 rpm'de çalkalayarak CUBIC-L'de temizleyin. Tatmin edici optik şeffaflık elde edene kadar CUBIC-L'yi her 4 saatte bir (böbrek dilimleri için) veya her 24 saatte bir (tüm böbrek için) değiştirin.
3. Görüntü edinme
- Konfokal görüntüleme
NOT: Dilimlenmiş böbrek örneklerini konfokal mikroskopi ile görüntüleyin (Lensler: A Plan Apo λ 4×/0.2 N1 objektif veya Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 objektif). Z-stacks ile büyük görüntüler (örneğin, böbrek dilimi için 6052 μm x 6052 μm) yakalayın.- Konfokal mikroskobu aşağıdaki sırayla açın: lazer gücü, konfokal kontrol anahtarı, bilgisayar, mikroskop ve konfokal donanım. Kendi kendine testi çalıştırdıktan sonra, konfokal yazılımı açın.
- Uygun lensi seçin. Numuneyi CUBIC-R reaktifinden çıkarın, konfokal kaba yerleştirin ve CUBIC-R reaktifinin kurumasını önlemek için üzerini kapatın.
- Örneği görüş alanının ortasına taşıyın ve odak düzlemini odakta olana kadar ayarlayın.
- 3B rekonstrüksiyon (adım 3.1.4.1) ve büyük görüntü rekonstrüksiyonu (adım 3.1.4.2-3.1.4.3) uygulayın.
- 3D rekonstrüksiyon (konfokal): Floresan görünmeyene kadar yakınlaştırma düzlemini bir yönde değiştirin; Bu konum üst olarak tanımlanır. Ardından, hiçbir floresan görünmeyene kadar yakınlaştırma düzlemini ters yönde değiştirin; Bu pozisyon dip olarak tanımlanır. Taramayı başlatmak için iletişim kutusunun sağ alt köşesindeki Çalıştır düğmesini tıklatın.
- Büyük görüntü yeniden yapılandırması (konfokal): Görüş alanını örneğin ortasına taşıyın ve geçerli konumu merkez olarak ayarlayın. 2 x 2 görüş alanı seçin.
- ND çok işlevli arabirimde, büyük görüntüleri yeniden oluşturmak ve panelde farklı seçenekler ayarlamak için Z yığınını seçin. Ardından taramayı başlatmak için Butto n çalıştır düğmesine basın.
- Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) görüntüleme
NOT: Tüm böbrekleri bir ışık tabakası floresan mikroskobu ile görüntüleyin (Lens: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Orta n = 1.529) objektif).- Numune ekleme (LSFM):
- Şeffaf böbreği numune sabitleme adaptörüne yapıştırın ve böbrek sıkıca takılana kadar bekleyin.
- Böbreği numune kutusuna batırın ve numune kutusunu mikroskop sistemine itin. Kapağı kapatın.
- Gözlemle ve tarayın (LSFM):
- Locate arayüzünde, örneği uygun bir gözlem konumuna taşıyın. Toplama arayüzüne geçin, optik yolu ayarlayın, 488 nm lazer, LBF 405/488/561/640, optik bölme filtre bloğu SBS LP 490'ı seçin, Kamera 2'yi seçin ve sözde rengi yeşil olarak değiştirin.
- Kanal alt menüsünde daha önce kaydedilen Sol/Sağ Z Ofset değerini girin. En küçük yakınlaştırmayı (0,36) seçin ve maksimum netlik için ince ayar yapın.
- Tüm organın X\Y sınırını ve Z aralığını bulun. Lazer yoğunluğunu ve pozlama süresini ayarlayın (tercihen 10 ms'den az) ve başlamak için Çalıştır'a tıklayın.
- Doku çok büyükse, iki veya daha fazla görüntüyü görüntü dikişi ile birleştirin. Yakalanan dosyayı mikroskopi yazılımını kullanarak açın (burada, ZEISS ZEN 3.7). Görüntü birleştirmeyi tamamlamak için Stitching > Yöntem Parametresi İşleme > Yöntemi > Yöntemi > Uygula'yı seçin.
- Numune ekleme (LSFM):
4. Veri işleme ve nicelleştirme
NOT: Glomerülleri etiketlemek ve analiz gerçekleştirmek için Yüzey işlevini kullanarak görüntü yığınlarını Imaris (görüntü analizi) yazılımıyla işleyin.
