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Biology

遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備

Published: February 13, 2008 doi: 10.3791/675
Automatic Translation
1, 1
1Center for Neuroscience, University of California, Davis

Summary

我々は、DNAコートした金の弾丸の製造方法を説明し、biolistically培養海馬スライスの神経細胞をトランスフェクトするためにそのような弾丸の使用方法を示しています。

Abstract

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆粒子と組織を照射して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。我々はDNAコーティングされた弾丸の初期準備から遺伝子銃を用いて器官切片培養の最後の撮影に、ラット海馬スライスの微粒子銃トランスフェクションのための詳細なプロトコルを提供しています。遺伝子銃のトランスフェクションは、神経細胞をトランスフェクトの効率的かつ容易な手段であると蛍光組織切片中の細胞の小さなサブセットを標識するために特に便利です。このビデオでは、まず、DNAで被覆金粒子に必要なステップを概説。我々は、次のゴールド/ DNA銃弾のプラスチックチューブの内側を並べる方法を示し、および遺伝子銃にロードするためのプラスチック製のカートリッジを取得するために、このチューブをカットする方法。最後に、我々は、遺伝子銃をヘリオス、そして健康的で最適にトランスフェクトされた組織切片を得るためにトラブルシューティングのアドバイスを提供するバイオラッドの処理を示す、ラット海馬スライス培養のバイオリスティックトランスフェクションを実行します。

Protocol

微粒子銃トランスフェクション用プロトコール

弾丸を作る

弾丸は最大6ヶ月間の良いですが、2〜3ヶ月後にトランスフェクション効率に減少し始める可能性があります。弾丸は、乾燥剤のペレットの存在下で4℃で保存してください。常にバイアルを開く前に室温に暖かい弾丸が格納されるシンチレーションバイアルを、、てみましょう。

始める前には用意しておいてください。

  • スペルミジン（0.05M）
  • のCaCl 2（1M）
  • エタノール（100％ - ハイグレード - 未開封ボトル）
  • オートクレーブH 2 0
  • トランスフェクトされるDNA
  • ポリビニルピロリドン（PVP - 20 mg / mlストック）
  • 2 X 15 mlコニカル（2/bulletセット）
  • チューブ（X〜30インチ/弾丸セット1にカット）
  • シンチレーションバイアル（1/bulletセット）
  • 乾燥ペレット
  • 10ミリリットル注射器のw /エンドでのチューブ

チューブを準備します。

  1. ドライ〜20分の最小のチューブステーションW / N 2ガ ​​スの配管の30インチ（右O -リングを越えて延長約2インチ）（0.4気圧）。

金のビーズにDNAを沈殿させる。

  1. マイクロ遠心チューブに50μmL総容積（最大50μgのトータルDNA）にトランスフェクトされるDNAを準備する
  2. 金の6-8 mgを秤量し、マイクロ遠心チューブに移す
  3. 金に0.05Mスペルミジンの100μLを加え20秒間超音波処理
  4. ゴールド/スペルミジンするDNAの50μLを追加
  5. 渦（設定値の約5）W /キャップ開放
  6. 1M CaCl 2の賢明な100μLをドロップ追加
  7. 短時間（<5秒）を超音波で分解する
  8. 室温で10分間沈殿することができます
  9. 簡単に超音波処理

超音波処理中にPVP溶液を調製します：

  1. 弾丸のセットごとに15 mlコニカル、3.5mL希釈PVPのPVP溶液を希釈してください（3.5ミリリットル100パーセントエタノールに20mg/ml PVPの株式の7.5μLを加える）

EtOHで金のビーズをすすぎ。

  1. 微量遠心機で10秒間フルスピードでの金のビーズをスピンダウン
  2. 上清を捨てますが、金のビーズの上に少量の液体を保持
  3. 必要に応じて1ミリリットルEtOHで3X洗って、、簡単にそれぞれの時間を超音波で分解する

PVP溶液に再懸濁し、ゴールド/ DNA：

  1. 3.5ミリリットル希釈PVP / EtOH溶液200μLで金メダルペレットを再懸濁します
  2. 渦懸濁するために金ペレット（必要に応じて簡単に超音波処理）
  3. 新しい15 mLコニカルにゴールド/ PVP溶液200μLを転送する
  4. すべての金を15 mLコニカルに転送されるまで一度PVP 200μLを加え、この方法で継続し、そして最終容量が3.2 mLである

コー​​ティングチューブ：

  1. チューブの駅でN 2の電源を切り、乾燥させたチューブを取り外す
  2. 10mlの注射器に乾燥チューブを取り付けます
  3. 精力的に金/ PVPで満たされた15 mLコニカルを振る
  4. ゴールド/ PVP溶液中でチューブの端を置き、気泡に注意しながらゆっくりと吸い上げる
  5. チューブの両端から〜2インチドライ残す
  6. チューブはまだ注射器に接続されていると、金/ PVP溶液で満たされた、慎重にステーションに戻ってチューブを配置すると
  7. 解決策は、座っているチューブの端面をマーク
  8. 金が接続されている注射器で5分間解決しましょう
  9. 決済金が取り残されるように、シリンジを引いて、非常にゆっくりとソリューションを吸い取る（ウォッシュをバックアップしないことを確認してください）
  10. シリンジを外します
  11. 90 °回転させて、2秒放置
  12. 180 °回転させて、別の2秒を座らせて
  13. 5秒間チューブを回転させる
  14. バルブが0.4の間に読むようにN 2をオンに- 0.5〜5分間乾燥しながら、金でコーティングされたチューブをスピン。

