حتى وقت قريب ، كانت مقتصرة على دراسات التعبير الكمي للدماغ الإنسان من الحمض النووي الريبي أو البروتينات. مع تقنيات مناعي لونين وصفها في هذه الورقة ، سوف يكون من الممكن مثلأيشن هيستون خريطة جينية والمنظمين الآخرين في التعبير الجيني في الدماغ بعد الوفاة.
Abstract
ويعتقد أن الأمراض العصبية المزمنة ، مثل انفصام الشخصية ومرض التوحد وثنائي القطب أن ينتج عن مزيج من العوامل الوراثية والبيئية التي قد تؤدي إلى تغيرات جينية في التعبير الجيني ، وعلم الأمراض الجزيئية الأخرى. تقليديا ، ومع ذلك ، اقتصرت الدراسات التعبير في الدماغ بعد الوفاة لتقدير حجم مرنا أو البروتين. القيود التي تصادف في أبحاث الدماغ بعد الوفاة مثل المتغيرات في وقت وانحلال ذاتي integrities الأنسجة ومن المرجح أيضا أن تؤثر أي دراسات العليا لونين هياكل النظام. ومع ذلك ، فإن منظمة nucleosomal من الحمض النووي DNA الجينومية بما في ذلك : هيستون الأساسية ملزمة — على ما يبدو الى حد كبير في الحفاظ على عينات ممثلة المقدمة من البنوك المختلفة في المخ. ولذلك ، فمن الممكن لدراسة نمط مثلأيشن التساهمية والتعديلات الأخرى في histones الأساسية في مواضع محددة في الدماغ الجينومية بعد الوفاة. هنا ، نقدم مبسطة الأصلي مناعي لونين (NChIP) بروتوكول لعينات الدماغ المجمدة (ثابت أبدا) الإنسان. يمكن إكمال عملية الهضم بدءا من الخليط nuclease micrococcal الدماغ ، تليها NChIP qPCR في غضون ثلاثة أيام. وينبغي للمنهجية المعروضة هنا يكون من المفيد توضيح آليات التعبير اللاجينية الجينات في دماغ الإنسان العادي ومريضة.
Protocol
الإجراء : 1 ش اليوم 1. التجانس 50-500 ملغ من الأنسجة المجمدة المسألة بعد الوفاة رمادي مع Douncing العازلة. ! تنبيه –! يجب التعامل مع الأنسجة البشرية تحت …
Discussion
الخطوط العريضة لبروتوكول هنا هو مفيدة بشكل خاص للمحققين مهتمة التواقيع مثلأيشن هيستون و / أو الحامض النووي من الدماغ البشري ، وذلك لأن هذه العلامات لونين قد تكون أقل عرضة للالتحف بعد الوفاة بالمقارنة مع أنواع أخرى من التعديلات ، بما في ذلك (هيستون) والفسفرة أستلة 1 2. الدماغ…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة العقلية (5R01MH071476).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Tris-HCl
EMD
9310
Magnesium Chloride Hexahydrate
OmniPur
5980
Calcium Chloride
Fisher Scientific
C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0
OmniPur
4055
Sodium Chloride
Mallinckrodt Chemicals
7581-06
SDS Solution 10% (w/v)
Bio-Rad
161-0416
Triton X-100
Fluka
93426
Igepal CA-630
Sigma
I-3021
Sodium Deoxycholate
Sigma
D6750-25G
Lithium Chloride
Sigma
L9650-100G
Sodium Bicarbonate
Sigma
S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)
Sigma
S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus
Sigma
N3755-200UN
Benzamidine
Fluka
12072
Phenylmethanesulfonylfluoride
Sigma
P7626-1G
3M DTT
Fluka
43815
Protein G Agarose, Fast Flow
Upstate
16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit
Stratagene
201190
Proteinase K from Engyodontium album
Sigma
P2308
Phenol:Chloroform 1:1
OmniPur
6810
Glycogen, From Mussels
Sigma
G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)
Pharmco-AAPER
111000200
Solutions:
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.