- Glomerül sayısı
- Büyük görüntüleri (konfokal mikroskopi) veya dikişli görüntüleri (ışık tabakası mikroskobu) görüntü analiz yazılımına aktarın.
- Dosyaları görüntü analizi yazılımında açın. Yeni bir Yüzey oluşturmak için Yüzey düğmesine tıklayın. Ekranın sol alt kısmındaki kılavuzu izleyin.
- Hiçbir şeyi işaretlemeden İleri düğmesine (sağ ok düğmesi) tıklayın.
- Pürüzsüz seçeneğinin önündeki kutuyu işaretleyin ve Yüzeyin ayrıntısını kontrol etmek için uygun bir sayı (örneğin, 14.5) girin. Thresholding'de Arka Plan Çıkarma'yı seçin ve kutuyu glomerüllerin yaklaşık ortalama çapıyla doldurun. İleri düğmesine tıklayın.
- Gerekirse ayarlayın ve İleri düğmesine tıklayın. Uygun aralığı seçin ve Sonraki Bir Yüzey oluşturmak için düğmesine basın.
- Tıkla filtre ve ardından Ekle Küresel olmayan nesneleri filtrelemek için Küresellik eklemek için düğmesine basın. Bu yeni yüzeyi kopyalamak için Çoğalt düğmesine tıklayın.
- İstatistikler düğmesini ve ardından Genel düğmesini tıklayın; yazılım, glomerül sayısını Toplam Yüzey Sayısı olarak sunacaktır.
- Glomerül hacmi
- Yukarıdaki gibi glomerüllerin bir yüzeyini oluşturun.
- Yüzey tamamlandığında, hedef nesneleri seçmek ve her nesnenin hacmini sunmak için Seçim düğmesine tıklayın. Kaydet düğmesini tıklayın ve daha fazla analiz için istatistikleri bir e-tabloya aktarın.
- Dilimin veya tüm böbreğin hacmi
- Büyük görüntüleri (konfokal mikroskopi) veya dikişli görüntüleri (ışık tabakası mikroskobu) görüntü analiz yazılımına aktarın.
- Dosyaları görüntü analizi yazılımında açın. Yeni bir Yüzey oluşturmak için Yüzey düğmesine tıklayın. Ekranın sol alt kısmındaki kılavuzu izleyin.
- Tıklamadan İleri düğmesine (sağ ok düğmesi) tıklayın.
- Pürüzsüz seçeneğinin önündeki kutuyu işaretleyin ve Yüzeyin ayrıntısını kontrol etmek için uygun bir sayı (örneğin 50) girin. Thresholding'de Absolute Intensity (Mutlak Yoğunluk) seçeneğini belirleyin. İleri düğmesine tıklayın.
- Yüzeyi tüm dokuyu kaplayana kadar ayarlayın ve Sonraki düğmesine basın. Yüzeyi oluşturmak için İleri düğmesine tıklayın.
- Tıkla Seçim Tüm dokunun Yüzeyini seçmek ve dokunun hacmini sunmak için düğmesine basın. İstatistikleri bir e-tabloya aktarmak için Kaydet düğmesini tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, fare böbreklerindeki glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
Glomerüller (kan damarları) intravasküler olarak enjekte edilen FITC-Dekstran ile iyi bir şekilde etiketlenebilir. Temizleme işleminden sonra böbrek saydam hale geldi (Şekil 1A) ve glomerüller ışık tabakası mikroskobu (Şekil 1B) veya konfokal mikroskopi (Şekil 1C) kullanılarak net bir şekilde gözlenebildi. Konfokal mikroskopi sınırlı bir tarama derinliğine sahiptir, bu nedenle böbrekler yaklaşık 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesilmelidir. Işık tabakası mikroskobu kullanılırsa, tüm böbrek doğrudan taranabilir.