チューブを切断。

  1. チューブの準備 - 駅からチューブを取り出して、マークに端をカット。
  2. カットカートリッジをキャッチするチューブチョッパーで標識されたシンチレーションバイアルに入れ
  3. チューブチョッパーにチューブを配置し、清潔なカミソリでチューブをカット
  4. シンチレーションバイアルに乾燥ペレットを配置
  5. 4℃店舗カートリッジ° C

組織切片を撮影する

培養スライスを撮影するとき、それは汚染を避けるために比較的無菌テクニックを採用することが重要です。二つの異なる構造を撮影する場合、弾丸の両方のセットが同じカートリッジホルダーにロードすることができますが、バレルライナーと画面が構成要素との間で変更することを、覚えておいてください。

始める前には用意しておいてください。

  • DNAの弾丸（開く前に室温にシンチレーションバイアルを暖かくさせる）
  • 組織切片
  • 遺伝子銃をヘリオス
  • 接続されている遺伝子銃のホースとヘリウムタンク</ LI>
  • カートリッジのホルダー
  • 代わりにプラスチック製のO -リング付きバレルライナー
  • ディフューザー（変更）
  • ディフューザーの画面
  • 鉗子

遺伝子銃を準備中。

  1. 使用して鉗子は、カートリッジホルダーにゴールドコーティングプラスチック製のカートリッジを置きます。
  2. 最初のバックロックを押すことにより、遺伝子銃にカートリッジホルダーを配置
  3. ロックとカートリッジホルダーを固定します
  4. O -リングと場所でしっかりとディフューザーの画面でバレルライナーを取得する
  5. 遺伝子銃にバレルライナーをねじ込む

遺伝子銃で培養スライスを撃つ：

  1. 耳のマフを装着
  2. ホース接続されているヘリウムガスのタンクへの遺伝子銃を差し込みます
  3. 180 PSIにタンクに圧力を上げる
  4. ディフューザーの画面からほこりやごみを除去するために空気中に空白を撃つ。銃を発射するには、最初のトリガを引くし、銃のビープ音がするまで、安全インターロックボタンを押し下げる。
  5. 空白を撮影した後、インキュベーターからスライスを削除する
  6. 第一構築するために銃を進める
  7. 約0.5ディフューザーの画面で撮影する - スライスから1インチ
  8. ウェル間のカートリッジを進める。
  9. 最後の井戸を撮影した後、インキュベーターに戻してスライスを配置
  10. ヘリウムホースからガンを取り外す前に、ガスと放出圧力をオフにする
  11. ネジを外しバレルライナー、およびカートリッジを取り外し、使用するシェル

カートリッジホルダーとバレルライナーのクリーニング：

  1. 場所カートリッジ、バレルライナー、及び石鹸水でビーカーのディフューザーの画面
  2. 20分間バスの超音波処理や超音波処理の場所のビーカー
  3. すべての石鹸残基が除去されるまで、徹底的に水で洗い流してください
  4. 時間を70％エタノールに浸し
  5. 一晩乾燥させる乾燥したペーパータオルの上に置いて
  6. クリーンカートリッジ、バレルライナー、および画面は、その後のバイオリスティックトランスフェクションに再利用することができます

微粒子銃トランスフェクションのためのトラブルシューティングのヒント

微粒子銃トランスフェクションは、時々次善のトランスフェクションの条件になる可能性があります。それは少なすぎるか多すぎる細胞はトランスフェクション、高すぎるか低発現レベルにつながる可能性、または一般的には不健康になるために組織切片を引き起こす可能性があります。頻繁に不健康なスライスは、圧力の爆発に起因する。最適なトランスフェクションした組織切片を得るためのヒントです。

スライスが（またはあまりにも多くの細胞が/スライスをトランスフェクトしている場合）不健康なように表示される場合は、試してみてください。

  • 増加撮影距離
  • ガスのタンクで圧力の低下
  • 金の額を減少
  • Bio - Rad社のディフューザーの中央を切断し、ディフューザーの画面で中央に置き換える。

少なすぎるの細胞がトランスフェクトされている場合、試してみてください。

  • 撮影距離を減少させる
  • ガスのタンクで圧力の上昇
  • 金の額を増加
  • /ウェルの組織スライスの数を増加
  • バレルライナーのO -リングが完全であることを確認してください。