Net sinyallerle, glomerüllerin sayısını saymak kolaydı. Aslında, etiketleme o kadar etkiliydi ki, glomerüller çıplak gözle sayılabilirdi. Glomerüllerin hacmi de doğrudan ölçülebilir. Tabi Imaris gibi yazılımlar bu süreci büyük ölçüde hızlandırdı. Yüzey fonksiyonu kullanılarak, bir böbrek dilimindeki (Şekil 2), tüm böbrekteki (Şekil 3) veya bir şeritteki (Şekil 4) tüm glomerüller seçilebilir ve glomerüllerin sayısı ve hacmi doğrudan elde edilebilir (Şekil 2C, Şekil 3C, Şekil 4C). Seçilen bölgenin hacmi de ölçülebilir (Şekil 2B, Şekil 3B, Şekil 4B), böylece belirli bir bölgedeki veya tüm böbrekteki glomerül hacim oranı ve frekansı hesaplanabilir (Şekil 2D, Şekil 3D, Şekil 4D). Belirli bölgelerde hesaplamalar yapmak için böbreğin bir alanı seçilebilir. Biyopsiye benzer bir şerit sunduk. Şeritteki glomerüllerin sayısı, hacmi ve frekansı da kolayca elde edilebilir (Şekil 4).
Şekillerde gösterildiği gibi, bu çalışmada sunulan sonuçlar şunlardır (N = sayı, F = frekans, V = hacim, V(a) = ortalama hacim, V(t) = toplam hacim):
Dilimde N glomerül = 1128,Tüm böbrekte N glomerül = 14006,Dilimde F glomerül = mm'de 653,tüm böbrekte F glomerüler = mm'de 1053, Vdilimde toplam glomerül/Vdilim = %2.24,V tüm böbrekte total glomerül/Vböbrek = %5.54, dilimde V(a)glomerül = 373654 μm3, Tüm böbrekte V(a)glomerül = 521627 μm3, Dilimde V(t)glomerül = 421481724μm3, tüm böbrekte V(t)glomerül = 7305386256μm3 (Şekil 2D, Şekil 3D).
Şeritte N glomerül = 63,şeritte F glomerül = mm3 başına 72, şeritte V toplam glomerül/Vşerit = %2.23, şeritte V(a)glomerül = 307698μm3, şeritte V(t)glomerül = 19384977 μm3 (Şekil 4D).
Şekil 1: Böbrek dokusu saydamlığı ve FITC-dekstran etiketli glomerüller. (A) Saydamlık tedavisinden önce ve sonra böbrek. (B) LSFM ile taranan tüm böbreğin görüntüsü. (C) Konfokal mikroskopla taranan bir böbrek diliminin görüntüsü (sol: 4x, sağ: 10x). ölçek çubuğu = 300 μm (4x, konfokal); ölçek çubuğu = 100 μm (10x, konfokal).; ölçek çubuğu = 700 μm (5x, yakınlaştırma 0,36, LSFM). Glomerüller FITC-Dekstran ile etiketlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İşlev Konfokal taranan böbrek dilimine uygulanan yüzey. (A) Dilimin yüzeyi ve tüm glomerüller oluşturulur. Pembe = glomerüller, mavi = böbrek diliminin yüzeyi, yeşil = damarların orijinal etiketi (glomerüller ve bazı büyük damarlar). Ölçek çubuğu = 300 μm. (B) Dilimin Yüzeyi (solda) veya glomerüller (sağda) seçildiğinde (seçilen nesneler sarıya döner), veriler doğrudan elde edilebilir (verileri gösterdiği noktalı kutu vurgulanır). (C) Her bir glomerulusun sayısı, hacmi ve toplam glomerüllerin hacmi, dilimin hacminin yanı sıra doğrudan elde edilebilir. (D) Dışa aktarılan veriler daha fazla analiz edilebilir, böylece glomerüllerin ortalama hacmi ve glomerüllerin hacim oranı ve seçilen alan gibi hesaplamalar yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LSFM'ye uygulanan yüzey fonksiyonu tüm böbreği taradı. (A) Tüm böbreğin yüzeyi ve tüm glomerüller oluşturulur. Pembe = glomerüller, mavi = tüm böbreğin yüzeyi, yeşil = damarların orijinal etiketi (glomerüller ve bazı büyük damarlar). Ölçek çubuğu = 1000 μm. (B) Böbreğin Yüzeyi (solda) veya glomerüller (sağda) seçildiğinde (seçilen nesneler sarıya döner), veriler doğrudan elde edilebilir (verileri gösterdiği noktalı kutu vurgulanır). (C) Her bir glomerulusun sayısı, hacmi ve glomerüllerin sayısı ve böbreğin hacmi doğrudan elde edilebilir. (D) Dışa aktarılan veriler daha fazla analiz edilebilir, böylece ortalama glomerül hacmi ve glomerüllerin ve tüm böbreğin hacim oranı gibi hesaplamalar yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Seçilen böbrek şeridine uygulanan yüzey işlevi. (A) Şeridin yüzeyi ve tüm glomerüller oluşturulur. Pembe = glomerüller, mavi = böbrek şeridinin yüzeyi, yeşil = damarların orijinal etiketi (glomerüller ve bazı büyük damarlar). Ölçek çubuğu =150 μm. (B) Şeridin Yüzeyi (solda) veya glomerüller (sağda) seçildiğinde (seçilen nesneler sarıya döner), veriler doğrudan elde edilebilir (verileri görüntülediği noktalı kutu vurgular). (C) Her bir glomerulusun sayısı, hacmi ve toplam glomerüllerin hacmi, şeridin hacminin yanı sıra doğrudan elde edilebilir. (D) Dışa aktarılan veriler daha fazla analiz edilebilir, böylece glomerüllerin ortalama hacmi ve glomerüllerin hacim oranı ve seçilen alan gibi hesaplamalar yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku temizleme teknolojileri 3 veya 4 grupta sınıflandırılabilir 29,30,31. Organik çözücü bazlı doku temizleme (örneğin, DISCO ve PEGASOS), su bazlı doku temizleme (örneğin, CUBIC) ve hidrojel gömme doku temizleme (örneğin, CLARITY) böbrek temizlemede uygulanmıştır 25,26,28,32. CUBIC, gösterdiğimiz gibi, glomerüller (damarlar) FITC-Dekstran ile etiketlendiğinde en iyi sonucu verir. Ek olarak, CUBIC nispeten daha uygun bir çalışma sürecine sahiptir ve işlenen numunelerin organik reaktiflere33 batırılması gerekmediğinden, sıradan mikroskobik lenslerden27 fazlasını gerektirmez. Bununla birlikte, farklı takas yöntemleri ve kap etiketleme yöntemlerinin kendi avantajları ve dezavantajları vardır; Araştırmacıların özel ihtiyaçlarını karşılamak için farklı yaklaşımlar denemeleri gerekebilir.
Önceki çalışmalar, böbreklerdeki kan damarları 13,25,26,28 olarak etiketlendiğinde, glomerüllerin temizlenmiş böbreklerde etiketlenebileceğini fark etti. Bu fenomen için kapsamlı bir açıklamanın hala daha fazla araştırılması gerekmektedir, ancak vasküler sistem için iyi bir etiketleme yönteminin glomerülleri de etkili bir şekilde etiketlediği sonucuna varılabilir. Deneysel sonuçlara dayanarak, orta moleküler ağırlıklı (150 kDa gibi) FITC-Dekstran'ın intravasküler enjeksiyonunu öneriyoruz. Bununla birlikte, etiketleme kan dolaşımına dayandığından, bu yöntem dolaşım olmadığında glomerülleri etiketlemede başarısız olabilir.
LSFM, büyük ölçekli doku gözlemine izin vererek, tüm böbrek glomerüllerinin tespiti için daha uygun hale getirir. Bununla birlikte, ışık tabaka mikroskopları her laboratuvarda bulunmayabilir. Bu nedenle, sıradan konfokal mikroskoplar kullanarak alternatif bir protokol seti sunuyoruz. Böbreğin birden fazla bölüme ayrılması gerekmesine rağmen, tüm böbrekteki glomerüllerin sayısı ve hacmi gibi verileri elde etmek mümkündür. Ayrıca, konfokal mikroskopi, daha fazla veri işleme dostu olan daha küçük hacimli veriler sağlar.
Imaris doğrudan veri çıkışı sağlar. Ancak, analog sinyalin orijinaliyle yakından eşleşmesine özen gösterilmelidir. Ek olarak, yazılımın büyük dosyaları işlemesi uzun zaman alabilir ve bu da sinir bozucu olabilir. Glomerüller net bir şekilde etiketlenebildiği ve görselleştirilebildiği sürece, veri analizi için birden fazla benzersiz çözüm vardır. Farklı laboratuvarlardan araştırmacılar kendi tanıdık yazılım ve programlama dilleriyle çalışabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82204951) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2020JDRC0102) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V.
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