あなたが同じ撮影を確認中にトランスフェクトされた両方の数が多すぎると細胞数が少なすぎるとスライスを取得する場合：

  • あなたは対称的に、上記も銃を保持している
  • その金は、均等にコーティングチューブの内側です。 （あなたが金のラインを取得する場合、金が定着した後で速い速度でチューブから上清を引き出すと窒素の電源を入れる前に、金の長い回転させる。一方、あなたが金のストリーキングを取得している場合、 、この可能性が高い弾丸の生成時にあまりにも多くの水分への暴露によるものです：チューブは塗装前に完全に乾いていることを、あなたがエタノールの未開封の瓶を使用していることを確認し、）あなたがふたをキャッピングし、適時に弾丸を準備している。

トランスフェクション効率が最適と思われる場合は（＃細胞が/スライスをトランスフェクト）が、発現レベルが高すぎるまたは低すぎるようだ。

  • 金に比率のDNAを調整してください。 （それが低すぎる場合、例えば、金の量を維持するが、DNAの量を増やす 。）
  • 撮影とデータ収集間の時間の量を調整する

あなたの構成のいずれかの少なすぎる表現を取得する場合二重トランスフェクションの場合には、、適切な方法で2つの構成要素の比率を調整し、両方の構造が同じプロモーター下にあることを確認して、あのことを確認するようにプロモーターは、他の域外競合しません。

Discussion

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆した金粒子による生体組織の砲撃を経由して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。弾丸が核内に静止する時、粒子による遺伝子導入では、一般的なトランスフェクションされた細胞になる。多くの異なるトランスフェクション法が存在するが、そのようなマイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびウイルス性トランスフェクションとして、バイオリスティックトランスフェクションは簡単にこれらの他の方法を用いてトランスフェクトしていない細胞をトランスフェクトするための集中的な少ない労働力、および効率的な代替手段を提供することができます。細胞壁の存在は、既存の方法1を使用してトランスフェクションが困難になるので、実際には、まず、植物に遺伝子導入する技術として開発されました。有糸分裂後のニューロンは2,3をトランスフェクションが難しいことで知られていますので、同様に、biolisticsは神経生物学の分野で人気を博している。特に、それは広く無傷の脳スライス内の単一ニューロンの微細な形態を評価することを目的とした実験に使用される原理の手法として認識されます。方法は、遺伝子銃保有の手を（; Bio - Rad社ヘリオス遺伝子銃システム）を使用して培養脳スライスの微粒子銃トランスフェクションを実行する方法の詳細かつ包括的な説明を提供するここで説明する。

それは脳スライス中の細胞の疎な数のトランスフェクションを可能にするため微粒子銃トランスフェクションは、スライス培養で神経細胞をトランスフェクションするための好ましい方法となっています。この方法では、個々の神経細胞は単独で調べることができます。この技術は特によく脳スライスの神経細胞のトランスフェクションに適しているため、それはしばしば、2光子顕微鏡と組み合わせて使用されている、2光子励起以来、光散乱の組織4内の深い蛍光標識細胞の可視化を可能にします。確かにこの映像を通して紹介単錐体細胞の高倍率の画像は、カスタム構築された2光子レーザー走査顕微鏡を用いて捕獲された。結論微粒子銃トランスフェクションでは周囲の細胞の高密度のコンテキスト内で個々の細胞にトランスフェクションの効率的な手段であり、そのように蛍光神経スライス培養で個々のニューロンを標識するための非常に役立っています。

Acknowledgments

我々はこのビデオで紹介する全体海馬スライスの低倍率の画像を取得するとヘルプはマークルーカニックとHwai -ジョンチェンに感謝したいと思います。我々はまた、ビデオを伴うテキストと支援のためにサラパリッシュに感謝します。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1.6um gold particles (microcarrier) 0.25g Bio-Rad 1652264
1M CaCl2 Fluka 21115
100% EtOH 1pint Goldshield
Cartridge Tubing Bio-Rad 1652412
Scintillation vials 20ml, 500/case VWR international 66021-668
Dessication pellets ”Dricap” MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator model 50T VWR international
Cartridge holder pack of 5 Bio-Rad 1652426
Barrel liner pack of 5 Bio-Rad 1652417
Diffuser screen pack of 5 Bio-Rad 1652475
O-ring 75 Viton, Size 007, Qty, 100 McMaster-Carr
Screen (mesh) McMaster-Carr 144258
PVP 20mg/ml in EtOH Bio-Rad Comes with tubing from biorad
Tubing prep station Bio-Rad 1652418
Tubing cutter Bio-Rad 1652422
Helios Gene-Gun Bio-Rad 1652411
Gene gun hose Bio-Rad Comes with Gene-Gun
Spermidine 5g Sigma-Aldrich s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).

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References

  1. Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).
  2. Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).
  3. McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).
  4. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).

Tags

神経科学、問題12、biolistics、トランスフェクション、海馬スライス、器官、蛍光顕微鏡、ライブイメージング
遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備
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Woods, G., Zito, K. Preparation of… More

Woods, G., Zito, K. Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture. J. Vis. Exp. (12), e675, doi:10.3791/675 (2008).

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